CN110801436B - 一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂及二联活疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂及二联活疫苗，该冻干保护剂由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖20‑28％、明胶6‑10％、胰蛋白胨2‑6％、酵母浸粉1‑3％、硫酸软骨素0.1‑2％和肌醇1‑5％，余量为注射用水，质量体积比的单位是g/ml，该二联活疫苗包括含有该冻干保护剂，该保护剂可有效解决现有的冻干制品表面有凹陷和裂纹，冻干制品溶解速度慢以及冻干后效价损失的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂及二联活疫苗。
背景技术
冻干疫苗主要由抗原和冻干保护剂组成，抗原可以包括蛋白、病毒、细菌等。目前，兽用冻干疫苗的市场应用较为普遍。虽然冻干疫苗具有保存方便、可集中批量生产等优点，但其冻干工艺或冻干效果也存在一些问题，因而制约了冻干苗的发展。抗原保存和疫苗冻干过程中病毒粒子或细菌的失活是制约疫苗质量的重要因素之一。
为了保持冻干疫苗中病毒或细菌的免疫反应性，减少冷冻干燥对病毒或细菌的破坏，在制作冻干活疫苗时需添加冻干保护剂，保证疫苗制品中抗原的免疫原性和免疫反应性有良好效果。
由于冻干过程时间较长，病毒或细菌的活性会受其中冻干保护剂的物理化学变化的影响，因而增加了冻干保护剂配方的复杂性。常用的冻干保护剂按其作用机理可分为如下几类：防冻剂，如甘油、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、二甲亚砜、蔗糖等；抗氧化剂，如维生素C、维生素E、硫代硫酸钠等；填充剂，如甘露醇、乳糖、明胶等；pH调节剂，如磷酸、山梨醇、EDTA、氨基酸等；其他物质，如葡聚糖、脱脂乳、谷氨酸钠、硫脲等。
采用现有的冻干保护剂制得的冻干疫苗存在表面不平整，有凹陷和裂纹的情况，而且，该疫苗在使用溶解时，溶解速度较慢，冻干毒价会产生损失。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂及二联活疫苗，该保护剂可有效解决现有的冻干制品表面有凹陷和裂纹，冻干制品溶解速度慢以及冻干后效价损失的问题。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖20-28％、明胶6-10％、胰蛋白胨2-6％、酵母浸粉 1-3％、硫酸软骨素0.1-2％和肌醇1-5％，余量为注射用水，所述质量体积比的单位是g/ml。
进一步地，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂。
进一步地，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂与所述混合病毒液按照4-8:1的体积比混合制成。
进一步地，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂与所述混合病毒液按照7:1的体积比混合制成。
本发明所产生的有益效果为：
使用本发明中的冻干保护剂制得的冻干疫苗成疏松饼块状，表面光滑、无凹陷和裂纹，复溶时的溶解速度较快，一般1分钟内便可溶解完全，而且，使用该冻干保护剂以后，病毒的毒价损失较少，疫苗在2-10℃条件下可保存长达 18个月。
本发明的冻干保护剂中调整了蔗糖和明胶的占比，以降低冻干保护剂复溶后的浓度，加速冻干疫苗的溶解速度，减少冷冻干燥后疫苗表面出现凹陷和裂纹情况发生；该冻干保护剂中添加有肌醇、胰蛋白胨和酵母浸粉，三者联合使用可在病毒表面形成一层保护膜，在冻干失水过程中，对病毒起到保护作用，防止病毒自身的蛋白质变性，减少毒价损失，同时，还能起到缓冲作用，减小 pH值变化，进而减少对病毒造成的损伤。酵母浸粉中还含有大量的营养物质，可满足病毒的营养需求。该冻干保护剂中还添加有硫酸软骨素，酵母浸粉和胰蛋白胨内的蛋白质与硫酸软骨素以共价键结合，通过硫酸软骨素将病毒连接起来，提高病毒的稳定性，进一步在冻干过程中提高对病毒的保护作用。
具体实施方式
实施例1
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖20％、明胶6％、胰蛋白胨2％、酵母浸粉1％、硫酸软骨素0.1％和肌醇1％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为4:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照4:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
实施例2
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖28％、明胶10％、胰蛋白胨6％、酵母浸粉3％、硫酸软骨素2％和肌醇5％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为8:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照8:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
实施例3
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例1
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、大豆分离蛋白4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与疫苗冻干保护剂的体积比为9:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照9:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例2
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗，的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例3
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％和硫酸软骨素1.5％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例4
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例5
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖40％、明胶10％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例6
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖18％、明胶14％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
对比例7
一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖40％、明胶20％，余量为注射用水。
一种二联活疫苗，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和上述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其中，混合病毒液与冻干保护剂的体积比为7:1。
上述二联活疫苗的制备过程为：(1)将冻干保护剂中的各组分混匀溶解，然后进行灭菌处理；(2)将猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒等量混合，制得混合病毒液；(3)将冻干保护剂与混合病毒按照7:1的体积比混合，然后进行冻干处理，即可。
试验例
分别对实施例1-3和对比例1-7制得的二联活疫苗进行检验，具体检验标准和检验方法如下：
1、性状：黄白色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。
2、效力检验：两种方法任选其一
2.1病毒含量的测定
2.1.1猪传染性胃肠炎病毒含量测定：用MEM营养液将疫苗稀释至1头份 /ml，与等量猪流行性腹泻病毒的特异性血清混合均匀，置37℃水浴中和30min 后，用MEM营养液将中和后的疫苗液作10倍系列稀释，取稀释度为10-3、10-4、 10-5、10-6 4个稀释度，接种于已生长良好的ST细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养96～120h，观察细胞病变，按Reed-Muench 法计算TCID50，每头份病毒含量应≥105.5TCID50。
2.1.2猪流行性腹泻病毒含量测定：用MEM营养液将疫苗稀释至1头份/ml，与等量猪传染性胃肠炎病毒的特异性血清混合均匀，置37℃水浴中和30min后，用MEM营养液将中和后的疫苗液作10倍系列稀释，取稀释度为10-3、10-4、10-5、 10-6 4个稀释度，接种于已生长良好的Vero细胞单层的96孔培养板，每个滴度接种8孔，37℃、5％CO2培养96～120h，观察细胞病变，按Reed-Muench法计算TCID50，每头份病毒含量应≥105.3TCID50。
2.2免疫攻毒法
将14～21日龄仔猪20头，随机分为2组，每组10头，一组为免疫组，一组为对照组。将疫苗稀释至1头份/ml，免疫组分别颈部肌肉接种1.0ml，对照组仔猪接种1.0ml生理盐水。
猪传染性胃肠炎部分：免疫接种14日后，从免疫组和对照组各选取5头仔猪，分别口服猪传染性胃肠炎病毒JY株组织毒1.0ml(含103.0MID)，观察7日。对照猪至少4头发病，免疫猪至少4头保护。
猪流行性腹泻部分：免疫接种14日后，将免疫组和对照组各5头仔猪分别口服猪流行性腹泻病毒SZ株组织毒1.0ml(含103.0MID)，观察7日。对照猪至少4头发病，免疫猪至少4头保护。
对上述实施例所获得的产品进行检验，检验依据《中国兽药典》2015版标准进行，具体结果见表1。
表1：二联活疫苗检测表
通过上表得知，按照本发明实施例1-3中的方法制得的二联活疫苗，其中 TGEV冻干损失0.1-0.2，PEDV冻干损失0.2-0.3，而按照对比例1-7中的方法制得的冻干疫苗，其中的TGEV冻干损失0.4-0.6，PEDV冻干损失0.3-0.6，可见，实施例1-3中病毒的损失小于对比例1-7中的损失，且实施例1-3中的冻干疫苗表面光滑无凹陷和裂痕，冻干疫苗内部呈海绵状疏松团块，溶解快速。
Claims (5)
1.一种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其特征在于，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖20-28％、明胶6-10％、胰蛋白胨2-6％、酵母浸粉1-3％、硫酸软骨素0.1-2％和肌醇1-5％，余量为注射用水，所述质量体积比的单位是g/ml。
2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂，其特征在于，由以下质量体积百分比的组分组成：蔗糖24％、明胶8％、胰蛋白胨4％、酵母浸粉2％、硫酸软骨素1.5％和肌醇3％，余量为注射用水。
3.一种二联活疫苗，其特征在于，包括含有猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒的混合病毒液和权利要求1-2中任一项所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂。
4.如权利要求3所述的二联活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂与所述混合病毒液按照4-8:1的体积比混合制成。
5.如权利要求4所述的二联活疫苗，其特征在于，所述猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗冻干保护剂与所述混合病毒液按照7:1的体积比混合制成。
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