CN114931648B - 一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用，属于生物医药领域中活疫苗耐热保护剂技术领域。提供的耐热保护剂包含5‑10重量份的蔗糖、5‑10重量份的麦芽糊精、0.5‑1重量份的抗坏血酸、1‑3重量份的聚乙烯吡咯烷酮、1‑3重量份的甘氨酸、1‑2重量份的羧甲基纤维素和3‑5重量份的胰蛋白胨，其成分简单、原料易得，利用其配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂时可以有效减少冷冻干燥过程中各病毒抗原的损失，并可确保猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂的免疫效力和长期稳定保存。

Description

一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂 及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域中活疫苗耐热保护剂技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒感染引起的一种高度接触性急性传染性疾病，该种疾病传播速度较快，年龄越小的猪潜伏期越短，通常在潜伏12-24h后会出现典型的临床症状，最长潜伏期在4d左右。养殖场出现个别患病病例后，通常经历3-4d能快速爆发流行，在出现临床症状10d左右会进入流行高发期，之后呈现逐渐缓和的态势。
猪流行性腹泻病毒的发生流行具有典型季节性，是冬春季节高发的一类病毒性传染性疾病。不同年龄不同品种的猪对流行性腹泻病毒均具有很强异感性，哺乳仔猪、断奶仔猪发病率有时高达100％，成年猪群的发病率通常在15％-20％。哺乳阶段的仔猪受到病毒感染后，所表现的死亡率最高，有时死亡率在50％以上。
为预防猪传染性胃肠炎和/或猪流行性腹泻疾病在猪场的蔓延，需要对猪只提前接种疫苗(目前通常为活疫苗，例如猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗)。然而，由于猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均不耐热，60℃30min可使病毒丧失感染力，因此当活疫苗中的冻干保护剂(或称为耐热保护剂)的保护效力不足时，会容易导致疫苗在生产过程中以及在接种之前的保存期发生病毒抗原的损失，进而会导致疫苗的免疫效力不足。因此，开发一种耐热保护效果好的冻干保护剂是获得免疫效力足且保存期长的活疫苗的关键。专利文献CN106729731A(以下称文献1)已经公开一种用于猪传染性胃肠炎、流行性腹泻二联活疫苗的疫苗耐热保护剂，其按照重量配比包括明胶6％-12％、海藻糖1％-8％、蔗糖20％-30％、胰蛋白胨6％-15％、水解乳蛋白1％-8％、酶解酪蛋白5％-20％、硫脲1％-5％、甘氨酸0.1％-3％、右旋糖酐0.1％-2％和甘露醇0.1％-2％。虽然该文献1提供的耐热保护剂能够减少病毒抗原在冻干过程中的损失(几乎无损失)，但是将该文献1配制的疫苗置于37℃保存7天后病毒抗原的损失仍较多(最低损失0.4个滴度/ml，最高损失0.8个滴度/ml)，因此该文献1提供的耐热保护剂对疫苗的保护效果仍有不足，并且该文献1没有公开其耐热保护剂对疫苗的长期(例如2-8℃下保存24个月)保护效果。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明的一个方面提供一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂，其按重量份计包含以下组分：
在一些实施方式中，所述耐热保护剂按重量份计包含以下组分：
本发明另一方面提供一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂，其按重量体积百分比含量(％，单位为g/100ml)计包含以下组分：
其余为注射用水。
在一些实施方式中，所述耐热保护剂按重量体积百分比含量计包含以下组分：
其余为注射用水。
本发明另一方面还提供一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1)第一溶液配制：将所需量的羧甲基纤维素溶于注射用水中得到第一溶解液；向所述第一溶解液中加入所需量的蔗糖和麦芽糊精至完全溶解，得到第二溶解液；随后向所述第二溶解液中加入所需量的胰蛋白胨至完全溶解，获得第一溶液；
S2)第二溶液配制：将所需量的甘氨酸溶于注射用水中得到第三溶解液；向所述第三溶解液中加入所需量的聚乙烯吡咯烷酮至完全溶解得到第四溶解液；随后向所述第四溶解液中加入所需量的抗坏血酸至完全溶解，并将pH调整至7.1-7.3，得到第二溶液；
S3)将所述第一溶液和第二溶液混合，获得所述耐热保护剂。
在一些实施方式中，步骤S3)中在将所述第一溶液和第二溶液混合之前，对所述第一溶液进行灭菌，可选在116℃下高压灭菌20-30min；并对所述第二溶液进行除菌，可选使用0.22μm滤膜进行过滤除菌。
本发明再一方面提供一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其由猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液和上述的耐热保护剂配制而成。
在一些实施方式中，所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与所述耐热保护剂的溶液的体积配比为(2-3):1，优选3:1。
在一些实施方式中，所述二联活疫苗制剂在使用时，猪流行性腹泻病毒含量≥106.00TCID50/ml，可选为106.25-107.00TCID50/ml，猪传染性胃肠炎病毒含量≥106.00TCID50/ml，可选为106.50-107.50TCID50/ml。
在一些实施方式中，所述二联活疫苗制剂在37℃下保存7日后病毒抗原含量最多下降100.50TCID50/ml，在2-8℃下保存24个月后病毒抗原含量最多下降100.50TCID50/ml。
本发明的再一方面还提供一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂的配制方法，其包括以下步骤：
T1)将混合的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与上述的耐热保护剂的溶液按体积比(2-3):1，优选3:1混匀，得到疫苗原液；
T2)将步骤T1)的疫苗原液冷冻干燥，获得所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗。
在一些实施方式中，步骤T2)中，所述冷冻干燥的工艺为：
(1)预冻阶段：将所述疫苗原液在20min内由常温降温至-20℃，在-20℃保持1h，在20-40min内降温至-40℃～-45℃，在-40℃～-45℃保持3-5h，所述疫苗原液完全冻结后转入抽真空阶段；
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100-120mT，转入升华干燥阶段；
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-40℃～-45℃升至-20℃并维持8-10h，20min内将板层温度由-20℃升至-10℃并维持6-8h，20min内将板层温度由-10℃升至0℃并维持4-6h，随后转入解析干燥阶段；
(4)解析干燥阶段：将板层温度在1-2h内升温到28℃-30℃，保温6-8h。
基于以上技术方案提供的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂包含适宜量的蔗糖、麦芽糊精、羧甲基纤维素、胰蛋白胨、甘氨酸和聚乙烯吡咯烷酮等成分。一方面，该耐热保护剂的成分简单、原料易得；另一方面，这些成分的组合使得使用该耐热保护剂配制的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗在冻干后能够保持各病毒抗原原有的理化特性和生理活性，且各病毒抗原有效成分损失均极少(冻干后病毒含量最多仅下降100.50TCID50/ml，最少可达到抗原不损失)，冻干后疫苗疏松多孔，含水量低，可以使猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗易于复水而恢复活性；再一方面，相对于上述文献1，本发明提供的耐热保护剂对疫苗的耐热保护效果更好，且更有利于疫苗的长期稳定保存，例如本发明的耐热保护剂使得疫苗在37℃下保存7日后病毒抗原含量最多仅下降100.25TCID50/ml(即0.25个滴度/ml，下同)，在2-8℃下保存24个月后病毒抗原含量最多仅下降100.50TCID50/ml，因此该耐热保护剂具有良好的耐热保护效果，可以确保猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗能够长时间稳定保存，且不会明显影响疫苗的免疫效力。
本发明在配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗时为降低在冷冻干燥过程中所引起的病毒含量损失，依据各种影响因素综合考虑，设计并优化确定了理想的冻干曲线，使得配制得到的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗在冻干外型、剩余水份含量及病毒冻干前后病毒抗原滴度损失方面均具有良好的效果。并且实施例结果还验证了配制的二联活疫苗能够确保猪只的安全性。
综上所述，本发明提供的耐热保护剂不仅可确保猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗应有的免疫效力水平，而且具有较好的耐热保护效果，还可确保实验猪的安全性，可满足市场用户的需求，具有良好的经济效益及社会效益，应用前景广阔。
附图说明
图1为利用实施例中保护剂4配制的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的分装冻干后照片。
具体实施方式
本发明旨在提供一种耐热保护效果好的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的耐热保护剂，以确保猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗可以长时间稳定保存，并保持其良好的免疫效力水平和安全性。还基于该耐热保护剂提供了一种免疫效力好、安全性高且可以长时间稳定保存的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗及其配制方法。
通过以下具体实施例详细说明本发明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例中描述耐热保护剂的成分含量时，术语“％”表示质量体积百分比，单位是“g/100ml”。
实施例中术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”等适用于区分类似的对象，不作为特定顺序或先后次序的限定，也不作为对象个数的限定。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但不应作为对本发明内容的限制。
以下实施例中使用的化学物质中，麦芽糊精：购自罗盖特Roquette公司；羧甲基纤维素购自国药公司；蔗糖、抗坏血酸等均购自天津科盟化工公司；甘氨酸：购自Sigma公司；胰蛋白胨购自OXOID公司；聚乙烯吡咯烷酮：购自沃凱公司。
实施例1：制备猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂
该实施例旨在制备用于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的耐热保护剂，该耐热保护剂的作用是对疫苗有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段实施保护以保证疫苗的免疫效果，该耐热保护剂的制备方法具体包括以下步骤：
S1)第一溶液配制：按照下表1所示的耐热保护剂(耐热保护剂1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的成分含量(其中％表示质量体积百分比含量，即g/100ml，下同)，分别精密称取所需量的羧甲基纤维素于定量注射用水中，期间置60℃水浴加热并不停搅拌至完全溶解，得到第一溶解液；再分别称取蔗糖、麦芽糊精加入第一溶解液中至完全溶解，得到第二溶解液；随后精密称取胰蛋白胨加入第二溶解液中，置60℃水浴加热并不停搅拌将其溶解，获得第一溶液；
S2)第二溶液配制：按照下表1所述的各耐热保护剂的成分含量，分别精密称取甘氨酸于定量去注射水中，置60℃水浴，同时不停晃动直至完全溶解，得到第三溶解液；再精密称取所需量的聚乙烯吡咯烷酮于第三溶解液中使其完全溶解，得到第四溶解液；随后精密称取抗坏血酸加入到第四溶解液中，置60℃水浴，同时不停晃动将其溶解，并利用7.5％碳酸氢钠溶液将pH至调整至7.1-7.3，获得第二溶液；
S1)和S2)在加入每一组分溶解时，最好逐渐增加溶质的量，避免出现过饱和现象，以及避免出现溶解不彻底的情况。
S3)将第一溶液定容后在高压灭菌柜中灭菌(116℃高压20-30min)和第二溶液定容(与定容后的第一溶液相同的体积)后过滤除菌(0.22μm滤膜)，将第一溶液和第二溶液按体积1:1比例混合，获得所述耐热保护剂。按表1组分获得的耐热保护剂分别命名为保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4、保护剂5、保护剂6、保护剂7、保护剂8、保护剂9、保护剂10和保护剂11，37℃保存备用。
表1：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂的组成及含量
实施例2：配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂
该实施例利用上述实施例1制备的保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4、保护剂5、保护剂6、保护剂7、保护剂8、保护剂9、保护剂10和保护剂11分别作为猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的耐热保护剂，以配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，二联活疫苗制剂的配制方法包括以下步骤：
2.1、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液的制备
2.1.1、制备猪流行性腹泻病毒毒液
猪流行性腹泻病毒病毒液繁殖：取生长良好的Vero细胞(金宇保灵生物药品有限公司提供)单层，弃掉生长液，用0.25％胰酶消化液消化长满单层的Vero细胞，按1:3-1:4进行分散，37℃扩大培养。将扩大培养的Vero细胞接种到转瓶中，37℃培养48-72小时，转速为8-9转/小时，转瓶细胞长成良好单层，弃掉细胞培养液，将病毒含量≥106.00TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒毒种，按维持液2％的比例进行接种猪流行性腹泻病毒ZJ08株(金宇保灵生物药品有限公司提供)，37℃吸附1小时，补足细胞维持液(含10μg/ml的胰酶)，37℃培养48-72小时，当出现80％以上细胞病变时，收获病毒液，置-40℃以下保存，待检备用。
2.1.2、制备猪传染性胃肠炎病毒毒液
猪传染性胃肠炎病毒病毒液繁殖：取生长良好的ST细胞(金宇保灵生物药品有限公司提供)单层，弃掉生长液，消化细胞，将细胞悬液按照2.1×105个/ml接种至反应器，载体用量为2-5g/L，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、pH值7.1)，待细胞长满单层后按维持液2％比例接种猪传染性胃肠炎HB08株(金宇保灵生物药品有限公司提供)，设定反应器参数(温度37℃、溶氧45％-60％、pH值7.1)。待出现80％左右细胞病变时，收获病毒液，置-40℃以下保存，待检备用。
2.1.3、病毒含量测定
对2.1.1和2.1.2收获的病毒液的病毒含量进行测定，测定结果见下表2。
表2：病毒含量及感染性测定结果
2.2、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗抗原原液的获取
按冻干后的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的每头份疫苗中猪流行性腹泻病毒含量≥106.00TCID50/ml，猪传染性胃肠炎病毒含量≥106.00TCID50/ml，计算出猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液的配苗用量，按照计算出的配苗用量混合获得疫苗抗原原液。该实施例中直接将上述步骤2.1制备的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒液按照体积比为1:1比例混合，得到疫苗病毒抗原原液(即混合的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液，其中两种病毒的病毒抗原含量大约为：猪流行性腹泻病毒含量为约107.00TCID50/ml，猪传染性胃肠炎病毒含量约为107.25TCID50/ml)；
2.3、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂原液的配制
取上述步骤2.2获得的疫苗病毒抗原原液分别与实施例1获得的十种耐热保护剂(保护剂1、保护剂2、保护剂3、保护剂4、保护剂5、保护剂6、保护剂7、保护剂8、保护剂9、保护剂10和保护剂11)分别按照体积比为2:1和3:1混合均匀，具体操作为将疫苗病毒抗原原液匀速加入盛放耐热保护剂的储液瓶内，人工缓慢混匀15min左右(避免产生过多的泡沫)，即可配制获得疫苗制剂原液；
2.4、猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗冻干制剂的制取
用移液器将步骤2.3获得的疫苗制剂原液按3ml/瓶分装，随后冷冻干燥，即可制取得到猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗冻干制剂；其中冷冻干燥的冻干曲线以冷冻干燥3ml疫苗制剂原液计为：
(1)预冻速度：工艺选择在疫苗制剂原液(以下步骤泛称“产品”)进箱后再将冻干箱降温的慢冻速率。
(2)预冻的最低温度：根据疫苗制剂原液中所有组分的共晶点温度-20℃，将预冻最低温度低于此温度。
(3)预冻时间：预冻阶段：将疫苗制剂原液在20min内由常温降温至-20℃，在-20℃保持1h，在20-40min内降温至-40℃～-45℃，在-40℃～-45℃保持3-5h，产品完全冻结后转入抽真空阶段；
(4)抽真空时间：预冻后立即进入降压阶段，并在20min内将真空度降到100-120mT，直到结束，转入升华干燥阶段。
(5)升华干燥阶段：真空度降到120mT时开始加热，此时开始处于升华干燥阶段。2h内将板层温度由-40℃～-45℃升至-20℃并维持8-10h，20min内将板层温度由-20℃升至-10℃并维持6-8h，20min内将板层温度由-10℃升至0℃并维持4-6h使产品形成初步型态，随后转入解析干燥阶段(使瓶内冻结产品自上而下逐渐升华，最终成型)。
(6)解析干燥阶段：产品完成升华干燥时己经形成初步型态，此时提高真空度，真空度设定为10mT，进而改进冻干箱内热量传递，即增加冻干箱内气体的对流传热，将板层温度在1-2h内升到28-30℃，维持6-8h。解析干燥阶段瓶内冻结产品自上而下逐渐升华，最终成型。
(7)冻干总时间：根据冻干机性能、疫苗特性及装量，将预冻时间、升华干燥阶段和解析干燥时间全过程确定为33-44h左右。
对该实施例制取的各猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的冻干前、后的病毒含量进行检测(冻干前检测对象为2.3配制的疫苗制剂原液，冻干后检测对象为2.4制取的疫苗冻干制剂，检测时用去离子水复溶至2.3配制的疫苗制剂原液的体积)，检测结果如下表3和表4所示。还按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法对该实施例配制的疫苗产品(活疫苗冻干制剂)进行了常规项目检测，如下表5所示。
表3：二联活疫苗制剂冻干前后猪流行性腹泻病毒含量的检测结果
表4：二联活疫苗制剂冻干前后猪传染性胃肠炎病毒含量的检测结果
表5：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂成品常规检测结果
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由上表3和表4检测结果可知，使用保护剂4-8配制得到的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂在冻干前后，其中的各病毒抗原含量下降较少，最多仅下降100.50TCID50/ml(即0.5个滴度/ml，下同)，其中使用保护剂4-6时仅下降100.25TCID50/ml，甚至病毒含量并未损失，因此保护剂4-8能够在冷冻干燥过程中有效减少猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂中的各病毒抗原的损失(甚至不损失)，获得效价水平较高的疫苗产品；另一方面，相对于2:1的抗原与保护剂的配比，当该配比为3:1时，在冻干过程中保护剂对疫苗的保护效果更佳。相对于保护剂4-8，保护剂1中不含有甘氨酸，二联活疫苗制剂冻干前后各病毒滴度下降均较多；保护剂2中不含有聚乙烯吡咯烷酮，二联活疫苗制剂在冻干前后各病毒滴度下降也较多；保护剂3中不含有麦芽糊精，二联活疫苗制剂在冻干前后各病毒滴度下降也较多。虽然保护剂9-10包含与保护剂4-8相同的成分，但各成分的含量不同，也使得由保护剂9-10制取获得的二联活疫苗制剂冻干前后各病毒滴度下降均较多。保护剂11中使用等量的精氨酸代替甘氨酸，虽然精氨酸和甘氨酸都属于氨基酸类稳定剂，但是由保护剂11制得的二联活疫苗制剂冻干前后各病毒滴度下降均较多。
根据上表5的检测结果，可见使用保护剂4-8获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗在冻干后呈淡黄色或淡粉色海绵状疏松团块，且易与瓶壁脱离(图1示出了使用保护剂4的经分装(4瓶)、冷冻干燥之后获得的二联活疫苗冻干产品的照片)，含水量均在2.0％以下，能够迅速溶解于水中，因此制取得到的疫苗产品具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性；另一方面，相对于2:1的抗原与保护剂的配比，当配比为3:1时的冻干后含水量更低。当抗原与保护剂的配比为2:1时，使用保护剂1-3和保护剂9-11制取获得的疫苗制剂在冻干后含水量均超过2.0％，且使用保护剂1和保护剂11制取获得的疫苗制剂在冻干后均出现底部稍有萎缩、熔化的情况；当抗原与保护剂的配比为3:1时，用保护剂1、3和11制取获得的疫苗制剂在冻干后含水量均超过2.0％，且使用保护剂1、2、10和11制取获得的疫苗制剂在冻干后均出现底部稍有萎缩、熔化的情况。
综上可见，本发明提供的耐热保护剂中甘氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和麦芽糊精等成分对耐热保护剂的效果均具有重要的作用，并且通过适量配比的多种成分共同作用才得以在冷冻干燥过程中有效减少猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂中各病毒抗原含量的损失，获得效价水平较高，且具有较佳的冻干外型、较低的水分含量和良好的溶解特性的疫苗产品。在该耐热保护剂中，聚乙烯吡咯烷酮可以通过与糖类间的氢键作用并改变糖类的玻璃化温度而对病毒抗原等大分子物质发挥非特异性保护作用，同时它也可以充当一种非渗透保护剂；甘氨酸属于氨基酸类稳定剂，在耐热保护剂中可抑制病毒抗原等大分子物质的氧化和聚集，并可提高疫苗制品的塌陷温度进而防止塌陷带来的冻干失败；麦芽糊精在冻干过程和储存期间为无定形态，性质稳定，可以作为填充稳定剂存在。
该实施例还对以保护剂4和保护剂7分别作为疫苗耐热保护剂配制获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》检验规程文献中记载的方法进行了耐老化试验，其中具体为：将猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂置37℃7日，以及在2-8℃保存24个月，检测疫苗产品中各病毒含量的变化情况，检测结果如下表6和表7所示。
表6：耐老化试验猪流行性腹泻病毒检测结果(TCID50/ml)
表7：耐老化试验猪传染性胃肠炎病毒结果(TCID50/ml)
由上表6和表7的检测结果可知，以保护剂4和保护剂7分别作为耐热保护剂配制获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂无论是按照抗原:保护剂为2:1，还是3:1，该疫苗在37℃条件下保存7天后的各病毒滴度下降均未超过100.50TCID50/ml，下降最多的也仅为100.25TCID50/ml；两种疫苗在2-8℃条件下保存24个月后的各病毒滴度下降均未超过100.50TCID50/ml。以保护剂5、6和8作为耐热保护剂配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂时，配制获得的疫苗制剂也同样能够实现类似于上表6和7的耐老化效果。因此，本发明提供的耐热保护剂具有良好的耐热保护效果，可以保证使用其的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂能够稳定长期保存，且有效抑制其中各病毒滴度的下降，从而保证各病毒抗原的免疫效力。
综上结果，本发明确定的耐热保护剂可包含以下按重量份计的组分：蔗糖5-10重量份、麦芽糊精5-10重量份、抗坏血酸0.5-1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1-3重量份、甘氨酸1-3重量份、羧甲基纤维素1-2重量份和胰蛋白胨3-5重量份；优选包含以下组分：蔗糖8-10重量份、麦芽糊精6-8重量份、抗坏血酸0.5-1重量份、聚乙烯吡咯烷酮1-3重量份、甘氨酸1-3重量份、羧甲基纤维素1-2重量份和胰蛋白胨3-5重量份。当本发明确定的耐热保护剂为溶液形式时，其可包含以下按质量体积百分比含量(％，单位是g/100ml)计的组分：蔗糖5％-10％、麦芽糊精5％-10％、抗坏血酸0.5％-1％、聚乙烯吡咯烷酮1％-3％、甘氨酸1％-3％、羧甲基纤维素1％-2％、胰蛋白胨3％-5％、其余为注射用水；优选包含以下组分：蔗糖8％-10％、麦芽糊精6％-8％、抗坏血酸0.5％-1％、聚乙烯吡咯烷酮1％-3％、甘氨酸1％-3％、羧甲基纤维素1％-2％、胰蛋白胨3％-5％、其余为注射用水。
实施例3：制取猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂的冻干曲线优化
该实施例利用实施例1获得的保护剂4作为耐热保护剂，按照与实施例2中步骤2.3相同的方法将实施例2中步骤2.2获得的疫苗病毒抗原原液与保护剂4按照体积比为3:1混合均匀，获得疫苗制剂原液；随后将疫苗制剂原液按照3ml/瓶分装后进行冷冻干燥处理，实验设计了多种冻干曲线，并从中筛选确定出理想的适宜于猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗的冻干曲线。以下以冻干曲线1和冻干曲线2(作为对照冻干曲线)比较说明冻干曲线的优化。
冻干曲线1：与实施例2中配制猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗所采用的冻干曲线相同；基于该冻干曲线1获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗命名为二联活疫苗1；
冻干曲线2(作为对照冻干曲线，所用疫苗制剂原液和用量与冻干曲线1相同)：冻干操作如下：
(1)预冻阶段：将疫苗原液在1h内降温至-40℃～-45℃，在-40℃～-45℃维持3-5h，产品完全冻结后转入抽真空阶段；
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100-120mT，随后转入升华干燥阶段；
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-40℃～-45℃升至-25℃并维持5-8h，20min内将板层温度由-25℃升至-15℃并维持8-10h，20min内将板层温度由-15℃升至-2℃并维持4-6h，随后转入解析干燥阶段；
(4)解析干燥阶段：将板层温度在1-2h内升温到28-30℃，保温6-8h。
基于该冻干曲线2获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂命名为二联活疫苗2。
按照与实施例2中相同的方法，分别对二联活疫苗1和二联活疫苗2冻干前后各病毒滴度下降情况以及疫苗成品常规项目进行检测，检测结果如下表8所示。
表8：疫苗制剂冻干后病毒滴度下降情况和成品常规项目检测结果
根据上表8检测结果可知，二联活疫苗1中的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒在冻干后病毒滴度最多仅下降100.25TCID50/ml，并且疫苗冻干后物理性状、溶解度、剩余水分均良好。而二联活疫苗2中的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒在冻干后病毒滴度最多下降100.75TCID50/ml(猪流行性腹泻病毒)，最少也为100.50TCID50/ml(猪传染性胃肠炎病毒)，且冻干后物理性状稍差，疫苗底部发生轻微熔化，出现萎缩现象，溶解后出现少量颗粒。其中对于二联活疫苗中同一病毒，相对于二联活疫苗1，二联活疫苗2中的病毒滴度下降均相对较多。因此，本发明确定采用冻干曲线1不但可以减少猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂在冻干过程中病毒滴度的损失，而且能够提高产品质量(以疫苗冻干后的性状体现)。
实施例4：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂安全性试验
该实施例以上述实施例2中以保护剂6作为耐热保护剂、以抗原和保护剂体积比为2:1和3:1分别配制获得的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂(分别命名为二联活疫苗3和二联活疫苗4)作为实验组，以灭菌生理盐水作为对照组，分别肌肉接种3-5周龄健康易感仔猪5只，每只3ml，连续观察14日，如下表9所示，各组实验猪均无异常反应，表明本发明配制的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂具有良好的安全性。
表9：猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂安全性试验结果
疫苗 接种剂量(ml/只) 周龄 每组接种数量(只) 检测结果
二联活疫苗3 3 3-5 5 5/5正常
二联活疫苗4 3 3-5 5 5/5正常
灭菌生理盐水 3 3-5 5 5/5正常
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应属于本发明公开内容。

Claims (12)

1.一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂在冷冻干燥所述二联活疫苗时使用，且由以下组分组成：
2.根据权利要求1所述的耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂由以下组分组成：
3.一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂在冷冻干燥所述二联活疫苗时使用，且按重量体积百分比含量计包含以下组分，其中％的单位为g/100ml：
其余为注射用水。
4.根据权利要求3所述的耐热保护剂，其特征在于，所述耐热保护剂按重量体积百分比含量计包含以下组分：
其余为注射用水。
5.权利要求3或4所述的耐热保护剂的制备方法，其包括以下步骤：
S1)第一溶液配制：将所需量的羧甲基纤维素溶于注射用水中得到第一溶解液；向所述第一溶解液中加入所需量的蔗糖和麦芽糊精至完全溶解，得到第二溶解液；随后向所述第二溶解液中加入所需量的胰蛋白胨至完全溶解，获得第一溶液；
S2)第二溶液配制：将所需量的甘氨酸溶于注射用水中得到第三溶解液；向所述第三溶解液中加入所需量的聚乙烯吡咯烷酮至完全溶解得到第四溶解液；随后向所述第四溶解液中加入所需量的抗坏血酸至完全溶解，并将pH调整至7.1-7.3，得到第二溶液；
S3)将所述第一溶液和第二溶液混合，获得所述耐热保护剂。
6.一种猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其由猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液和权利要求1或2或3或4所述的耐热保护剂配制而成；
其中所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与所述耐热保护剂的溶液的体积配比为(2-3):1；并且
其中所述配制的方法包括以下步骤：
T1)将混合的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与所述耐热保护剂的溶液按体积比(2-3):1混匀，得到疫苗原液；
T2)将步骤T1)的疫苗原液冷冻干燥，获得所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗；其中所述冷冻干燥的工艺为：
(1)预冻阶段：将所述疫苗原液在20min内由常温降温至-20℃，在-20℃保持1h，在20-40min内降温至-40℃～-45℃，在-40℃～-45℃保持3-5h，所述疫苗原液完全冻结后转入抽真空阶段；
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100-120mT，转入升华干燥阶段；
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-40℃～-45℃升至-20℃并维持8-10h，20min内将板层温度由-20℃升至-10℃并维持6-8h，20min内将板层温度由-10℃升至0℃并维持4-6h，随后转入解析干燥阶段；
(4)解析干燥阶段：将板层温度在1-2h内升温到28℃-30℃，保温6-8h。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其特征在于，所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与所述耐热保护剂的溶液的体积配比为3:1。
8.根据权利要求6或7所述的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其特征在于，所述二联活疫苗制剂在使用时，猪流行性腹泻病毒含量≥106.00TCID50/ml，猪传染性胃肠炎病毒含量≥106.00TCID50/ml。
9.根据权利要求8所述的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其特征在于，所述二联活疫苗制剂在使用时，猪流行性腹泻病毒含量为106.25-107.00TCID50/ml，猪传染性胃肠炎病毒含量为106.50-107.50TCID50/ml。
10.根据权利要求6或7所述的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂，其特征在于，所述二联活疫苗制剂在37℃下保存7日后病毒抗原含量最多下降100.25TCID50/ml，在2-8℃下保存24个月后病毒抗原含量最多下降100.50TCID50/ml。
11.权利要求6-10中任一项所述的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗制剂的配制方法，其包括以下步骤：
T1)将混合的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与权利要求1或2或3或4提及的耐热保护剂的溶液按体积比(2-3):1混匀，得到疫苗原液；
T2)将步骤T1)的疫苗原液冷冻干燥，获得所述猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎二联活疫苗；
步骤T2)中，所述冷冻干燥的工艺为：
(1)预冻阶段：将所述疫苗原液在20min内由常温降温至-20℃，在-20℃保持1h，在20-40min内降温至-40℃～-45℃，在-40℃～-45℃保持3-5h，所述疫苗原液完全冻结后转入抽真空阶段；
(2)抽真空阶段：在20min内将真空度降到100-120mT，转入升华干燥阶段；
(3)升华干燥阶段：2h内将板层温度由-40℃～-45℃升至-20℃并维持8-10h，20min内将板层温度由-20℃升至-10℃并维持6-8h，20min内将板层温度由-10℃升至0℃并维持4-6h，随后转入解析干燥阶段；
(4)解析干燥阶段：将板层温度在1-2h内升温到28℃-30℃，保温6-8h。
12.根据权利要求11所述的配制方法，其特征在于，步骤T1)中所述混合的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒毒液与所述耐热保护剂的溶液的体积配比为3:1。
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