CN102260749A - H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒 - Google Patents

H5、h7、h9亚型禽流感病毒检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒,在GenBank中搜索三种亚型HA基因序列,设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测,筛选、优化出3对引物及其反应体系,所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒,最低检出量均为10pg。而对多种鸡传染病及正常组织不存在交叉反应,特异性强,对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感,定位到亚型,为禽流感的防控争取了时间,及时采取措施,使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。

Description

H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属生物技术领域,确切地说是H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒背景技术
[0002] 禽流感(Avian influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性传染病,除了可感染禽类外,还可感染人、猪和马等多种动物,被OIE列为A类传染病。禽流感病毒(AIV)属于A型流感病毒,禽流感病毒(AIV)变异频繁,血清亚型众多。 根据HA抗原性差异分为16个HA亚型。抗原变异性强,宿主范围广泛,亚型间无交叉保护性,使得禽流感频繁暴发,成为养禽业的一大毁灭性疾病。
[0003] 高致病性禽流感主要是由H5或H7亚型AIV引起的,潜伏期极短,突然爆发,多不见任何临床症状而突然死亡,发病率和死亡率可高达100 %,给养禽业带来严重经济损失, 另外还可感染人,甚至导致死亡。据世界卫生组织(WHO)报道,截止到2009年5月22日, 全世界共有H5W亚型禽流感病毒感染人似9例,死亡262例;我国共有感染病例38例,死亡25例。目前,我国部分地区以H9亚型为主的中低致病力禽流感的流行,能造成鸡产蛋量下降,给我国养禽业造成很大的经济损失,这一点已引起国内各界的广泛关注。所以早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的前提条件,尤其是针对H5、H7和H9亚型的AIV。病毒分离、血清学试验至今仍是诊断AI和对AIV进行定型普遍采用的方法。但这些方法操作繁琐复杂;难以对AI进行快速诊断;十分不利于AI的防治。自从美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(PCR)以来,PCR已经成为了分子生物学领域最基本也是最重要的技术手段之。聚合酶链式反应(PCR)是一种体外基因扩增技术,可以在数小时内对某段基因进行扩大数百万倍。该技术特异性强、敏感性高。为 AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。
[0004] 多重RT-PCR(Multiplex RT-PCR)技术其反应原理,反应试剂和操作过程与一般 PCR相同。但与多个单项PCR相比,多重PCR具有以下显著的优点:高效性,它可在同一 PCR 管内同时扩增多个靶基因,或对有多个型别的目的基因进行分型;系统性,多重PCR很适宜于多种病原体的同时检测,如肝炎病毒、肠道致病性细菌和无芽孢厌氧菌的同时检测;经济简便性,多个靶基因在同一反应管内同时扩增,将大大的节省时间,节省试剂,节约经费开支,为临床提供更多更准确的诊断信息。自从1988年首次报道以来,作为一种临床和实验室快速筛选技术,多重PCR已经成功应用到很多领域,如基因缺失、突变和多态性的分析、 RNA检测和基因组测序分析。
[0005] 各类PCR成功的关键在于设计出合理的引物,合适的引物是决定PCR扩增特异性和敏感性的关键。多重PCR对引物的要求更加严格,以便同时检测出多种病原微生物。
[0006] 多重PCR的各对引物必须具有相近的退火温度,使得所有的靶位点可以用相同的 PCR程序在单个的反应中得到有效的扩增。而其之间不能形成稳定二聚体和发夹结构。同时保证了扩增产物的大小能够通过电泳分开。
[0007] 虽然有很多能帮助设计引物的软件,例如“Premier Primer 5.0”、“01io 6”、“Vector N TI Suit”、“DNASiS”和“DNAstar”都带有引物自动搜索功能,但搜索结果并不是十分理想。要想得到效果很好的引物,在自动搜索的基础上,还要各软件搭配使用。
[0008] 尽管上述软件能够对帮助设计引物,但它毕竟是在科技人员大量研究成果的基础上,设计出的固定程序。人工分析、实际操作经验是必不可少的。可靠的多重PCR检测体系, 还要通过科技人员大量试验验证、筛选。
发明内容
[0009] 本发明的目的是提供一种利用多重RT-PCR可同时检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒。
[0010] H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒,它是由RNA反转录体系,以及PCR反应体系组成,其中引物为:
[0011] P5- -1 5' -CCAATCCAGCCAATGACC-3 [0012] P5- -2 5' -TCTATGGCAACCCTTCTT-3 [0013] P7- -1 5' -GAGTCAATGGACTTCACC-3 [0014] P7- -2 5' -AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3 [0015] P9- -1 5' -TCTATGGCAACCCTTCTTGT- -3[0016] P9- -2 5' -TATAACCCTGACCAACCTCC- -3
[0017] 所述的反转录体系还包括引物P5-1、P7_1和P9-1 ;
[0018] 所述的引物还包括:
[0019] P9 内-1:5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3‘
[0020] P9 内-2:5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA-3
[0021] 所述的反转录体系为:双蒸水2. 7 μ L、反转录酶缓冲液2. 0 μ L、三磷酸脱氧核糖核苷1. 0 μ L、反转录酶抑制剂0. 3 μ L、反转录酶0. 5 μ L及三种亚型上游引物各0. 5 μ L的 IOuL反转录体系;
[0022] 所述的PCR体系为:双蒸水四.7 μ LU0XPCR缓冲液5. 0 μ L、三磷酸脱氧核糖核苷 4. 0 μ L、DNA 聚合酶 0. 5 μ L 及引物 Ρ5-2、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 0. 8 μ L 的 50 μ L的反应体系。
[0023] 本发明提供的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒,在GenBank中搜索三种亚型 HA基因序列,设计特异性引物。经过大量的试验和实际检测,筛选、优化出3对引物及其反应体系,所扩增的cDNA片段大小分别为427、312、和826bp。结果表明,通过对多重RT-PCR 扩增条件的优化,制成了同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒,最低检出量均为10pg。而对鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒、鸡白痢沙门氏菌病原核酸及正常组织不存在交叉反应,特异性强,对三种亚型检测敏感性一致。基层实验室就可以在短时间内确诊禽流感,定位到亚型,为禽流感的防控争取了时间,及时采取措施,使禽流感传播控制在尽可能小的范围内。
附图说明
[0024] 图1为H9亚型AIV RT-PCR扩增结果,其中,M =DNAMaker DL2000 1 :外侧引物扩增条带2:内侧引物扩增条带3:水对照;[0025] 图2为三种亚型AIV的多重RT-PCR敏感性实验扩增结果,其中,M =DNA分子质量标准,1 :为 IOng, 2 :¾ lng, 3 :¾ IOOpg, 4 :为 IOpg, 5 :为 Ipg
具体实施方式
[0026] 实施例1
[0027] 禽流感病毒H5、H7和H9亚型标准毒株由哈尔滨兽医生物技术国家重点实验室保存。鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H52、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒(NDV)Lasota株、鸡白痢沙门氏菌(SP) CVCC528,由吉林农业大学预防兽医教研室保存。
[0028] 用Trizol提取病毒或疑似禽流感的病料(肺脏、淋巴结、脾脏)1〜4g的总RNA, 提取过程中所有的器皿及消耗品均用DEPC水处理。
[0029] (1)将收集好的尿囊液以4000rpm 4°C离心30min,弃沉淀,上清液移至新的 Eppendorf管中4°C IOOOOrpm超速离心2h,收集沉淀,以原尿囊液1/20体积的PBS (pH7. 4)
重悬毒液。
[0030] (2)抽取浓缩病毒液250 μ L至灭菌的2. OmLEppendorf管中,加入750 μ L Trizol 裂解液,剧烈振荡15s,室温静置15min。
[0031] (3)加入200 μ L氯仿,振荡1¾充分混勻,室温静置5min,12000rpm离心15min。
[0032] (4)取上清夜至新的1. 5mL Eppendorf管中,加入等体积的异丙醇,充分混勻,室温静置 lOmin,12000rpm 离心 18min。
[0033] (5)小心弃去上清液,加入75%乙醇(用DEPC水配制)混勻,洗涤沉淀,12000rpm 离心8min。
[0034] (6)弃去上清液,将Eppendorf管置于超净工作台中通风干燥沉淀5-lOmin。
[0035] (7)加入灭菌的DEPC /K 20 μ L溶解沉淀。
[0036] (8)将核酸分装成每管5 μ 1,-70°C保存备用;
[0037] 按下表反应体系:
[0038] 表1反转录反应体系各组成成分
[0039] Tabl Composition of reaction system for reverse transcription
[0040]
Ix蒸水
反转录酶缓冲液三磷酸脱氧核糖核苷反转录酶抑制剂反转录酶
三种亚型上游引物 RNA模板总计
2.7 μί 2.0 μί 1.0 μΐ 0.3 pL 0.5 μΐ 各 0.5 μL 2.0 μί ΙΟ.Ομί[0041] 注:三种亚型上游引物见表2
[0042] 轻轻混勻,瞬离,按反应条件:42°C 45min,99°C 5min,4°C 5min结束,在PCR仪上设定程序进行反转录;
[0043] 人工合成表2中引物:
[0044] 表2多重RT-PCR弓丨物
[0045] Tab. 2Multiplex RT-PCR primers
[0046]
Figure CN102260749AD00061
[0047] 按表3反应体系:
[0048] 表3H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分
[0049] Tab. 3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9 subtypes AIV
[0050]
Figure CN102260749AD00062
[0051] 按反应条件:95°C预变性:3min ;然后进入95°C变性45s,59°C退火45s,72°C延伸 lmin,共33个循环;72°C延伸10min,4°C保温;在PCR仪上设定程序进行扩增;
[0052] 取5yL PCR反应产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下观察扩增片段。结果同时扩增出427bp、312bp、^6bp大小的三条DNA片段。
[0053] 实施例2
[0054] 人工合成表4引物;
[0055] 表4H9亚型禽流感病毒巢式PCR内侧引物
[0056]
Figure CN102260749AD00071
[0057] 取H9亚型AIV按实施例1的PCR方法扩增,取反应产物,按表4反应体系;
[0058] 表5H9亚型AIV巢式PCR反应体系各组成成分
[0059]
Figure CN102260749AD00072
[0060] 按反应条件:94°C预变性:3min后,进入94°C变性45s,53°C退火lmin,72°C延伸 lmin,共循环30次,然后72 V再延伸lOmin,于4°C结束PCR扩增。取PCR产物5 μ L,用 01kg/L琼脂糖凝胶进行电泳,观察扩增结果。电泳检测结果见图1。
[0061] 实施例3特异性试验
[0062] 将H5、H7和H9亚型AIV的RNA以及鸡传染性支气管炎病毒(IBV) H52、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)B87、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)疫苗株、鸡新城疫病毒(NDV)Lasota 株、鸡白痢沙门氏菌(SP) CVCC528,及取健康禽类组织的RNA、DNA分别按实施例1、2方法, 在相同条件下进行扩增。回收、纯化扩增片段,送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,分析测序结果,检测RT-PCR的特异性。
[0063] H5、H7和H9亚型AIV的cDNA经PCR扩增,结果H5亚型AIV在427bp位置出现一条cDNA扩增带,H7亚型AIV则在312bp位置出现一条cDNA扩增带,H9亚型AIV在位置出现一条cDNA扩增带,而鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒和鸡白痢沙门氏菌及正常组织,无论在427bp、312还是826bp处均无cDNA扩增带出现,即为阴性。对所回收的427、312和826bp cDNA扩增片段进行测序, 并对测序结果经DNAMar基因分析软件分析,这些cDNA片段分别与AIV H5亚型HA基因、 H7亚型HA基因和H9亚型HA基因有着高度同源性,表明这些扩增基因的序列与原参考序列的基因来源完全一致,分别来源于AIV H5亚型HA基因、H7亚型HA基因和H9亚型HA基因。
[0064] 实施例4敏感性试验
[0065] 将H5、H7和H9亚型AIV的反转录产物(10 μ g/mL) 10倍梯度稀释,按照上述试验确定的PCR最适条件进行敏感性检测,测定该RT-PCR对三种亚型AIV cDNA的最低检测量。 H5、H7、H9亚型AIV的多重RT-PCR检测的最低检出量均为IOpg (见图幻,H9亚型AIV cDNA 的巢式PCR的最低检测量为10fg。
[0066] 实施例5 H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测方法
[0067].取疑似禽流感的病料(肺脏、淋巴结、脾脏等)1〜4g于无菌研钵,研磨并加入适量的RNAiso Reagent后勻浆,室温放置5〜10分钟;加入250 μ L氯仿,漩涡振荡15秒混勻;室温下放置5分钟;12000r/min离心15分钟,取上层水相,转移到一个新的EP管中, 再加入等体积的异丙醇混勻,室温放置10分钟。12000r/min离心10分钟,弃去上清,加入75%乙醇700 μ L,充分洗涤沉淀的RNA后,12000r/min离心5分钟,小心吸去上清。室温晾干或到置于超净工作台内风干15-30分钟。用IOyL DEPC水中溶解,即为模板,即用或-70°C冻存备用;
[0068] 按实施例1的反转录体系及反应条件反转录;
[0069] 取反转录产物进行H5、H7和H9亚型AIV多重PCR检测,反应体系按表6
[0070] 表6H5、H7和H9亚型AIV多重PCR反应体系组成成分
[0071] Tab. 3Composition of multiplex PCR reaction system for H5、H7 and H9 subtypes AIV
[0072]
Figure CN102260749AD00091
[0073] 按反应条件:95°C预变性:3min ;然后进入95°C变性45s,59°C退火45s,72°C延伸 Imin,共33个循环;72°C延伸10min,4°C保温;在PCR仪上设定程序进行扩增;取PCR产物 5μ L,用0. 8kg/L琼脂糖凝胶进行电泳,观察扩增结果。
[0074] 在312bp位置出现一条cDNA扩增带,H5亚型AIV阳性;无为阴性。
[0075] 在427bp位置出现一条cDNA扩增带,H7亚型AIV阳性;无为阴性
[0076] 在826bp位置出现一条cDNA扩增带;H9亚型AIV阳性;无为阴性
[0077] 当H9亚型阴性时,取上述多重RT-PCR产物按实施例2的反应体系(表5)及反应条件,扩增出693bp条带,H9亚型为阳性;无为阴性。
[0078] 该方法特别适合基层实验室使用,方便快捷,简单实用,经济节约,可以在较近的地点,最短时间内确诊禽流感,并可直接定位到亚型。使禽流感的传播锁定在一个较小的范围。
[0079] 可同时检测三种亚型AIV的多重RT-PCR检测试剂盒,最低检出量均为10pg。H5和 H7毒力较强,感染后病毒浓度大,检出量IOpg即可定性;而H9为中等毒力,特别是隐性感染时,症状不明显,病毒浓度低,对多重RT-PCR产物再进行内引物检测,以排除隐性感染。

Claims (5)

1. H5、H7、H9亚型禽流感病毒检测试剂盒,它是由RNA反转录体系,以及PCR反应体系组成,其中引物为:Ρ5-1 5' -CCAATCCAGCCAATGACC-3Ρ5-2 5' -TCTATGGCAACCCTTCTT-3Ρ7-1 5' -GAGTCAATGGACTTCACC-3‘Ρ7-2 5' -AGGTTCGGTCTGCTCGCT-3‘Ρ9-1 5' -TCTATGGCAACCCTTCTTGT-3‘Ρ9-2 5' -TATAACCCTGACCAACCTCC-3。
2.根据权利要求1所述的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒,其特征在于 反转录体系为:双蒸水2. 7 μ L、反转录酶缓冲液2. 0 μ L、三磷酸脱氧核糖核苷1. 0 μ L、反转录酶抑制剂0. 3 μ L、反转录酶0. 5 μ L及三种亚型上游引物各0. 5 μ L的10 μ L反转录体系。
3.根据权利要求2所述的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒,其特征在于:所述的反转录体系还包括引物Ρ5-1、Ρ7-1和Ρ9-1。
4.根据权利要求3所述的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒,其特征在于,所述的引物还包括:Ρ9 内-1 :5' -ACAAGCAAAGCATGCTCAGG-3 ‘ Ρ9 内-2 :5' -ACAAGATAACATCCAAAGTA-3。
5.根据权利要求4所述的Η5、Η7、Η9亚型禽流感病毒检测试剂盒,其特征在于:所述的 PCR体系为:双蒸水29. 7 μ L、10 X PCR缓冲液5. 0 μ L、三磷酸脱氧核糖核苷4. 0 μ L、DNA聚合酶 0. 5μ L 及引物 Ρ5-2、Ρ5-2、Ρ7-1、Ρ7-2、Ρ9-1 和 Ρ9-2 各 0. 8 μ L 的 50 μ L 反应体系。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103291A (zh) * 2013-01-30 2013-05-15 山东省农业科学院家禽研究所 一种h4和h9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法
CN103255232A (zh) * 2013-04-24 2013-08-21 浙江省疾病预防控制中心 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN103805720A (zh) * 2014-02-20 2014-05-21 广西壮族自治区兽医研究所 H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重rt-pcr试剂盒及其应用
CN103866047A (zh) * 2013-04-27 2014-06-18 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 用于检测h7n9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒
CN104232625A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 中国农业大学 辅助鉴定h9亚型禽流感病毒的引物对及其应用
CN104232624A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 中国农业大学 辅助鉴定h9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的引物组合物及其应用
CN104531901A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 四川圣迪乐村生态食品股份有限公司 一种同时检测禽4种呼吸道疾病病原的pcr检测方法
CN105986042A (zh) * 2016-01-29 2016-10-05 中国动物卫生与流行病学中心 H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法
CN106435030A (zh) * 2016-11-10 2017-02-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN106435024A (zh) * 2016-09-26 2017-02-22 南京农业大学 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN106834550A (zh) * 2017-04-18 2017-06-13 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种禽流感病毒纳米pcr检测试剂盒及其应用
CN108300809A (zh) * 2018-02-23 2018-07-20 湖南国测生物科技有限公司 一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法
CN109628639A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 武汉科前生物股份有限公司 禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物及试剂盒
TWI711701B (zh) * 2019-08-21 2020-12-01 國立臺灣大學 用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組及方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560597A (zh) * 2004-03-09 2005-01-05 扬州大学 禽流感病毒多重pcr快速检测方法
CN1670221A (zh) * 2004-06-25 2005-09-21 深圳太太基因工程有限公司 用于禽流感h5、h7和h9亚型多重实时荧光rt-pcr检测的引物、探针序列和方法
CN101724713A (zh) * 2009-12-21 2010-06-09 中国检验检疫科学研究院 一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1560597A (zh) * 2004-03-09 2005-01-05 扬州大学 禽流感病毒多重pcr快速检测方法
CN1670221A (zh) * 2004-06-25 2005-09-21 深圳太太基因工程有限公司 用于禽流感h5、h7和h9亚型多重实时荧光rt-pcr检测的引物、探针序列和方法
CN101724713A (zh) * 2009-12-21 2010-06-09 中国检验检疫科学研究院 一种检测不同亚型禽流感病毒的方法及其专用试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张文慧等: "禽流感病毒H5、H7和H9亚型基因的引物设计与多重RT-PCR扩增", 《江苏农业科学》, no. 6, 31 December 2008 (2008-12-31) *

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103103291A (zh) * 2013-01-30 2013-05-15 山东省农业科学院家禽研究所 一种h4和h9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法
CN103103291B (zh) * 2013-01-30 2014-06-18 山东省农业科学院家禽研究所 一种h4和h9亚型禽流感病毒多重鉴别检测的方法
CN103255232A (zh) * 2013-04-24 2013-08-21 浙江省疾病预防控制中心 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN103255232B (zh) * 2013-04-24 2015-07-22 浙江省疾病预防控制中心 禽流感h7n9病毒双重荧光rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN103866047A (zh) * 2013-04-27 2014-06-18 中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 用于检测h7n9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒
CN104232625A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 中国农业大学 辅助鉴定h9亚型禽流感病毒的引物对及其应用
CN104232624A (zh) * 2013-06-09 2014-12-24 中国农业大学 辅助鉴定h9亚型禽流感病毒和鸡传染性支气管炎病毒的引物组合物及其应用
CN103805720A (zh) * 2014-02-20 2014-05-21 广西壮族自治区兽医研究所 H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重rt-pcr试剂盒及其应用
CN103805720B (zh) * 2014-02-20 2016-03-09 广西壮族自治区兽医研究所 H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重rt-pcr试剂盒及其应用
CN104531901A (zh) * 2014-12-31 2015-04-22 四川圣迪乐村生态食品股份有限公司 一种同时检测禽4种呼吸道疾病病原的pcr检测方法
CN105986042A (zh) * 2016-01-29 2016-10-05 中国动物卫生与流行病学中心 H9亚型禽流感病毒核酸快速检测方法
CN106435024A (zh) * 2016-09-26 2017-02-22 南京农业大学 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN106435024B (zh) * 2016-09-26 2020-02-14 南京农业大学 检测禽流感病毒亚型的荧光定量pcr引物、探针和试剂盒及检测方法
CN106435030A (zh) * 2016-11-10 2017-02-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN106435030B (zh) * 2016-11-10 2019-12-31 广东省农业科学院动物卫生研究所 一种联合检测禽流感h7n9和h9n2的四通道荧光定量pcr检测方法及试剂盒
CN106834550A (zh) * 2017-04-18 2017-06-13 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 一种禽流感病毒纳米pcr检测试剂盒及其应用
CN108300809A (zh) * 2018-02-23 2018-07-20 湖南国测生物科技有限公司 一种禽流感h5、h7以及h9亚型的荧光pcr检测试剂盒、制备方法及使用方法
CN109628639A (zh) * 2018-12-26 2019-04-16 武汉科前生物股份有限公司 禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物及试剂盒
CN109628639B (zh) * 2018-12-26 2022-04-01 武汉科前生物股份有限公司 禽流感病毒h5、h7、h9亚型三重rt-pcr检测的引物及试剂盒
TWI711701B (zh) * 2019-08-21 2020-12-01 國立臺灣大學 用於檢測禽流感病毒及其演化分支病毒亞型之引子組及方法

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