CN113652404B

CN113652404B - 一种猪圆环病毒的冻干保护剂及其在保藏中的应用

Info

Publication number: CN113652404B
Application number: CN202110983461.5A
Authority: CN
Inventors: 左晓昕; 吕芳; 冯磊; 赵艳红; 卢宇; 邓碧华; 王军宁; 揭鸿英
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2041-08-25
Also published as: CN113652404A

Abstract

本发明提供一种猪圆环病毒的冻干保护剂及其在保藏中的应用，属于兽医生物制品领域。上述猪圆环病毒的冻干保护剂，包括如下组分：麦芽糖醇1‑10%，乳糖醇2‑10%，β‑葡聚糖0.01‑1%，海藻糖0.5‑6%，聚乙烯吡咯烷酮K30 1‑6%，甘氨酸0.5‑4%，脯氨酸1‑4%，丝氨酸0.2‑2%，余量溶剂，pH为7.0～7.5。本发明冻干保护剂成分简单、配制方便，能够显著提高其在高温环境下的保存期限。因此，本发明冻干保护剂可以应用于猪圆环病毒的稳定保藏中，从而将稳定保藏后的病毒应用于疫苗和检测试剂盒的制备中，显著降低生产成本和程序。

Description

一种猪圆环病毒的冻干保护剂及其在保藏中的应用

技术领域

本发明属于兽医生物制品领域，具体涉及一种猪圆环病毒的冻干保护剂及其在保藏中的应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小动物病毒，是一种具有二十面体对称衣壳蛋白、无囊膜单股环状DNA病毒。1996年，加拿大学者从患断奶后仔猪多系统衰竭综合征的猪体内分离到PCV变异株，将其命名为PCV-2；2000年，我国猪场首次发现了PCV-2，该病原与多种疾病密切相关，如：猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪增生性坏死性肺炎以及猪繁殖障碍、A2型先天性震颤等，该病毒是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的重要病原体，一旦发病，会给养猪行业带来巨大的经济损失。

目前，作为对全球养猪业具有重大威胁的主要疾病之一，防控PCV2的感染成为养猪产业的重中之重，其中疫苗免疫是最有效的防控手段之一，疫苗的质量的优劣成为是否有效防控的关键。另外，好的临床诊断关乎PCV-2的监测与净化。当前，临床上诊断主要是PCV-2夹心ELISA方法等，操作简单、易行，大大降低成本，其中需要用到PCV2作为阳性对照。在PCV-2疫苗和试剂盒的制备中，PCV2病毒的保藏是一个重要环节，显著影响了疫苗的免疫效果和试剂盒检测的准确性、灵敏度。但是，现有技术中，猪圆环病毒在猪圆环病毒仅能2～8℃条件下保存，且保存期短，在高温环境下无法贮存，耐热稳定性差。

发明内容

针对现有技术中，猪圆环病毒仅能2～8℃条件下保存，且保存期短，在高温环境下无法贮存，耐热稳定性差，本发明提供一种猪圆环病毒的冻干保护剂，能够有效提高猪圆环病毒在不同温度下贮存的稳定性。

本发明的另一目的是提供含有所述冻干保护剂在猪圆环病毒保藏中的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种猪圆环病毒的冻干保护剂，按质量百分含量包括如下组分：麦芽糖醇1-10％，乳糖醇2-10％，β-葡聚糖0.01-1％，海藻糖0.5-6％，聚乙烯吡咯烷酮K30 1-6％，甘氨酸0.5-4％，脯氨酸1-4％，丝氨酸0.2-2％，余量为溶剂，pH为7.0～7.5。

在本发明中，所述溶剂为水、生理盐水或者缓冲液。

本发明还提供所述冻干保护剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将麦芽糖醇、乳糖醇、β-葡聚糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮K30溶于溶剂中，灭菌；

(2)将甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸溶于溶剂中，过滤除菌；

(3)将步骤(1)和(2)所得溶液混合，调节pH至7.0～7.5，即得冻干保护剂。

本发明还提供所述冻干保护剂在猪圆环病毒保藏中的应用。

在所述应用中，是将猪圆环病毒液与所述冻干保护剂按照体积比为1～2：1混合均匀后冻干。

在本发明中，所述猪圆环病毒液的病毒效价大于等于10^4.0TCID₅₀/mL。

在本发明中，冻干包括如下步骤：在常压下，以0.5～2℃/min的速度降温至-40℃并维持1.5～3h；抽真空至90～110mTorr，升温至-12～-8℃并维持8～10h，之后升温至26～30℃，并在26～30℃维持3h。

有益效果：与现有技术相比，本发明用于猪圆环病毒的冻干保护剂成分简单、配制方便，能够显著提高其在高温环境下的保存期限，在2～8℃下保存21个月，效价损失≤1.0个滴度；在37℃下保存1个月，效价损失≤1.0个滴度；置于45℃保存至25天，效价损失≤1.0个滴度。因此，本发明冻干保护剂可以应用于猪圆环病毒的稳定保藏中，从而将稳定保藏后的病毒应用于疫苗和检测试剂盒的制备中，显著降低生产成本和程序。

附图说明

图1显示了2～8℃时各冻干保护剂对PCV2的保护效果，横坐标为保藏时间，单位是月，纵坐标是病毒含量，单位是TCID₅₀/ml。

图2显示了37℃时冻干保护剂对PCV2的保护效果，横坐标为保藏时间，单位是天，纵坐标是病毒含量，单位是TCID₅₀/ml。

图3显示了显示了45℃时冻干保护剂对PCV2的保护效果，横坐标为保藏时间，单位是天，纵坐标是病毒含量，单位是TCID₅₀/ml。

具体实施方式

以下实施例中的猪圆环2型病毒液是将猪圆环2型病毒采用细胞增殖，反复冻融后所得。

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

本发明中的β-葡聚糖，数均分子量为2.7×10⁵，购买自sigma。

实施例1冻干保护剂1及相应的猪圆环病毒冻干样品

冻干保护剂1，由以下质量百分含量的组分组成：麦芽糖醇2％，乳糖醇8％，β-葡聚糖0.01％，海藻糖5％，聚乙烯吡咯烷酮K30 2％，甘氨酸1％，脯氨酸1％，丝氨酸0.4％，余量为注射用水。

冻干保护剂1的制备方法包括如下步骤：

(1)称取麦芽糖醇、乳糖醇、β-葡聚糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮K30充分溶解于注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌15min，灭菌过程中控制温度为115℃，备用；

(2)称取甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸充分溶解于注射用水中，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用；

(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液于无菌条件下按照体积比为1:1混合，通过无菌稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH至7.0，即得冻干保护剂1。

将猪圆环2型病毒液(10^6.6TCID₅₀/mL)与冻干保护剂1按照体积比1:1混合均匀后，分装至西林瓶中，2mL/瓶，采用冻干机冻干。冻干步骤如下：在常压下以1℃/min的速度降温至-40℃，在-40℃维持2h；抽真空至100mTorr(毫托)，升温至-10℃，在-10℃维持9h，然后升温至28℃，并在28℃维持3h，即得猪圆环病毒冻干样品1。

实施例2冻干保护剂2及相应的猪圆环病毒冻干样品

冻干保护剂2，由以下质量百分含量的组分组成：麦芽糖醇5.5％，乳糖醇5％，β-葡聚糖0.5％，海藻糖3％，聚乙烯吡咯烷酮K30 5％，甘氨酸1.5％，脯氨酸3％，丝氨酸0.75％，余量为注射用水。

冻干保护剂2的制备方法包括如下步骤：

1)称取麦芽糖醇、乳糖醇、β-葡聚糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮K30充分溶解于注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌15min，灭菌过程中控制温度为115℃，备用；

(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液于无菌条件下按照体积比1:1混合，通过无菌稀盐酸和/或氢氧化钠调节pH至7.2，即得冻干保护剂2。

将猪圆环2型病毒液(10^6.6TCID₅₀/mL)与冻干保护剂2按照体积比为1.5:1混合均匀后，分装至西林瓶中，2mL/瓶，采用冻干机冻干。冻干步骤如下：在常压下，以1℃/min的速度降温至-40℃，在-40℃维持2h；抽真空至100mTorr，升温至-10℃，在-40℃维持9h，之后升温至28℃，并在28℃维持3h，得到为猪圆环病毒冻干样品2。

实施例3冻干保护剂3及相应的猪圆环病毒冻干样品

冻干保护剂3，由以下质量百分含量的组分组成：麦芽糖醇8％，乳糖醇3％，β-葡聚糖1％，海藻糖1％，聚乙烯吡咯烷酮K30 3.5％，甘氨酸3％，脯氨酸1.5％，丝氨酸1.5％，余量为注射用水。

冻干保护剂3的制备方法，包括如下步骤：

(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液于无菌条件下按照体积比为1:1混合，通过无菌稀盐酸和/或氢氧化钠水溶液调节pH至7.5，即得冻干保护剂3。

将猪圆环2型病毒液(10^6.6TCID₅₀/mL)与冻干保护剂3按照体积比为2:1混合均匀后，分装至西林瓶中，2mL/瓶，采用冻干机冻干。冻干步骤如下：在常压下，以1℃/min的速度降温至-40℃，在-40℃维持2h；抽真空至100mTorr，升温至-10℃，在-10℃维持9h，之后升温至28℃，并在28℃维持3h，得到猪圆环病毒冻干样品3。

实施例4对照保护剂及相应的猪圆环病毒冻干样品

1.对照保护剂1及对照猪圆环病毒冻干样品1

对照保护剂1，由以下质量百分含量的组分组成：明胶10％、海藻糖3％、蔗糖20％、胰蛋白胨8％、水解乳蛋白2％、酶解酪蛋白12％、硫脲2％、甘氨酸0.3％、右旋糖酐0.5％、甘露醇1％，余量为注射用水。对照保护剂1公开于中国专利2016111534800、名称为一种疫苗耐热保护剂、疫苗以及疫苗的发明专利。

对照冻干保护剂1的具体制备步骤如下：

(1)按所述重量百分比称取海藻糖、水解乳蛋白、酶解酪蛋白、硫脲、甘氨酸、右旋糖酐和甘露醇，溶解于注射用水中，过滤除菌后，备用；

(2)按所述重量百分比称取明胶、蔗糖和胰蛋白胨，溶解于注射用水中，高温高压灭菌处理后，备用；

(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液于无菌条件下按体积比1:1混合均匀，即得对照保护剂1。

将猪圆环2型病毒液(10^6.6TCID₅₀/mL)与对照冻干保护剂1按照4:1体积比混合均匀后，分装至西林瓶中，2.6mL/瓶，进入冻干机冻干。冻干步骤如下：7小时内缓慢降到-48℃下并维持4小时；逐渐升温至-25℃后维持30小时；升温至-20℃维持2小时，升温至-15℃维持2小时，升温至-10℃维持2小时，升温至0℃维持2小时；升温至5℃维持2小时；升温至26℃维持9小时，即得对照猪圆环病毒冻干样品1。

2.对照保护剂2及对照猪圆环病毒冻干样品2

对照保护剂2按照质量百分含量由以下组分组成：麦芽糖醇5％、甘露醇5％、β-葡聚糖0.01％、蔗糖3％、聚乙烯吡咯烷酮K30 2％、甘氨酸1％、脯氨酸1％、丝氨酸1％，余量为注射用水。

对照保护剂2的制备方法，包括如下步骤：

1)称取麦芽糖醇、甘露醇、β-葡聚糖、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮K30充分溶解于注射用水中，高压蒸汽灭菌法灭菌15min，灭菌过程中控制温度为115℃，备用；

(3)将步骤(1)和(2)制得的溶液于无菌条件下按照体积比为1:1混合，通过无菌稀盐酸和/或氢氧化钠水溶液调节pH至7.5，即得对照保护剂2。

将猪圆环2型病毒液(10^6.6TCID₅₀/mL)与对照保护剂2按照体积比2:1混合均匀后，分装至西林瓶中，2mL/瓶，采用冻干机冻干。冻干步骤如下：在常压下，以1℃/min的速度降温至-40℃，在-40℃维持2h；抽真空至100mTorr，升温至-10℃，在-10℃维持9h，之后升温至28℃，并在28℃维持3h，得到对照猪圆环病毒冻干样品2。

3.对照保护剂3及对照猪圆环病毒冻干样品3

对照保护剂3由以下质量百分含量的组分组成：海藻糖68％、甘氨酸6％、明胶3％、酪蛋白水解物6％、聚乙烯基吡咯烷酮6％、甘油5％、普鲁尼克68 6％。对照保护剂3公开于专利号为2013100044452、名称为一种活疫苗的耐热冻干保护剂、活疫苗冻干粉及其制备方法的发明专利。

对照保护剂3的具体制备步骤如下：按所述重量百分比称取海藻糖、甘氨酸、明胶、酪蛋白水解物、聚乙烯基吡咯烷酮、甘油、普鲁尼克68后，与无菌注射用水按照质量比为3:7混合，待完全溶解后，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，得到对照保护剂3。

将猪圆环2型病毒液与对照保护剂3按照质量比1:1体积比混合均匀后，分装至西林瓶中，2mL/瓶，进入冻干机冻干。冻干步骤如下：在常压、温度为-10℃下保持2h；在真空度为100mbar温度为0℃条件下保持10h，在真空度为0.01mbar温度为10℃条件下保持2h，得到对照猪圆环病毒冻干样品3。

实施例5各冻干样品的稳定性

将猪圆环病毒冻干样品1、2、3和对照猪圆环病毒冻干样品1、2、3分别置于2～8℃、37℃和45℃条件下保存，每隔一定的时间对各样品取3瓶样品，检测其病毒含量，取平均值，以评价猪圆环病毒在3个温度下的稳定保藏时间。

具体结果见图1～图3。在2～8℃下保存时(图1)，对照猪圆环病毒冻干样品1和对照猪圆环病毒冻干样品2保存至6个月时，PCV2效价已降低1.0个滴度，到9个月时，效价已降至10^4.0TCID₅₀/mL；对照猪圆环病毒冻干样品3则在6个月时，效价已降至10^4.0TCID₅₀/mL，效价损失超过2.0个滴度。与之相比，冻干保护剂1、2和3对PCV2耐热保护效果显著，保存至21个月时，效价损失≤1.0个滴度。

在37℃下保存时(图2)，对照猪圆环病毒冻干样品3在第5天时猪圆环病毒效价已降至10^4.0TCID₅₀/mL，对照猪圆环病毒冻干样品1和对照猪圆环病毒冻干样品2在第10天，效价降至10^4.0TCID₅₀/mL，而冻干保护剂1、2、3能够显著提高PCV2的耐热性能，保存1个月时，效价损失≤1.0个滴度。

置于45℃保存时(图3)，冻干保护剂1、2、3添加后对PCV2的保护效果卓越，猪圆环病毒冻干样品1、2、3保存至25天，效价损失≤1.0个滴度，而对照猪圆环病毒冻干样品1和对照猪圆环病毒冻干样品2保存5天时效价已降至10^4.0TCID₅₀/mL，对照猪圆环病毒冻干样品3仅能放置2天，效价已降至10^4.0TCID₅₀/mL。

从以上试验结果可以看出，本发明的冻干保护剂对猪圆环病毒的保护效果明显优于现有的保护剂。采用本发明的冻干保护剂所制备的PCV2冻干制品在高温条件下的耐热损失明显降低，使猪圆环病毒在高温运输和贮存过程中稳定保存。本发明的冻干保护剂对猪圆环病毒具有卓越的保护效果。

Claims

1.一种猪圆环病毒的冻干保护剂，按质量百分含量包括如下组分：麦芽糖醇1-10%，乳糖醇2-10%，β-葡聚糖0.01-1%，海藻糖0.5-6%，聚乙烯吡咯烷酮K30 1-6%，甘氨酸 0.5-4%，脯氨酸1-4%，丝氨酸0.2-2%，余量为溶剂，pH为7.0～7.5；所述溶剂为水，所述猪圆环病毒为猪圆环病毒2型。

2.权利要求1所述冻干保护剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将麦芽糖醇、乳糖醇、β-葡聚糖、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮K30溶于溶剂中，灭菌；

（2）将甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸溶于溶剂中，过滤除菌；

（3）将步骤（1）和（2）所得溶液混合，调节pH至7.0～7.5，即得冻干保护剂。

3.权利要求1所述冻干保护剂在猪圆环病毒2型保藏中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于是将猪圆环病毒液与所述冻干保护剂按照体积比为1～2：1混合均匀后冻干。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于所述猪圆环病毒液的病毒效价大于等于10^4.0TCID₅₀/mL。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于冻干包括如下步骤：在常压下，以0.5~2℃/min的速度降温至-40℃并维持1.5~3h；抽真空至90~110mTorr，升温至-12~-8℃并维持8~10h，之后升温至26~30℃，并在26~30℃维持3h。