CN118028544A - 一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒n基因的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对及其应用，涉及生物学检测与疾病技术领域，该引物对正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了该引物对在制备检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂或试剂盒中的应用、包括该引物对的试剂盒以及使用该试剂盒检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法。使用本发明引物对的检测方法具有操作简单、灵敏度高、不需要昂贵仪器设备、检测时间短和适于大规模推广应用的优势，解决了目前4型鹦鹉博尔纳病毒检测方法均需要笨重或昂贵的仪器设备、检测时间长、对于检测人员的要求高、需进行专业培训、仅能适于实验室的辅助诊断和无法推广应用等问题。
Description
技术领域
本发明属于生物学检测与疾病技术领域，具体涉及一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对及其应用。
背景技术
鹦鹉博尔纳病毒（parrot Bornavirus，PaBV）是一种单股不分节的负链RNA病毒，基因组大小约8.9 kb。二十世纪七十年代，研究人员在金刚鹦鹉身上的一种萎缩病，被称为腺胃扩张症（proventricular dilatation disease，PDD），发生PDD的鹦鹉临床表现主要为腹部肿大，严重呕吐，食欲下降，体重减轻，精神沉郁、羽毛松乱，严重时则会出现共济失调、失明或震颤等神经症状。2008年，PDD的致病因子才被确定是鹦鹉博尔纳病毒，目前报道的PaBV已有8种不同基因型，其中基因4型在世界范围内流行广泛。近年，我国也时有发生鹦鹉感染PaBV-4而引起死亡，但国内相关的研究报道非常少，急需建立一种可对PaBV-4快速诊断的检测方法。目前，针对4型鹦鹉博尔纳病毒的检测方法，包括常规PCR、实时荧光定量PCR和血清学，但以上3种检测方法均需要笨重或昂贵的仪器设备，检测时间长，对于检测人员的要求高，需进行专业培训，实际上仅能适于实验室的辅助诊断，无法推广应用。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对及其应用，使用本发明引物对进行4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的检测，其检测方法具有操作简单、灵敏度高、不需要昂贵仪器设备、检测时间短和适于大规模推广应用的优势，解决了目前4型鹦鹉博尔纳病毒检测方法均需要笨重或昂贵的仪器设备、检测时间长、对于检测人员的要求高、需进行专业培训、仅能适于实验室的辅助诊断和无法推广应用等问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对，该引物对正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明技术方案的有益效果是：本发明提供的引物对可以特异性扩增4型鹦鹉博尔纳病毒，与H5N6、H7N9、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。
本发明还提供了上述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对在制备检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还提供一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，包括检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对。
进一步，检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒还包括探针、RT-RAA反应干粉、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品。
进一步，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；阳性对照品包括4型鹦鹉博尔纳病毒核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，探针有以下修饰：5’端第31位碱基标记FAM荧光基团，第32位碱基后连接脱碱基位点四氢呋喃（Tetrahydrofuran，THF），第33位T碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰。修饰后的探针如下所示：5’-AGAGCTTTACCACAGTGTCACTCCGAGTCT[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CTTCTTGTGCTTGCT-[C3Spacer]-3’，其中[FAM-dT]是标记FAM荧光基团的T碱基，[THF]是重组酶的识别位点四氢呋喃，[BHQ-dT]是标记BHQ1淬灭基团的T碱基，[C3-spacer]是生物阻断素。
上述进一步技术方案的有益效果是：修饰后的探针在游离状态下核酸外切酶不识别，当探针和目的基因识别后开始结合，核酸外切酶在识别到缺口后，切除THF并解除C3-spacer生物阻断素，从而使FAM基团和BHQ1基团分离发出荧光被仪器检测到，进而检测出扩增产物。
进一步，RT-RAA反应干粉包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix和氯化镁；A液为聚乙二醇；B液为醋酸镁；阴性对照品为ddH2O。
本发明对RT-RAA荧光法通用试剂的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售商品即可。本发明实施例中反应干粉、A液和B液采用南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂中的组分。
本发明还提供一种非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，该方法使用上述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，包括以下步骤：
（1）提取待测样本的RNA作为模板；
（2）使用所述试剂盒中的试剂，配制反应体系，充分混匀后，离心至管底；
（3）将步骤（2）操作的反应体系置于荧光定量仪中，设置反应程序进行RT-RAA反应，并收集荧光信号；
（4）结果判定：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阴性。
进一步，步骤（2）中，反应体系中RT-RAA反应干粉、聚乙二醇、醋酸镁、正向引物、反向引物、探针、RNA模板和ddH2O的质量体积比为15 mg:25 μL:2.5 μL:2 μL:2 μL:0.6 μL:5μL:12.9 μL。
进一步，步骤（3）中，RT-RAA的反应程序为39℃ 60 s；39℃ 30 s，40个循环。
进一步，正向引物和反向引物的浓度为10 μmol/L；探针的浓度为10 μmol/L。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的引物对可以特异性扩增4型鹦鹉博尔纳病毒，与H5N6、H7N9、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的核酸均无交叉反应，特异性强。
2、利用本发明提供的引物对进行RT-RAA荧光法检测4型鹦鹉博尔纳病毒时，可以检测低拷贝的4型鹦鹉博尔纳病毒核酸，能够在30min内完成检测，具有操作简便、成本低、灵敏度高和假阳性率低的优势。
附图说明
图1为实施例1中16组引物对和探针荧光RT-RAA检测结果图；
图2为本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对PCR扩增产物的琼脂糖电泳结果图；
图3为本发明阳性对照品和阴性对照品的扩增结果；
图4为本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法灵敏度结果；
图5为本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法特异性结果。
具体实施方式
实施例1引物设计和筛选
以NCBI数据库中Pabv-4 N基因序列（GenBank登录号：LC486414、LC486415、LC486416、LC486417、GU249596、JX065209、NC_030688、MT258650和OM939725）为参考，根据基因比对分析保守区域，经同源性分析后，设计引物和探针（P）序列如下：
P:AGAGCTTTACCACAGTGTCACTCCGAGTCTTGTCTTCTTGTGCTTGCT(SEQ ID NO.3所示)，该探针经修饰后序列为AGAGCTTTACCACAGTGTCACTCCGAGTCT[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CTTCTTGTGCTTGCT-[C3Spacer]；
F1: CCATCCCGGGATAGGAAACGAGAAGGAC (SEQ ID NO.5)；
F2: CCATCCCGGGATAGGAAACGAGAAGGACATC (SEQ ID NO.1)；
F3: CCCGGGATAGGAAACGAGAAGGACATC (SEQ ID NO.6)；
F4: CAGTTGCACTTCTAGACCAATCCCGCA (SEQ ID NO.7)；
R1: CAAAGAGCAAGGCAGAATGTAGTCCAGGGATG (SEQ ID NO.8)；
R2: TCAAATATGACTCCCGCTGTACACCTG (SEQ ID NO.9)；
R3: CCGTTCTCCTTGCTTGACTGGCGTTGTC (SEQ ID NO.2)；
R4: ACCGTTCTCCTTGCTTGACTGGCGTTG (SEQ ID NO.10)。
将引物分为16组分别为：F1R1、F1R2、F1R3、F1R4、F2R1、F2R2、F2R3、F2R4、F3R1、F3R2、F3R3、F3R4、F4R1、F4R2、F4R3和F4R4。
以4型鹦鹉博尔纳病毒核酸（SEQ ID NO.4）为模板，ddH2O为阴性对照，用上述16组引物对进行RT-RAA反应（RT-RAA的反应程序为：39℃ 60 s；39℃ 30s，40个循环），结果如图1所示。
由图1可知，在引物和探针相同浓度情况下，Ct值小，扩增产物量多的一组引物为F2R3，即本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对。
实施例2 4型鹦鹉博尔纳病毒N基因RT-RAA检测引物对验证
以Pabv-4 N基因阳性标准质粒（GenBank登录号JX065209.1）为模板，反应体系为：正向引物F2（10 μM）1.0 μL，反向引物R3（10 μM）1.0 μL，ddH2O 6.0 μL，2× Es TaqMasterMix 10.0μL，模板2 μL。反应程序为：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃复性30s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸2 min。将得到的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示，其中从左往右M、P和N泳道依次是Marker、Pabv-4 N基因质粒、ddH2O阴性对照。
由图2可知，本发明引物对PCR扩增片段对与预期结果一致，大小为203 bp。
实施例3
一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，包括引物对（SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2），还包括探针、RT-RAA反应干粉、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品。
该试剂盒中，探针的核苷酸序列如下所示：
5’-AGAGCTTTACCACAGTGTCACTCCGAGTCT[FAM-dT][THF][BHQ-dT]CTTCTTGTGCTTGCT-[C3Spacer]-3’；
其中，[FAM-dT]是标记FAM荧光基团的T碱基，[THF]是重组酶的识别位点四氢呋喃，[BHQ-dT]是标记BHQ1淬灭基团的T碱基，[C3-spacer]是生物阻断素。
该试剂盒中，阳性对照品包括4型鹦鹉博尔纳病毒核酸，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
该试剂盒中，RT-RAA反应干粉包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix和氯化镁，A液为聚乙二醇，B液为醋酸镁，阴性对照品为ddH2O。RT-RAA反应干粉、A液和B液均为购自南宁壮博生物科技有限公司的货号为ZBA22001的RT-RAA核酸扩增试剂中的组分。
该试剂盒中，正向引物、反向引物和探针的摩尔配比为1:1:1。
实施例4
一种非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，该方法使用实施例3的试剂盒，包括以下步骤：
（1）按照AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量提取试剂盒（购自广州速研生物科技有限公司）的说明书步骤，提取待测样本基因组RNA，作为模板。
（2）配制反应体系：每个检测样品对应一个RT-RAA反应干粉管，每个RT-RAA反应管中各反应组分和所加入的体积如表1所示：
表1 RT-RAA反应体系
以SEQ ID NO.4所示的4型鹦鹉博尔纳病毒核酸为阳性对照，以ddH2O为阴性对照。将配制好的RT-RAA反应体系的反应管上下颠倒多次，充分混匀，800 rpm离心10 s使反应液全部离心至管底。
（3）将反应管放置于荧光定量仪中，39℃ 60 s；39℃ 30 s，40个循环，并收集荧光信号。
（4）扩增结束后，根据出峰时间或Ct值判定待检样本结果，判断标准如下：
阳性对照：有扩增曲线出现，或出峰时间≤20min或Ct值≤39，为有效结果；
阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间＞20min或Ct值＞39，为有效结果；
待测样本：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，可判断待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，可判断待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阴性。
本发明阳性对照品和阴性对照品的扩增结果，如图3所示，其中，由上到下分别为阳性对照、基线和阴性对照。
由图3可知，本发明的阳性对照品和阴性对照品均为有效结果。其中阴性对照的设计能有效验证所用试剂是否受到污染，避免假阳性发生，阳性对照的设计能有效验证所用试剂的有效性，避免假阴性的发生。
对比例1
待测样品为华南地区某鹦鹉养殖场提供的28份疑似感染4型鹦鹉博尔纳病毒的组织样品。
（1）按照动物组织总DNA/RNA提取试剂盒（DP431）（广州斯佳生物科 技有限公司）的说明书步骤提取待测样本基因组RNA，进行RT-PCR检测。
其中，RT-PCR引物序列为Pabv-F：5’-AATGCCACCCAAAAGACAAAG-3’（SEQ IDNo.11），Pabv-R：5’- AAACTGCCAACCTCCTCT-3’(SEQ ID No.12）。
RT-PCR的反应程序为：50℃ 30 min，94℃ 30 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸1min。
RT-PCR的反应体系为：Pabv-F(10 µM) 2.0 µL，Pabv-R(10 µM) 2.0 µL，ddH2O16.5 µL，2× One Step Mix 25 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，模板2μL。
（2）使用本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法对待测样品进行RT-RAA检测，步骤同实施例4。
RT-PCR和RT-RAA检测结果如表2所示。
表2样品检测结果
由表2可知，本发明RT-RAA检测结果与RT-PCR检测结果高度一致，本发明方法具有良好的特异性和稳定性。而且本发明方法在30 min内完成检测，具有操作简便、成本低的特点，适合于现场移动检测，具有RT-PCR检测方法不具备的优势。
试验例1 检测灵敏度验证
由生工构建4型鹦鹉博尔纳病毒N基因阳性标准质粒（GenBank登录号JX065209.1），将构建好的阳性标准质粒进行10倍倍比稀释，分别以105copies/μL、104copies/μL、103copies/μL、102copies/μL和10 copies/μL5个浓度的阳性标准质粒为模板，并且以ddH2O为阴性对照，分别取5 μL作为反应模板，按照实施例4所述步骤进行RT-RAA核酸扩增。本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法灵敏度结果如图4所示。
由图4可知，5个浓度的阳性标准质粒检测结果均为Ct值≤39，可判断为4型鹦鹉博尔纳病毒阳性，因此本发明的引物对和探针能检测的最低浓度为10 copies/μL的模板，具有检测灵敏度高的优点。
试验例2 检测特异性验证
以4型鹦鹉博尔纳病毒核酸为阳性对照（SEQ ID NO.4所示），ddH2O为阴性对照，分别对H5N6、H7N9、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒的核酸进行检测，按照实施例4所述步骤进行RT-RAA核酸扩增。本发明检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法特异性结果，如图5所示。
由图5可知，4型鹦鹉博尔纳病毒阳性对照模板对应的试验组出现了正常荧光检测曲线，其他病毒的试验组及阴性对照组均未出现扩增曲线。结果表明，本发明的引物对和探针可以实现对4型鹦鹉博尔纳病毒的特异性检测，与H5N6、H7N9、H9N2禽流感病毒、新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒的核酸均无交叉反应。
综上所述，本发明所提供的引物对及试剂盒可以快速、方便、高效、特异地检测样本中是否含有4型鹦鹉博尔纳病毒，并能辅助诊断是否为4型鹦鹉博尔纳病毒感染，适宜于临床的鉴别检测、动物疫病检测和净化。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (10)
1. 一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对，其特征在于，所述引物对正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对在制备检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.一种检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒N基因的引物对。
4.如权利要求3所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，其特征在于，还包括探针、RT-RAA反应干粉、A液、B液、阳性对照品和阴性对照品。
5. 如权利要求4所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述阳性对照品包括4型鹦鹉博尔纳病毒核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6. 如权利要求4所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，其特征在于，所述RT-RAA反应干粉包括重组酶、单链结合蛋白、聚合酶、ATP、dNTP Mix和氯化镁；所述A液为聚乙二醇；所述B液为醋酸镁；所述阴性对照品为ddH2O。
7.一种非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，其特征在于，使用权利要求3-6任一项所述的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的试剂盒，包括以下步骤：
（1）提取待测样本的RNA作为模板；
（2）使用所述试剂盒中的试剂，配制反应体系，充分混匀后，离心至管底；
（3）将步骤（2）操作的反应体系置于荧光定量仪中，设置反应程序进行RT-RAA反应，并收集荧光信号；
（4）结果判定：若出峰时间≤20min或Ct值≤39，则待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阳性；若出峰时间＞20min或Ct值＞39，则待测样本为4型鹦鹉博尔纳病毒阴性。
8. 如权利要求7所述的非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述反应体系中RT-RAA反应干粉、聚乙二醇、醋酸镁、正向引物、反向引物、探针、RNA模板和ddH2O质量体积比为15 mg:25 μL:2.5 μL:2 μL:2 μL:0.6 μL:5 μL:12.9 μL。
9. 如权利要求7所述的非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述RT-RAA的反应程序为39℃ 60 s；39℃ 30 s，40个循环。
10. 如权利要求8所述的非诊断目的检测4型鹦鹉博尔纳病毒的方法，其特征在于，所述正向引物和反向引物浓度均为10 μmol/L；所述探针的浓度为10 μmol/L。
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