CN116121461A - 一种检测chv型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测chv型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用。本发明提供的引物对可以特异性扩增CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒，与CHⅠ型、CHⅡ型、CHⅢ型、CHⅣ型、CHⅥ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒，以及鸡传染性贫血症病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用本发明提供的引物对进行RT‑RAA荧光法检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒时，能够在30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高和假阳性率低的优势。

Description

一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)可引起一种急性、高度接触性呼吸道传染病，感染后以呼吸道症状、肾炎和生产性能下降为特征，形成所谓的“假母鸡”，给养鸡业造成了很大的经济损失。近几年，CH Ⅴ型IBV毒株分离率大约占我国IBV分离株总数的15％，成为了我国仅次于QX型的IBV第二大流行优势基因型。针对IBV的主要流行基因型，为防制鸡传染性支气管炎病毒建立特异性的检测方法显得尤为重要。
目前，针对CH Ⅴ型IBV的检测方法，包括常规PCR、实时荧光定量PCR和血清学，但以上3种检测方法均需要笨重或昂贵的仪器设备，检测时间长，对于检测人员的要求高，需进行专业培训，实际上仅能适于实验室的辅助诊断，无法推广应用。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用。采用本发明引物对进行CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的检测，具有检测方法简单、灵敏度高、不需要昂贵仪器设备、检测时间短和适于大规模推广应用的优势。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述技术方案所述引物对在制备检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物对。
优选的，所述试剂盒还包括探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；
所述阳性对照品包括含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；所述阴性对照品包括ddH2O。
本发明还提供了一种非诊断目的检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述技术方案所述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒阴性。
优选的，所述RT-RAA的反应程序为39℃60s；39℃30s，40个循环。
优选的，所述RT-RAA反应的体系为50μL，包括：RT-RAA反应干粉1管、聚乙二醇25μL、醋酸镁2.5μL、正向引物2μL、反向引物2μL、探针0.6μL、RNA模板5μL和余量ddH2O。
优选的，所述RT-RAA反应干粉包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix和氯化镁。
优选的，所述正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；所述探针的浓度为10μmol/L。
有益效果：
本发明提供了一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供的引物对可以特异性扩增CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒，与CH Ⅰ型、CH Ⅱ型、CH Ⅲ型、CH Ⅳ型、CH Ⅵ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒，以及鸡传染性贫血症病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。利用本发明提供的引物对进行RT-RAA荧光法检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒时，可以检测低拷贝的CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒核酸，能够在30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高和假阳性率低的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明引物对验证结果；泳道从左往右依次是Marker、CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒核酸和ddH2O阴性对照；
图2为本发明阳性对照品和阴性对照品的扩增结果；
图3为本发明RT-RAA引物探针组检测灵敏度结果；
图4为本发明RT-RAA引物探针组检测特异性结果；
图5为本发明对比例1设计的引物探针组检测特异性结果；荧光信号从上到下依次为：CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、传染性贫血症病毒、H9N2亚型禽流感病毒和、CH Ⅵ型鸡传染性支气管炎病毒。
具体实施方式
本发明提供了一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物；
所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5’-ATGCAGTAGTAAATGTTTCTTCACAACCTAAC-3’；
所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：5’-AGCCCACTGCATACCTTGACCTACAGG-3’。
本发明提供的引物对可以特异性扩增CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒，与CH Ⅰ型、CH Ⅱ型、CH Ⅲ型、CH Ⅳ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒，以及鸡传染性贫血症病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。
本发明还提供了上述技术方案所述引物对在制备检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物对。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括探针；所述探针的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.3所示，具体为：5’-ATTATTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATACCTATGACAG-3’；所述探针更优选包括在核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针基础上经修饰的探针；所述修饰优选包括：在所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的5’端第31位T碱基标记FAM荧光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃(Tetrahydrofuran，THF)，第33位T碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，修饰后的探针优选如下所示：5’-ATTATTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCC/i6FAMdT//dSpacer//iBHQ1dT/TCTATACCTATGACAG[C3-spacer]-3’，其中/i6FAMdT/是FAM荧光基团，/dSpacer/是重组酶的识别位点四氢呋喃，/iBHQ1dT/是淬灭基团，[C3-spacer]是生物阻断素。本发明修饰后的探针在游离状态下核酸外切酶不识别，当探针和目的基因识别后开始结合，核酸外切酶在识别到缺口后，切除THF并解除C3-spacer生物阻断素，从而使FAM基团和BHQ1基团分离发出荧光被仪器检测到，进而检测出扩增产物。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选包括含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核酸，具体为：5’-ATGCAGTAGTAAATGTTTCTTCACAACCTAACAATGCAGGTACAGCTTCAGAATGCACTGTTGGTATTATTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATACCTATGACAGCACCTGTAGGTCAAGGTATGCAGTGGGCT-3’；所述阴性对照品优选包括ddH2O。本发明为了避免所用试剂失效或受到污染，设置有阳性对照品及阴性对照品，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括RT-RAA荧光法通用试剂。本发明对所述RT-RAA荧光法通用试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售商品即可。本发明及实施例优选采用南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂。
本发明还提供了一种非诊断目的检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的方法，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用上述技术方案所述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阴性。
在本发明中，所述试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品的判断标准优选为：
阳性对照品：有典型的扩增曲线出现，或出峰时间≤20min或Ct值≤39，为有效结果；
阴性对照品：无扩增曲线出现，或出峰时间＞20min或Ct值＞39，为有效结果。
在本发明中，所述RT-RAA的反应程序优选为39℃60s；39℃30s，40个循环；所述RT-RAA反应的体系优选为50μL，优选包括：RT-RAA反应干粉1管、聚乙二醇25μL、醋酸镁2.5μL、正向引物2μL、反向引物2μL、探针0.6μL、RNA模板5μL和余量ddH2O；所述RT-RAA反应干粉优选包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix和氯化镁；所述正向引物和反向引物的浓度均优选为10μmol/L；所述探针的浓度优选为10μmol/L。本发明所述RT-RAA反应干粉、聚乙二醇和醋酸镁优选为南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RAA核酸扩增试剂中的组分。
本发明所述方法可以是以非诊断为目的，仅是为了获得待测样本是否含有CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的中间值。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
本发明设计的RT-RAA引物对的扩增片段的验证
以CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒核酸为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物进行PCR扩增，得到扩增产物；所述PCR扩增的反应体系为：正向引物1.0μL、反向引物1.0μL、ddH2O 6.0μL、2×Es TaqMasterMix 10.0μL和模板2μL；所述正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；PCR扩增的反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸2min。
将得到的扩增产物和阴性对照ddH2O进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。
由图1可知，采用本发明引物对扩增的片段与预期结果一致，大小为143bp。
实施例2
一种检测CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，该试剂盒由以下组分组成：RT-RAA反应干粉、核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的反向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的探针、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品；其中正向引物和反向引物及探针的摩尔配比为1:1:1；阳性对照品为含有CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒核酸(SEQ ID No.4所示)，阴性对照品为ddH2O。
RT-RAA反应干粉的组成成分为：重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix、氯化镁(MgCl2)；A液成分为：聚乙二醇(PEG)；B液成分为：醋酸镁(MgAc2)；所述RT-RAA反应干粉、A液和B液均为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RAA核酸扩增试剂中的组分。
实施例3
按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA，用于RT-RAA反应。
RT-RAA反应体系的配制：每个检测样品对应一个RT-RAA反应干粉管，每个RT-RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表1所示：
表1 RT-RAA反应体系配制表
RT-RAA反应体系组分 使用量
RT-RAA反应干粉 1管
A液 25μL
B液 2.5μL
正向引物(SEQ ID NO.1)(浓度为10μmol/L) 2μL
反向引物(SEQ ID NO.2)(浓度为10μmol/L) 2μL
探针(浓度为10μmol/L) 0.6μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 12.9μL
RNA模板 5μL
总体积 50μL
注：表1中的探针为SEQ ID NO.3所示的序列进行修饰后的探针，具体如下：5’-ATTATTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCC/i6FAMdT//dSpacer//iBHQ1dT/TCTATACCTATGACAG[C3-spacer]-3’；其中/i6FAMdT/是FAM荧光基团，/dSpacer/是重组酶的识别位点四氢呋喃，/iBHQ1dT/是淬灭基团，[C3-spacer]是生物阻断素。
其中RT-RAA反应干粉、A液和B液均为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RAA核酸扩增试剂中的组分。
以SEQ ID NO.4所示的CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒为阳性对照，以ddH2O为阴性对照。
将配制好的RT-RAA反应体系的反应管上下颠倒6～8次，充分混匀反应液，800rpm离心10s使反应液全部离心至管底。将反应管放置于荧光定量仪中，39℃60s；39℃30s，40个循环，并收集荧光信号。
扩增结束后根据出峰时间或Ct值判定待检样本结果，判断标准如下：
(1)阳性对照：有扩增曲线出现，或出峰时间≤20min或Ct值≤39，为有效结果；
(2)阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞20min或Ct值＞39，为有效结果；
(3)检测样本：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，可判断待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，可判断待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阴性。
结果如图2所示。由图2可知，本发明的阳性对照品和阴性对照品均为有效结果，其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
实施例4
广东温氏食品集团有限公司提供44份疑似感染CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的组织样品。按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒(购自广州速研生物科技有限公司)的说明书步骤提取待测样本基因组RNA，用于荧光定量RT-qPCR检测和本发明RT-RAA法检测。
其中荧光定量RT-qPCR的引物序列如表2所示，定量RT-qPCR的反应体系为：2×OneStep U+Mix 10μL、One Step U+Enzyme Mix 1μL、RT-qPCR-F 0.4μL、RT-qPCR-R 0.4μL、RT-qPCR-P 0.2μL、RNase-free ddH2O 6μL和RNA 2μL，总反应体系为20μL；所述RT-qPCR-F、RT-qPCR-R和RT-qPCR-P的浓度均为10μmol/L；荧光定量RT-qPCR的判断标准为：Ct≤30为阳性，Ct>30为阴性。本发明RT-RAA法检测的具体步骤同实施例3。
表2 RT-qPCR检测引物序列及反应程序
引物或探针名称 序列5’—3’
RT-qPCR-F CGCTTATGCAGTAGTAAATGTTT CTTCAC(SEQ ID NO.5)
RT-qPCR-R CCACCGCATACCTTGACCTACA(SEQ ID NO.6)
RT-qPCR-P CATTAACAACTGTATCACCACT(SEQ ID NO.7)
反应程序 55℃15min；95℃30s；95℃10s,58℃30s，收集荧光信号，共40循环。
注：探针RT-qPCR-P的5’修饰FAM，3’修饰BQH1。
荧光定量RT-qPCR检测和本发明RT-RAA法的检测结果如表3和表4所示。
表3阳性结果的Ct值和出峰时间
组别 1 2 3 4
RT-RAA Ct值 4.41 6.47 6.98 34.13
RT-qPCR Ct值 17.57 16.43 16.22 -
表4临床样品检测结果
由表3和表4可知，本发明RT-RAA检测结果与RT-qPCR检测结果大致相同，表明本发明RT-RAA检测方法与RT-qPCR检测方法具有高度一致性。本发明具有良好的特异性和敏感性，而且本发明方法在5～20min内完成检测，具有操作简便、成本低、适合于现场移动检测的优势。
实施例5
将CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒质粒(GenBank登录号KT946798.1：20403-20734)进行10倍倍比稀释，以5个浓度梯度为模板，分别为104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL、101copies/μL和100copies/μL，并且以ddH2O为阴性对照，分别取5μL作为反应模板，按照实施例3所述步骤进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果如图3所示，本发明的引物对和探针能检测的最低浓度为101copies/μL以上的模板，检测灵敏度高。
实施例6
以CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒核酸为阳性对照(SEQ ID NO.4所示)，ddH2O为阴性对照，分别对CH Ⅰ型、CH Ⅱ型、CH Ⅲ型、CH Ⅳ型、CH Ⅵ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸进行检测，按照实施例3所述步骤进行RT-RAA核酸扩增。
检测结果如图4所示，CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。
结果表明，本发明的引物对和探针可以实现对CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的特异性检测，且与CH Ⅰ型、CH Ⅱ型、CH Ⅲ型、CH Ⅳ型、CH Ⅵ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸均无交叉反应。
对比例1
一种用于CH Ⅴ型传染性支气管炎病毒实时荧光RT-RAA检测的引物和探针；
所述引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示的反向引物组成；未修饰前的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；引物扩增得到的序列如SEQ ID NO.11所示；具体如下：
SEQ ID NO.8:5’-AACAATGCAGGTACAGCTTCAGAATGC-3’；
SEQ ID NO.9:5’-TGCAGTACAAAATTGTAACTTAGCCCAC-3’；
SEQ ID NO.11：5’-AACAATGCAGGTACAGCTTCAGAATGCACTGTTGGTATTATTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATAGCTATGACAGCACCTGTAGGTCAAGGTATGCAGTGGGCTAAGTTACAATTTTGTACTGCA-3’；
SEQ ID NO.10：5’-TAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATAGCTATGACAGCACCTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATAGCTATGACAGCACC-3’；
SEQ ID NO.10所述的探针经修饰后如下所示:5’-TAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTCTATAGCTATGACAGCACCTAGTGGTGATACAGTTGTTAATGCCTCTTC/i6FAMdT//idSpacer//iBHQ1dT/AGCTATGACAGCACC[C3-spacer]-3'；其中/i6FAMdT/是FAM荧光基团，/dSpacer/是重组酶的识别位点四氢呋喃，/iBHQ1dT/是淬灭基团，[C3-spacer]是生物阻断素。
对比应用例1
特异性验证
以SEQ ID NO.11所示的CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒核酸为阳性对照，ddH2O为阴性对照，分别对CH Ⅰ型、CH Ⅱ型、CH Ⅲ型、CH Ⅳ型、CH Ⅵ型和Mass型的鸡传染性支气管炎病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒、禽传染性喉气管炎病毒、马立克氏病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽网状内皮组织增生症病毒和H9N2亚型禽流感病毒的核酸进行检测，按照实施例3所述步骤进行RAA核酸扩增，区别在于：将正向引物替换为SEQ ID NO.8所示的正向引物，将反向引物替换为SEQ ID NO.9所示的反向引物，将探针替换为对比例1中修饰后的探针。
检测结果如图5所示，CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，禽白血病病毒、传染性贫血症病毒、H9N2亚型禽流感病毒和、CH Ⅵ型鸡传染性支气管炎病毒有荧光信号，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线，结果表明，对比例1设计的引物对和探针不能实现对CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒的特异性检测。
综上所述，本发明所提供的引物对及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒及辅助诊断是否为CH Ⅴ型鸡传染性支气管炎病毒感染，适宜于临床的鉴别检测、动物疫病检测和净化。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物；所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述引物对在制备检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；
所述阳性对照品包括含有核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的核酸；所述阴性对照品包括ddH2O。
6.一种非诊断目的检测CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测样本的RNA，以待测样本的RNA为模板，利用3～5任一项所述的试剂盒进行RT-RAA反应；
结果判定：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为CHⅤ型鸡传染性支气管炎病毒阴性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA的反应程序为39℃60s；39℃30s，40个循环。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA反应的体系为50μL，包括：RT-RAA反应干粉1管、聚乙二醇25μL、醋酸镁2.5μL、正向引物2μL、反向引物2μL、探针0.6μL、RNA模板5μL和余量ddH2O。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-RAA反应干粉包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTPMix和氯化镁。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物的浓度均为10μmol/L；所述探针的浓度为10μmol/L。
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