TWI711701B - 用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明為一種用於檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒分型之引子組及方法。該方法係藉由多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應，可同步進行禽流感病毒的檢測及演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型的分型，乃簡易、耗時短且具有高度專一性及靈敏度之同步檢測模式。
Description
本發明係關於一種用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組、以及一種檢測禽流感病毒及其演化分支病毒分型之方法，更具體而言，為同歨檢測禽流感病毒及演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒分型之引子組及方法。
禽流感係由A型流感病毒引起之高度傳染性疾病，其具有由血球凝集素(hemagglutinin，HA)及神經胺酸酶(neuraminidase，NA)兩種表面醣蛋白確定的多種亞型。迄今已發現18種已知的HA亞型及11種已知的NA亞型。除了衍生自蝙蝠的流感病毒H17及H18，所有禽流感病毒(Avian influenza virus)亞型皆存在於水禽身上，水禽為A型流感病毒之原始宿主。在台灣，自2015年起，高致病性禽流感病毒演化分支(clade) 2.3.4.4 H5 (新型病毒H5N2、H5N3及H5N8)的爆發而引起注意，AIV的爆發導致龐大的經濟損失，也對人類的健康造成威脅。根據行政院農委會動植物防疫檢疫局(BAPHIQ)之官方網站數據，這些新型H5病毒的HA基因與2014年從韓國鴨分離的H5N8病毒密切相關，其他基因與中國、日本及韓國分離的禽流感病毒接近。因此，這些新型H5病毒來自國外，而非由台灣當地的病毒所演變。
自1970年代以來，H6N1流感病毒經常發生於台灣的家禽。此種病毒已在地方流行，並在雞隻身上造成潛伏感染。近年在台灣出現了H6N1人類病例及犬隻H6N1自然感染病例，這些事件揭示了H6N1病毒在台灣的影響及廣泛性。2013年，中國首次報導了引起人類感染的H7N9病毒，其係由家鴨中之H7病毒與雞之H9N2病毒之間的多重種間傳播及重組所產生。這引起家禽養殖業者鄰近地區的高度關切，因為禽流感病毒極可能經由野生鳥類的遷徙而傳播。
重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)反應係用於DNA/RNA擴增的方法，其快速且專一性高。與PCR不同，其在等溫條件下進行，並在30分鐘內完成擴增子的產生。RPA產物可使用傳統的平板瓊脂糖凝膠電泳觀察，借助額外的檢測探針，可透過實時設備或側層流試紙進行檢測。
毛細管電泳法(capillary electrophoresis)係一種DNA分析系統，由於其自動化、高精確度、快速及易用性而被廣泛應用於檢測。在15分鐘內可同時檢測10種以上的樣品。近年來，毛細管電泳法逐漸被應用於高通量核酸分析，包括病原體檢測、基因分型、等位基因的鑑別及物種鑑定。
禽流感病毒演化分支2.3.4.4 H5及H6病毒為台灣現行廣傳的病毒型，而H7病毒為中國大陸盛傳的病毒型，不論是藉由候鳥進入或走私帶入，可能性高。因此從野生鳥類或家禽中即時檢測病毒係迫切需要解決的問題。然而，現行的檢測方法為針對禽流感病毒的高保留核蛋白(nucleoprotein，NP)基因區段作RT-PCR，如呈陽性反應，則再根據懷疑的病毒亞型跑HA基因的RT-PCR，甚至作基因定序。不僅步驟繁瑣，且檢測時間需時數日，無法滿足防疫需求。目前雖已有透過RPA進行H7N9或H5N1單一A型流感病毒HA基因的檢測技術，然而，從未開發出使用RPA同時檢測並區分極度多樣化之禽流感病毒的方法。另一方面，毛細管電泳法雖逐漸被應用於高通量核酸分析，但大多用於分析PCR產物，從未應用於RPA產物檢測。
有鑑於此，本發明開發了一種結合多重反轉錄重組酶聚合酶擴增(reverse transcription recombinase polymerase amplification ， RT-RPA)反應與生物分子分析法的檢測系統，用以透過保守的核蛋白基因檢測所有禽流感病毒亞型，同時透過各HA基因分辨演化分支2.3.4.4 H5、H6及H7病毒亞型。該四重基因檢測為一種新穎、高效率且高靈敏度的方法，對於監控禽類及迅速控制疫情大有助益。即，本發明之目的為提供一種用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組，其中包含一第一引子對SEQ ID NO：1 及SEQ ID NO：2 ，以及選自由下列(a)至(c)所組成之群組之至少一引子對：(a)一第二引子對SEQ ID NO：3 及SEQ ID NO：4；(b)一第三引子對SEQ ID NO：5 及SEQ ID NO：6 ；以及(c)一第四引子對SEQ ID NO：7 及SEQ ID NO：8 。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對及該第二引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對及該第三引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H6病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對及該第四引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H7病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第三引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H6病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H7病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支H6及H7病毒亞型。
於較佳實施例中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5、H6及H7病毒亞型。
本發明之另一目的為提供一種檢測禽流感病毒及其演化分支病毒分型之方法，包括：(a)萃取一待測樣品之總RNA；(b)以該總RNA為RNA模板，並使用本發明之引子組，進行多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應；以及(c)分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
於較佳實施例中，該步驟(c)係使用平板電泳法(plate electrophoresis)或毛細管電泳法分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
本發明之用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組及檢測禽流感病毒及其演化分支病毒分型之方法具有以下優勢功效：
1. 本發明所設計提供之引子組，可同步作禽流感病毒的檢測與clade 2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型的分型。
2. 本發明利用所設計的特殊引子組，使用反轉錄重組酶聚合酶擴增試驗法，可專一性地增幅4個禽流感目標基因(即，禽流感病毒與clade 2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型的分型)，不需要PCR增幅儀，增幅時間只需要30分鐘。
3. 本發明之方法檢測靈敏度每個基因為1個病毒複製數，全程時間只需1.5小時，大大提升檢測效能並滿足防疫的需求。
於下文中，將對本發明所揭示之示例性實施例及範例進行詳細的描述，並且附有圖式，使得本發明之概念得以經由本發明技術領域人員可據以實施。
然而，必須注意的是本發明所揭示之內容並不應被限制於發明實施例，且可以不同方式實現。於圖式中，部分與本發明不直接相關之內容省略以提高圖式之清晰度，標號於文件當中標示。
整篇說明書當中，所使用之詞彙「包含(comprises)」或「包括 (includes)」意謂著除了描述的組成、步驟、操作指令及/或元素以外，不排除一或多個其他組成、步驟、操作指令及/或存在或附加元素。所使用之詞彙「大約(about)或約(approximately)」意指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明所揭示之準確或絕對的數值受未知的第三方非法或非正當使用。詞彙「一」意指該冠詞之語法對象為一或一個以上(例如：至少為一)。
本發明提供一種用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之一引子組、以及一包含該引子組之方法。
[
檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組
]
本發明之用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組，包含一第一引子對SEQ ID NO：1 及SEQ ID NO：2 ，以及選自由下列(a)至(c)所組成之群組之至少一引子對：(a)一第二引子對SEQ ID NO：3 及SEQ ID NO：4 ；(b)一第三引子對SEQ ID NO：5 及SEQ ID NO：6 ；以及(c)一第四引子對SEQ ID NO：7 及SEQ ID NO：8 。
本發明開發之引子組可同步進行禽流感病毒的檢測及演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型的分型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對及該第二引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對及該第三引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H6病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對及該第四引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H7病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第三引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H6病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H7病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支H6及H7病毒亞型。於一較佳實施態樣中，當本發明之引子組包含該第一引子對、該第二引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5、H6及H7病毒亞型。該些實施態樣之優勢在於，本領域技術人員可依據所屬地區盛行之禽流感病毒亞型搭配出最適之引子組組合，或是在不確定禽流感病毒亞型的狀況下，可選用檢測範圍最廣的引子組搭配；因此，本發明之引子組可滿足不同的防疫需求。
[
檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之方法
]
本發明之用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒分型之方法，包括：(a)萃取一待測樣品之總RNA；(b)以該總RNA為RNA模板，並使用本發明之引子組，進行多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應；以及(c)分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
進一步地，本發明之方法中，該步驟(c)所使用的分析技術係指生化分析技術，例如但不限於：平板電泳法(plate electrophoresis)或毛細管電泳法(capillary electrophoresis)。於一較佳實施態樣中，該步驟(c)係使用平板電泳法或毛細管電泳法分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。於一更佳實施態樣中，該步驟(c)係使用毛細管電泳法分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
依據本發明內容，術語「樣品」可為生物性樣品，例如任何取自於懷疑可能帶有禽流感病毒之個體之樣品。該樣品可為任何取自於受感染個體包含病毒之樣品，包含組織或液體樣品，例如：血液、血清、血漿、周邊血液細胞包含淋巴球及單核球細胞、痰液、黏液、尿液、糞便、咽喉拭抹樣品、皮膚損傷拭抹樣品、腦脊髓液、膿及組織包含脾臟、腎及肝。
[
實施例
]
以下實施方式不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。
[樣品來源]
(1) H5N2(A型/雞/台灣/a2888/2015)(演化分支2.3.4.4 H5)及H7N9 (A型/野鳥WB/台灣/WB2498/2011)病毒RNA係取自行政院農業委員會家畜衛生試驗所。
(2) H6N1病毒(A型/雞/台灣/2838v/00)、禽傳染性支氣管炎病毒(avian infectious bronchitis virus，IBV)及新城雞病病毒(Newcastle disease virus，NDV)係取自臺灣大學獸醫專業學院禽病學研究室。
(3) 野生水禽口腔及泄殖腔拭抹之RNA樣品係取自屏東科技大學野生動物保育研究所，其係於2017-2018年收集自台灣南部濕地。
野外樣品之病毒RNA係藉由QIAamp病毒RNA試劑組(Qiagen，美國加州瓦倫西亞)萃取，並將RNA立即儲存在-80℃，直至用於多重RT-RPA反應。
[RPA引子設計]
取自Genbank或GISAID (The Global Initiative on Sharing All Influenza Data)之在台灣、中國、東北亞的家禽與野生鳥類中的所有禽流感病毒之NP基因序列及演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型之HA基因序列，係以MegAlign軟體(DNASTAR Lasergene 7.2.1，美國威爾康辛州麥迪遜市)進行比對。利用多重引子分析儀網站(MPA，2018)選擇候選引子。本發明所使用之RPA引子如表1所示。
表1. 本發明所設計之用於多重檢測之禽流感病毒基因的RPA引子
| 代名 | 序列 (5’至3’) | 定序 方向 | 目標基因 | 序列 長度 |
| NP 217F | ARCACYCTTGARCTRAGAAGYAGATAYT (SEQ ID NO：1) | 正向 | 所有 AIVs之NP基因 | 217 bp |
| NP217R | CCATCATYCTTATGATTTCWGTCCTCAT (SEQ ID NO：2) | 反向 | ||
| H5 173F | ATGCCATTCCACAATATACAYCCYCTCAC (SEQ ID NO：3) | 正向 | 演化分支2.3.4.4 H5 AIVs 之HA基因 | 173 bp |
| H5 173R | ATTCCYTGCCATCCTCCCTCTATRAAMCCTGC (SEQ ID NO：4) | 反向 | ||
| H6 199F | GACTGGAATGATAGATGGGTGGTATGGC (SEQ ID NO：5) | 正向 | H6 AIVs之HA基因 | 199 bp |
| H6 199R | GGAATGATAGATGGGTGGTATGGCTATC (SEQ ID NO：6) | 反向 | ||
| H7 137F | GTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATT (SEQ ID NO：7) | 正向 | H7 AIVs之HA基因 | 137 bp |
| H7 137R | TCCCCATACTATCAGAGCTGGGTCTCTC (SEQ ID NO：8) | 反向 |
[RNA之定量及病毒複製數之計算]
使用所述之RPA引子，以單步驟反轉錄聚合酶鏈鎖反應(one-step RT-PCR)擴增禽流感病毒之NP基因及演化分支2.3.4.4 H5、H6、H7病毒亞型之HA基因。以PCR純化試劑組(GeneMark，台灣台中)純化RT-PCR產物並轉殖至pGEM-T Easy載體(Promega，美國威爾康辛州麥迪遜市)。將重組之質體線性化，並以DNA聚合酶Klenow (Promega，美國威爾康辛州麥迪遜市)修飾其3’突端。使用具備有T7 RNA聚合酶之Riboprobe體外轉錄系統(Promega，美國威爾康辛州麥迪遜市)進行體外轉錄。加入DNase (Promega，美國威爾康辛州麥迪遜市)以除去剩餘之模板DNA。使用RNeasy MiniElute純化試劑組(Qiagen，德國希爾登)純化RNA產物，並透過凝膠電泳驗證之。最後，使用分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國德拉瓦州威明頓)進行RNA定量，並計算各基因之病毒複製數。
[多重RT-RPA反應]
RT-RPA反應係使用TwistAmp基本試劑組(TwistDx Limited，英國劍橋)進行。加入30 μl復水緩衝液、10 μl不含RNase的水(Qiagen，德國希爾登)、1 μl RNase抑制劑(Promega，美國威爾康辛州麥迪遜市)及1 μl MMLV RTase (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase)(Protech，台灣台北)以溶解冷凍乾燥之沉澱物。將所得到之14 μl溶液分配至2個0.2 ml微量離心管中，其中一個微量離心管用於H6N1之NP基因及H5N2之HA基因的多重RT-RPA反應，另一個微量離心管用於H6N1之HA基因及H7N9之HA基因的多重RT-RPA反應。於每個多重RT-RPA反應中，加入1 μl相對應之10 μM RPA正向與反向引子、以及1 μl相對應之RNA模板並混合。於每個微量離心管中加入1 μl 280 mM之乙酸鎂以開始反應。於39℃培養10分鐘後，將該微量離心管溶液vortex震盪2秒並離心，然後再培養20分鐘。最後，將兩種多重RT-RPA反應產物混合，並使用QIAquick PCR純化試劑組(Qiagen，德國希爾登)純化。在此，本實施例將多重RT-RPA反應試劑分裝至二個微量離心管，係可將試劑成本減少一半。
[比較平板電泳法與毛細管電泳法之檢測極限]
分別以傳統的平板瓊脂糖凝膠電泳法與毛細管電泳法分析純化之多重RT-RPA產物。使用含有100bp階梯狀分子量標記之4%瓊脂糖凝膠在1X TE緩衝液中進行平板電泳50分鐘。使用Qsep100
TMBio-Fragment分析儀S1卡匣(BiOptic，台灣新北市)進行毛細管電泳。將樣品在4KV電壓下注射20秒，並在6KV電壓下分離300秒；比對標記為20bp及1000bp；使用Q-Analyzer軟體(BiOptic Inc.，New Taipei city，Taiwan)讀取並分析每一樣品之波峰的遷移時間與相對螢光單位(relative fluorescent unit，RFU)間的關係。
將藉由體外轉錄所獲得之標準RNA在無RNase的水中10倍循序稀釋(10
8至10
0個複製數)，並用作多重RT-RPA反應的模板。比較在平板瓊脂糖凝膠電泳上與毛細管電泳之波峰上所顯示之多重RT-RPA檢測極限。
將由NP基因、演化分支2.3.4.4 H5之HA基因、H6之HA基因及H7之HA基因經體外轉錄而得之RNA進行定量，並用作多重RT-RPA反應的模板。以其他常見之禽類呼吸道病原體，如IBV及NDV，作為陰性對照組。將RNA以10倍循序稀釋從10
8至10
0個複製數。結果如圖1所示，平板瓊脂糖凝膠電泳法對於NP、H6、H5及H7之檢測極限分別為10
4、10
4、10
5及10
5個複製數；毛細管電泳法對於所有目標基因之檢測極限皆為10
0個複製數。由此可見，以傳統的平板瓊脂糖凝膠電泳法與毛細管電泳法皆可分析多重RT-RPA產物，而毛細管電泳法則為多重RT-RPA之高靈敏度檢測平台。本發明之方法可為四重目標基因同歨檢測提供即時信號，大幅提升檢測效率。
[現場樣品測試]
使用RT-RPA檢測現場野生水禽樣品並以電泳進行分析。分別進行傳統的平板電泳法與毛細管電泳法，並比較其檢測靈敏度。
從台灣南部濕地之60隻野生水禽中採集口腔及泄殖腔拭抹樣品。使用本發明之多重RT-RPA方法同步進行禽流感病毒檢測及病毒亞型分析。將多重RT-RPA產物進行傳統的平板瓊脂糖凝膠電泳與毛細管電泳，結果如表2及圖2所示。可以觀察到，將本發明之引子組進行多重RT-RPA反應並以傳統平板電泳法及毛細管電泳分析皆可進行現場樣本檢測，而毛細管電泳可獲得較高的檢測率。
表2. 以平板瓊脂糖凝膠電泳與毛細管電泳分析60個野外樣品之多重RT-RPA產物的結果
| 樣品 編號 | 動物物種 (學名) | 平板瓊脂糖凝膠電泳 | 毛細管電泳 |
| 1 | 綠頭鴨 (Anas platyrhynchos) | H6 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 2 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 3 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 4 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | H6 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 5 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 6 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 7 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 8 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 9 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 10 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | 陰性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 11 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 12 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 13 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 14 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 15 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 16 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 17 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 18 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 19 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 20 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 21 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6, H7 陽性 |
| 22 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 23 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 24 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 25 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 26 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 27 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 28 | 白眉鴨 (Anas querquedula) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 29 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 30 | 白眉鴨 (Anas querquedula) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 31 | 白眉鴨 (Anas querquedula) | 陰性 | 陰性 |
| 32 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 33 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 34 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 35 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 36 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 37 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6 陽性 | NP、H6 陽性 |
| 38 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | 陰性 | 陰性 |
| 39 | 白眉鴨 (Anas querquedula) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 40 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 41 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 42 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 43 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 44 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 45 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5 陽性 |
| 46 | 赤頸鴨 (Anas Penelope) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 47 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 48 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 49 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 50 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | 陰性 | 陰性 |
| 51 | 赤頸鴨 (Anas Penelope) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 52 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 53 | 琵嘴鴨 (Anas clypeata) | NP、H6、H5 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 54 | 琵嘴鴨 (Anas clypeata) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 55 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 56 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | 陰性 | 陰性 |
| 57 | 紅冠水雞 (Gallinula chloropus) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 58 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 59 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
| 60 | 尖尾鴨 (Anas acuta) | NP、H6、H5、H7 陽性 | NP、H6、H5、H7 陽性 |
將對應於毛細管電泳之波峰的瓊脂糖凝膠電泳之條帶進行定序，並以GenBank BLAST驗證其正確性，結果如表3所示。圖3為代表性之野外水禽拭抹樣品之毛細管電泳檢測結果。
表3. 部分野外樣品之目標基因序列
aRPA正向引子序列以底線標示。
| 目標基因 | 序列(5’→3’) a |
| NP | ARCACYCTTGARCTRAGAAGYAGATAYTGGGCTATAAGAACCAGGAGTGGGGAACACCAACCAGCAGAGAGCATCTGCAGGACAGATCAGTGTGCAACCTACTTTCTCAGTACAGAGAAACCTTCCCTTCGAAAGGGCTACCATTATGGCGGCATTTACAGGGAATACGGAAGGCAGAACATCTGACATGAGGACTGAAATCATAAGAATGATGGA (SEQ ID NO：9) |
| H5 HA | ATGCCATTCCACAATATACAYCCYCTCACCATCGGGGAATGCCCCAAATACGTGAGTCAAACAAATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATAGTCCTCTAAGAGAAAGAAGAAGAAAAAGAGGACTATTTGGAGCTATAGCAGGTTTCATAGAGGGAGGATGGCAGGGAATCA (SEQ ID NO：10) |
| H6 HA | GACTGGAATGATAGATGGGTGGTATGGCTATAACCAATGTAAAATTCTCAGGCTCAGGATATGCAGCAGACAGAGAAAGCACCCAAAAGGCTATAGACGGAATTACAAATAAGGTCAATTCCATCATCAACAAAATGAACACACAATTCGAAGCCGTAGACCACGAATTTTCAAATCTGGAGAGAAGAATTGGCAATCTGA (SEQ ID NO：11) |
| H7 HA | GTGCATGTAGGAGATCAGGATCTTCATTCTATGCAGAGATGAAATGGCTCCTTTCAAACACAGACAATGCTGCTTTCCCGCAGATGACTAAGTCATACAAAAACACAAGGAGAGACCCAGCTCTGATAGTATGGGGAA (SEQ ID NO：12) |
所有結果皆表明，使用本發明之引子組及方法可實現同步檢測禽流感病毒及辨識H5、H6、H7病毒亞型。可依據所屬地區盛行之禽流感病毒亞型搭配出最適之引子組組合，或是在不確定禽流感病毒亞型的狀況下，可選用檢測範圍最廣的引子組搭配；因此，本發明之引子組可滿足不同的防疫需求。
綜上所述，本發明所設計提供之引子組可同步作禽流感病毒的檢測與calde H5、H6、H7病毒亞型的分型，使用反轉錄重組酶聚合酶擴增試驗法，可專一性地增幅4個禽流感目標基因(即，禽流感病毒與calde H5、H6、H7病毒亞型的分型)，不需要PCR增幅儀，增幅時間只需要30分鐘。並且本發明之方法檢測靈敏度每個基因為1個病毒複製數，全程時間只需1.5小時，大大提升檢測效能並滿足防疫的需求。
僅管實施例已於本文中公開，但須了解其仍有許多種可能的變化存在。而這些實施例之變化並不視為背離本發明應用之精神及範圍，且若這些修改對於本領域技術人員而言都為顯而易見則仍包含於原申請專利範圍之內。
無。
非限制且非詳盡之實施例將結合附圖說明如下。必須了解的是下列圖式僅依據本說明書公開之內容描繪數個實施例，因此，勿因而限制其範圍，本發明所揭示之內容將特別詳細地藉由這些圖式作為說明，其中：
圖1顯示傳統的平板瓊脂糖凝膠電泳(A)與毛細管電泳(B)之檢測極限的差異。將由目標病毒基因進行體外轉錄而得之RNA進行定量，並用作多重RT-RPA反應的模板。M：100bp階梯狀分子量標記；LM：20bp分子量標記；UM： 1000bp分子量標記；1：10
8個複製數；2：10
7個複製數；3：10
6個複製數；4：10
5個複製數；5：10
4個複製數；6：10
3個複製數；7：10
2個複製數；8：10
1個複製數；9：10
0個複製數；IBV：雞傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus)；NDV：新城雞病病毒(New Castle disease virus)。
圖2 顯示60個野外樣品之多重RT-RPA產物以平板瓊脂糖凝膠電泳(A)與毛細管電泳(B)進行分析之結果。M：100bp階梯狀分子量標記；P：由體外轉錄而得之RNA標準品作為陽性對照組；N：ddH
2O作為陰性對照組；1-60：樣品編號。藍線：野外樣品。紅線：陽性對照組。毛細管電泳中，由左至右之6個主要波峰分別為20bp分子量標記、H7 HA基因(137bp)、H5 HA基因(173bp)、H6 HA基因(199bp)、NP基因(217bp)及1000bp分子量標記。
圖3顯示野外樣品之代表性毛細管電泳檢測結果。藍線：野外樣品。紅線：陽性對照組(由體外轉錄而得之RNA標準品)。(A)全部為陰性。(B)NP及H6為陽性。(C)NP、H6及H5為陽性。(D)NP、H6及H7為陽性。(E) NP、H6、H5及H7均為陽性。 LM：20bp分子量標記；UM：1000bp分子量標記；波峰1：H7 HA基因(137bp)；波峰2：H5 HA基因(173bp)；波峰3：H6 HA基因(199bp)； 波峰4：NP基因(217bp)。
無。
Claims (10)
- 一種用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組，其中包含一第一引子對SEQ ID NO：1 及SEQ ID NO：2 ，以及選自由下列(a)至(c)所組成之群組之至少一引子對： (a)一第二引子對SEQ ID NO：3 及SEQ ID NO：4 ； (b)一第三引子對SEQ ID NO：5 及SEQ ID NO：6 ；以及 (c)一第四引子對SEQ ID NO：7 及SEQ ID NO：8 。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對及該第二引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對及該第三引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H6病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對及該第四引子對時，用於檢測禽流感病毒及其演化分支H7病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第三引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H6病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5及H7病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支H6及H7病毒亞型。
- 如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中，當該引子組包含該第一引子對、該第二引子對、該第三引子對及該第四引子對時，用於同時檢測禽流感病毒及其演化分支2.3.4.4 H5、H6及H7病毒亞型。
- 一種檢測禽流感病毒及其演化分支病毒分型之方法，包括： (a)萃取一待測樣品之總RNA； (b)以該總RNA為RNA模板，並使用如申請專利範圍第1項至第8項任一項所述之引子組，進行多重反轉錄重組酶聚合酶擴增(reverse transcription recombinase polymerase amplification ， RT-RPA)反應；以及 (c)分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
- 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，該步驟(c)係使用平板電泳法(plate electrophoresis)或毛細管電泳法(capillary electrophoresis)分析該多重反轉錄重組酶聚合酶擴增反應之產物，得到檢測結果。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116121461A (zh) * | 2023-02-21 | 2023-05-16 | 华南农业大学 | 一种检测chv型鸡传染性支气管炎病毒的引物对、试剂盒及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102260749A (zh) * | 2011-04-25 | 2011-11-30 | 吉林农业大学 | H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒 |
| CN104805217A (zh) * | 2015-03-24 | 2015-07-29 | 山西隆克尔生物制药有限公司 | 一种用于区别检测禽类重要经济病毒的mRT-PCR试剂盒及其应用 |
-
2019
- 2019-08-21 TW TW108129837A patent/TWI711701B/zh active
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