CN103740625A - 一种猪支原体肺炎减毒活疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪支原体肺炎减毒活疫苗及其应用，本发明筛选具有典型猪肺炎支原体感染同时无明显其他病原感染的猪肺脏病料，利用乳兔肺继代传至100代，然后分离猪肺炎支原体菌株，利用培养基进行连续传代，同时通过多个菌株的筛选获得猪肺炎支原体AN306，其保藏号为CCTCC M2012431。本发明还涉及基于该弱毒株制备的猪支原体肺炎活疫苗制剂，包含活的弱毒株、药学上可接受的载体或辅料，并可以包含佐剂，同时可以进一步含有其他病原的免疫原。本发明的猪支原体肺炎活疫苗可通过多种途径进行免疫，该疫苗能使动物获得抗猪肺炎支原体感染的保护能力。

Description

一种猪支原体肺炎减毒活疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及一种猪支原体肺炎减毒疫苗株，含有该减毒株的活疫苗，及其在保护猪肺炎支原体感染相关疾病中的应用。 

背景技术

猪支原体肺炎，俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪的慢性呼吸道传染性疾病，主要症状为咳嗽和气喘。该病主要引起猪的饲料转化率下降和生长受阻，发病率高、死亡率低。猪支原体肺炎在世界范围内广泛流行，给现代养猪业造成重大经济损失。 

猪肺炎支原体常常与其他病原形成混合感染。例如与多杀性巴氏杆菌（Pasteurella Multocida）、猪链球菌（Streptococcus Suis，SS）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus Parasuis of Swine，HPS）或猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus Pleuropneumonia of Porcine，APP)等混合感染，引发猪地方流行性肺炎。当猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)、猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus Type2，PCV2)和/或猪流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)混合感染时，就会发生常见的猪呼吸道疾病综合征(Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)，不仅可以引起猪的呼吸系统疾病，同时也会导致猪的繁殖能力下降。 

猪支原体肺炎是一种顽固性慢性传染病，药物治疗效果不够理想，停药后容易复发，该病一旦在猪场流行,就很难根除。因此，预防、控制和净化猪支原体肺炎须采取早期诊断、及时隔离、抗生素治疗或淘汰病猪、疫苗预防、全进全出、严格消毒等综合性措施，其中疫苗预防在控制猪支原体肺炎中起着关键性的作用。 

尽管目前猪支原体肺炎灭活疫苗已经在临床上进行了大规模的应用，但是对该病的控制效果却并不尽如人意，且通常情况下，灭活疫苗可以一定程度上降低患病猪肺脏的病变指数，但并不能有效降低患病猪的比例。猪支原体肺炎因此被 认为是流行范围最广、最难净化的猪传染病之一。这些疫苗效果不佳的原因可能与其灭活疫苗的本质以及猪肺炎支原体感染的特性有关。 

猪肺炎支原体通过呼吸道感染结合于支气管纤毛上皮细胞上形成定殖，从而造成持续感染。灭活疫苗免疫后激发全身性免疫应答，而诱发局部免疫应答的效力不佳，其产生的循环抗体必须通过上皮屏障，分泌到气管支气管管腔，而该过程异常困难，而且效率低下。为了能够达到有效免疫，疫苗必须能够刺激高水平的系统免疫应答。当然，这需要相对较高的抗原剂量和较强的佐剂，这样就使这些疫苗成本增加价格昂贵。同时，灭活疫苗产生的免疫应答只能抑制野毒感染后的增殖和减轻组织破坏程度，并不能完全阻止野毒的感染，因而难以达到对该病的理想控制。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪支原体肺炎减毒活疫苗，该猪支原体肺炎减毒活疫苗可用于预防和控制猪肺炎支原体感染导致的疾病，包括其他病原菌与猪肺炎支原体共同感染导致的疾病。 

猪支原体肺炎减毒活疫苗的作用机制不同于灭活疫苗，其接种后可在体内增殖，有效激活机体免疫系统，同时活疫苗进入呼吸系统后可定殖于支气管纤毛细胞上，产生“占位效应”，使得野毒无法定殖，从源头上阻断野毒的侵染过程，从而起到很好的抗感染作用。同时，由于活疫苗可以在体内增殖，有效激活免疫系统，所需要的剂量远远低于灭活疫苗，因此在成本控制上较灭活疫苗有明显优势，有利于节约社会资源。 

活疫苗研制的关键在于高免疫原性菌株的获得和致弱过程中使菌株毒力下降同时保持免疫原性的致弱技术。 

本发明根据毒株的特点，使用前100代乳兔肺继代，100代以后无细胞培养基继代的致弱方法。该方法的优点在于在前期传代过程中采用动物体内继代，可以避免使用培养基体外继代时容易导致菌株在早期过快致弱、不利于免疫原性维持的缺陷。后期采用无细胞培养基继代，有利于一定程度上减少致弱代次，缩短致弱过程。 

该毒株具体来源为：筛选具有典型猪肺炎支原体感染同时无明显其他病原感 染的猪肺脏病料，利用乳兔肺继代传至100代，然后分离猪肺炎支原体菌株，利用培养基进行连续传代，同时通过多个菌株的筛选获得。筛选得到的毒株命名为猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306。该弱毒株经过长期多次传代致弱后，丧失致病力，对动物安全，并保留了良好的免疫原性，能为免疫动物提供免疫保护，防止猪肺炎支原体感染疾病的发生。经过五代毒力返强试验证实弱毒株AN306不会回复突变成为有致病力的强毒株。因此，该弱毒株AN306可在制备猪支原体肺炎疫苗或多联疫苗中应用。 

该猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株已于2012年10月25日，保藏于位于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012431。 

本发明的另一个目的在于公开该猪支原体肺炎减毒活疫苗，该减毒活疫苗可为猪支原体肺炎疫苗或多联疫苗。包括上述猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306，以及药学上可接受的载体或辅料。载体或辅料主要包括三类物质，根据疫苗的具体使用状态和免疫途径而不同。一类为溶剂或缓冲体系，包括无菌生理盐水、无菌磷酸盐缓冲液；一类为冻干保护剂，包括脱脂奶粉、明胶、蔗糖，当疫苗制备为冻干形式时需添加入冻干体系中帮助活疫苗维持活性；一类为喷雾保护剂，主要为甘油，当活疫苗采用气雾免疫时需加入帮助活疫苗在喷雾过程中维持活性。 

同时本发明的猪支原体肺炎活疫苗制剂可进一步含有一种免疫佐剂。 

佐剂是疫苗制剂中的常见成分，用于增强疫苗本身的免疫刺激能力。本发明中使用的佐剂是适合于猪支原体肺炎活疫苗的佐剂，即对该活疫苗的活力不造成明显损伤，同时适合猪支原体肺炎的免疫需求。 

本发明所公开的免疫佐剂，可为单一佐剂成份或由多种佐剂成分复合而成，所含佐剂成份可包括中草药多糖、卡波姆、壳聚糖、免疫刺激复合物基质、左旋咪唑、葡聚糖、CpG、囊素中的一种或多种。各种免疫佐剂成分、配比和使用剂量因活疫苗具体使用的剂量及给药途径的不同而不同。 

本发明的猪支原体肺炎活疫苗制剂中可进一步含有至少一种其他病原的免疫原，形成联苗进行使用。其他的病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫中的至少一种，例如猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪鼻 支原体、猪滑液支原体、猪流感病毒等。这些病原在临床上常与猪肺炎支原体在呼吸道中形成混合感染或继发感染，相互促进，导致病情加重，给猪群健康带来重大威胁。因此将这些病原的疫苗与猪支原体肺炎活疫苗联用，可用于预防猪肺炎支原体及其他病原的混合感染。所述其他病原的免疫原既可以为活菌或活毒形式，也可以为灭活形式、蛋白亚单位形式等。值得注意的是，其他病原疫苗所使用载体、辅料和佐剂必须与本猪支原体肺炎活疫苗使用的体系兼容，同时必须要能够为本活疫苗所耐受。 

本发明的猪支原体肺炎减毒活疫苗可通过多种途径进行免疫，包括肺内注射、肌肉注射、气雾免疫、口服免疫和滴鼻免疫。所述减毒活疫苗采用的制剂可为肺内注射剂、肌肉注射剂、气雾剂、口服剂或滴鼻剂。免疫途经的选择取决于将进行免疫接种的动物、免疫接种史、猪场环境，以及给动物进行疫苗接种人员的操作方便性。猪肺炎支原体感染机体后首先结合在肺部支气管上皮纤毛细胞上，导致纤毛脱落，继而进一步侵染组织、诱发炎症，同时为其他病原菌的感染打开门户。猪支原体肺炎活疫苗采用肺内注射途径免疫时活疫苗能够直接注射入靶组织，结合到纤毛细胞上，从而占据结合位点，阻止野毒的感染；当猪支原体肺炎活疫苗采用气雾途径免疫时通过控制雾滴粒径能够使得活疫苗到达动物的下呼吸道内，有效结合在支气管纤毛细胞上，同时在封闭的畜棚或空间内使用气雾剂疫苗可以减少进行免疫接种所需的人员；肌肉注射为动物免疫最常用的接种方式，操作简便，可接受度高，当猪支原体肺炎活疫苗采用肌肉注射途径免疫时，能够诱发动物产生全身性的细胞及体液免疫应答，该应答反应到肺部靶组织局部，可抑制猪肺炎支原体野毒的侵染；当猪支原体肺炎活疫苗采用口服或滴鼻方式接种时，可诱导肠道或鼻腔局部黏膜免疫应答，通过共同黏膜免疫系统，淋巴细胞可归巢到不同的黏膜部位，从而实现下呼吸道支气管肺部组织的免疫应答，实现对猪肺炎支原体野毒感染的保护。根据所使用的接种途径，其所选用的免疫佐剂亦随之发生变化。因此，本发明所述猪支原体肺炎减毒活疫苗可在防治猪肺炎支原体感染疾病中应用。本发明猪支原体肺炎减毒活疫苗的制备方法是将猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306与药学上可接受的载体或辅料，以及至少一种免疫佐剂，至少一种其他病原的免疫原组合在一起。 

本发明的猪支原体肺炎活疫苗可以采用单次免疫，亦可采用2次或多次重复接种来增强免疫应答。根据免疫接种的途径及动物状况不同而具体选择。单次免疫接种时间通常为3-10日龄，优选为5-7日龄。2次或多次重复接种的首次免疫接种时间通常为3-10日龄，优选为5-7日龄。两次免疫接种之间的时间间隔一般为2-3周。 

生物样品保藏信息： 

上述猪肺炎支原体弱毒株AN306，分类命名为：猪肺炎支原体AN306(Mycoplasma hyopneumoniae AN306)已于2012年10月25日，保藏位于武汉市武昌珞珈山的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012431。 

具体实施方式：

结合具体实施例对本发明进行进一步描述和论证，但是本发明所包括的内容并不局限于此。 

为了说明本发明的猪支原体肺炎活疫苗菌株的筛选、传代、鉴定过程以及活疫苗菌株的免疫原性和安全性，同时验证本发明的猪支原体肺炎活疫苗制剂，包括采用多种不同免疫途径、多种不同佐剂、添加其他不同病原免疫原的情况，能够有效防止猪肺炎支原体的感染，控制猪支原体肺炎的发生，特做以下实验和制备。 

实施例1：猪肺炎支原体AN306的获得 

强毒株的获得： 

1975年江苏省农业科学院根据农业部要求集中了全国20多个省的农业大学和国家、省级农业科学院的猪支原体肺炎典型病料进行猪肺炎支原体强毒致病株的筛选工作。共搜集全国各地的疑似猪支原体肺炎肺脏病料二百余份，从中筛选出具有典型猪肺炎支原体感染并无明显其他病原感染的病料10份，作为猪支原体肺炎的强毒组织毒冻干保存。同时进行本动物攻毒发病试验和连续传代致弱试验。 

将所选的10个强毒组织毒以滴鼻方式接种地方品种健康易感猪，攻毒后均可观察到试验动物出现咳嗽、气喘、消瘦、犬坐等猪支原体肺炎临床症状，剖检 时其肺部尖叶、心叶可见典型虾肉样实变。根据动物攻毒发病潜伏期、临床症状、发病比例、肺脏病变程度、血清凝集抗体效价，从10个强毒组织毒中挑选毒力最强、免疫原性最好的3个进行传代。 

传代致弱： 

将强毒组织毒肺内注射接种健康乳兔，采集攻毒兔肺脏，匀浆后再接种健康乳兔，如此继代。上述3个强毒仅1株成功用兔体进行传代。该毒株在传代时分别于20代、40代、60代、80代时各多分设一平行传代组，连续传代至100代。 

采用“病肺块浸泡法”从100代乳兔肺脏中分离猪肺炎支原体。具体方法为：动物放血致死，无菌操作采集肺组织，剪下1/2芝麻大小的小块，用Hank’s液洗涤浸泡于KM2培养液中，加入抗生素，置于37℃培养，每天观察培养液的pH变化和混浊度。当pH呈现明显变化（降至7.0-6.8）且有均匀混浊(约48h)产生时，上述培养物以1:5接种量连续传代4-5代后，再以1:10接种量继代。按Gurr改良的姬姆萨染色法染色，油镜镜检，所分离的微生物菌体呈多形态，具有猪肺炎支原体的典型形态特征。利用猪肺炎支原体标准阳性血清进行微粒凝集反应和代谢抑制试验，鉴定为猪肺炎支原体。将所分离获得的猪肺炎支原体通过三次固体克隆纯化并再次鉴定后冻干保存。 

将冻干保存的F100代猪肺炎支原体菌株复苏，利用KM2培养基按1：10继续进行连续传代致弱。每五代采用PCR鉴定，每20代冻干保存。分别从F100、F140、F180、F220、F240、F280、F320代中另分一株同样进行传代，传至不同代次。 

表1：致弱菌株的初步筛选 

通过传代情况、生长性能、毒力几个方面对不同传代菌株进行综合分析，选择生长迅速、滴度较高、毒力致弱的5个菌株AN301、AN303、AN306、AN308、AN309进行后续毒力返强试验和免疫保护能力测定。致弱菌株的毒力返强试验： 

将上述筛选的菌株进行连续5代毒力返强试验。将10⁸CCU/mL猪肺炎支原体培养物，向3头健康猪气管内注射3mL，隔离饲养28d，剖检观察实验猪肺脏是否出现病变，同时进行病理切片，观察是否产生炎性改变。无菌取肺脏心叶、尖叶和膈叶前缘组织5-7g剪碎，碾磨成糊状，加入含有1000IU/mL青霉素的Hank’s溶液100mL，配制成50g/L的肺悬液，吸取上清液于当日再次接种健康猪3头，每头3mL，如此反复传代5次，观察其是否出现毒力返强的现象。 

表2：致弱菌株的毒力返强试验筛选 

结果显示，AN301菌株在第四及第五代时出现有动物肺脏发生炎性病理改变，其余4株5次接种的动物均未出现明显的猪支原体肺炎临床症状，剖检未发现肺脏实变，病理切片检查未发现淋巴组织增生、淋巴细胞与巨噬细胞浸润等炎性病理改变。由此证明这4株传代菌株为弱毒株且不具备毒力返强能力。致弱菌株的免疫试验： 

将上述筛选的菌株进行免疫原性测定和攻毒免疫保护力测定。制备不同菌株的冻干菌，测定各冻干菌株滴度。用无菌磷酸盐缓冲液溶解冻干苗，并用无菌磷酸盐缓冲液将各菌株调整至同样浓度进行试验。 

用5-7日龄健康阴性梅山猪进行攻毒免疫保护力测定。动物随机分组，每组5头。免疫组动物肺内注射免疫弱毒株0.5mL(10⁵CCU/头)，免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒，28天后剖检。另设健康对照组及攻毒对照组。 

用间接血凝法测定血清抗体，1:10“++”以上判定为阳性。 

剖检评分：攻毒后28天处死动物，参照MADEC和KOBISCH（1982）报道的方法对实验猪肺部的损伤进行评分。整个肺脏分左心叶（LCL）、左尖叶（LAL）、左膈叶（LDL）、右心叶（RCL）、右尖叶（RAL）、右膈叶（RDL）和副叶（IL），共7个肺叶。每个肺脏的损伤分数为上述7个肺叶的背侧面和腹侧面损伤得分之和，总分为28分。每个肺叶按照损伤的面积分别打0-4分，其中无损伤为0分，1-25%面积损伤为1分，26-50%面积损伤为2分，51-75%面积损伤为3分，76-100%面积损伤为4分。 

表3：致弱菌株的免疫试验筛选 

由结果分析，AN306弱毒株的免疫原性较好，攻毒试验证明其保护力最高，且前述试验证明其体外培养生长快、滴度高，安全性好，故最终选择AN306株为活疫苗菌株使用，初始代次为F280。 

实施例2：猪肺炎支原体弱毒株AN306株的培养 

KM2液体培养基制备（按2050mL计）：Eagles氏液1000mL，水解乳蛋白10g，猪血清400mL，鲜酵母浸出汁20mL，Dulbecco磷酸盐缓冲液600mL，青霉素400万单位，0.4%酚红3.5mL，用10g/L NaOH调pH值为7.4～7.6。 

取猪肺炎支原体弱毒株AN306冻干菌种1支，用0.5mL培养基溶解后取0.5mL接种于4.5mL培养基中，于封闭青霉素瓶中37℃培养，当培养基颜色由红 色变成黄色时及时收获培养物，按体积比1:10的比例接种入新鲜培养基中扩大培养，当培养基颜色由红色变成黄色及时收获培养物，依此培养扩大至5000mL并收获菌种。 

配制冻干保护剂，配方为明胶1.5g、蔗糖12.5g、双蒸水100mL，115℃高压灭菌15min，使用灭菌的1%NaOH调节pH至7.0。收获培养物后先测定其CCU含量，按菌种与灭菌冻干保护剂体积比为3:2的比例添加冻干保护剂。添加保护剂后混匀，分装至安瓿瓶，0.5mL/管。将分装好菌种的安瓿瓶放至冻干机中，进行冻干。冻干结束用氮气封口，-40℃保存。抽取1mL培养物提取DNA进行PCR鉴定。 

通过此方法获得的弱毒株AN306培养物，滴度可达10⁹CCU/mL，产量为升级。 

实施例3：肺内注射免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价及与其他商品化活疫苗及灭活疫苗的比较 

疫苗制备： 

猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株冻干苗，用无菌磷酸盐缓冲液溶解冻干苗，配制疫苗溶液使得其中活疫苗滴度为2×10⁵CCU/mL。每头动物肺内注射0.5mL，即10⁵CCU/头。 

商品化活疫苗：本试验使用目前市场仅有的两种猪支原体肺炎活疫苗作为对照活疫苗。（1）吉林正业生物制品股份有限公司生产的猪支原体肺炎活疫苗，为含猪肺炎支原体兔化弱毒株的鸡胚卵黄囊组织，以下简称为商品疫苗1，按照疫苗说明书操作；（2）商品名：支必宁，为猪肺炎支原体弱毒株168株的体外培养物，以下简称为商品疫苗2，按照疫苗说明书操作。 

商品化灭活疫苗：本试验使用目前市场上使用较为广泛的两种猪支原体肺炎灭活疫苗作为对照灭活疫苗。（1）商品名：RespiSure，以下简称为商品疫苗3，按照疫苗说明书操作。；（2）商品名：MycoFLEX，以下简称为商品疫苗4，按照疫苗说明书操作。 

动物免疫及攻毒： 

健康仔猪70头，随机分成7组：G1组为健康对照组，不免疫不攻毒；G7组为攻毒对照组，不免疫只攻毒。G2-G6组为疫苗免疫组，具体分组及免疫方法 见下表，免疫后攻毒。G2-G7组动物于免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒，28天后剖检。 

试验重复两次。分别使用苏钟猪和托佩克猪两个品种进行。 

结果： 

采用实施例1中描述方法对动物肺脏的猪支原体肺炎病变进行评分。结果显示免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的动物肺脏病变明显减轻，与攻毒对照组相比统计学（统计方法One-way ANOVA）差异极显著（P<0.01），其病变指数均值明显低于目前市场上广泛使用的商品化活疫苗及灭活疫苗（商品疫苗1，P<0.01；商品疫苗2，P<0.05；商品疫苗3，P<0.01；商品疫苗4，P<0.01）。说明减毒活疫苗AN306株能够帮助免疫动物有效抵抗猪肺炎支原体感染，保护力好于目前市场上广泛使用的疫苗。 

表4：肺内注射免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价及与其他商品化活疫苗及灭活疫苗的比较 

实施例4：气雾免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价 

疫苗稀释液配制： 

含5%-10%甘油的无菌去离子水溶液，pH值6.8-7.5。 

疫苗配制： 

猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株冻干苗，用疫苗稀释液溶解冻干苗，配制疫苗溶液使得其中活疫苗滴度为10⁶CCU/mL。动物免疫及攻毒： 

5-7日龄健康阴性托佩克猪40头，随机分成4组：G1组为健康对照组，不 免疫不攻毒；G2组为活疫苗气雾免疫组，气雾免疫AN306活疫苗0.5mL（5×10⁵CCU/头），于首次免疫后2周再次免疫，免疫后攻毒；G3组为商品化疫苗组，免疫目前市场上广泛使用的商品化猪支原体肺炎灭活疫苗RespiSure，按照疫苗说明书操作，免疫后攻毒；G4组为攻毒对照组，不免疫只攻毒。G2、G3、G4组动物于首次免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒，28天后剖检。结果： 

采用实施例1中描述方法对动物肺脏中出现的猪支原体肺炎病变进行评分，具体见下表。结果显示气雾免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的动物肺脏病变明显减轻，与攻毒对照组相比统计学差异极显著（P<0.01），并显著低于商品化灭活疫苗（P<0.01）。说明该减毒活疫苗通过气雾免疫能够帮助免疫动物抵抗猪肺炎支原体感染，保护力好于目前市场上广泛使用的灭活疫苗。 

表5：气雾免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价 

实施例5：肌肉注射免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价疫苗制备： 

猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株冻干苗。所使用佐剂为用无菌磷酸盐缓冲液配制的含有5mg/mL卡波姆和30mg/mL黄芪多糖的混合物佐剂。用佐剂溶液溶解冻干苗，配制疫苗溶液使得其中活疫苗滴度为2.5×10⁵CCU/mL。 

动物免疫及攻毒： 

5-7日龄健康阴性苏钟猪40头，随机分成4组：G1组为健康对照组，不免疫不攻毒；G2组为活疫苗肌肉注射免疫组，肌肉注射免疫AN306活疫苗2mL（5×10⁵CCU/头），于首次免疫后2周再次免疫，免疫后攻毒；G3组为商品化疫苗组，免疫目前市场上使用广泛的商品化猪支原体肺炎灭活疫苗RespiSure，按照疫苗说明书操作，免疫后攻毒；G4组为攻毒对照组，不免疫只攻毒。G2、G3、G4组动物于首次免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒，28天后剖检。 结果： 

采用实施例1中描述方法对动物肺脏中出现的猪支原体肺炎病变进行评分，具体见下表。结果显示肌肉注射免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的动物肺脏病变明显减轻，与攻毒对照组相比统计学差异极显著（P<0.01），并显著低于商品化灭活疫苗（P<0.01）。说明该减毒活疫苗通过肌肉注射免疫能够帮助免疫动物抵抗猪肺炎支原体感染，保护力好于目前市场上广泛使用的灭活疫苗。 

表6：肌肉注射免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价 

实施例6：滴鼻免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价 

疫苗制备： 

猪肺炎支原体AN306株新鲜培养物，滴度为5×10⁶CCU/mL。如下制备含壳聚糖佐剂的疫苗：用1%乙酸溶液溶解壳聚糖配制成含1%壳聚糖的母液，用0.1MNaOH溶液调节pH值至6.5；用0.1M NaAc-HAc(pH6.5)的溶液稀释上述壳聚糖母液至壳聚糖终浓度为0.2%。将猪肺炎支原体AN306株新鲜培养物12000rpm30min离心收集菌体，用1mL50mM Na₂SO₄重悬，使滴度为6.66×10⁶CCU/mL。取5mL0.2%壳聚糖溶液，加入1mL含猪肺炎支原体的Na₂SO₄溶液，振荡混匀，边振荡边缓慢滴加660μL三聚磷酸钠（4mg/mL）溶液呈均一乳白色悬浊液，即得。 

动物免疫及攻毒： 

5-7日龄健康阴性托佩克猪32头，随机分成4组：G1组为健康对照组，不免疫不攻毒；G2组为活疫苗滴鼻免疫组，滴鼻免疫AN306活疫苗0.5mL（5×10⁵CCU/头），于首次免疫后2周再次免疫，免疫后攻毒；G3组为商品化疫苗组，免疫目前市场上使用广泛的商品化猪支原体肺炎灭活疫苗RespiSure，按照疫苗说明书操作，免疫后攻毒；G4组为攻毒对照组，不免疫只攻毒。G2、G3、G4组动物于首次免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒，28天后剖检。结果： 

采用实施例1中描述方法对动物肺脏中出现的猪支原体肺炎病变进行评分，具体见下表。结果显示免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的动物肺脏病变明显减轻，与攻毒对照组相比统计学差异极显著（P<0.01），并显著低于商品化灭活疫苗（P<0.01）。说明该减毒活疫苗通过滴鼻免疫能够帮助免疫动物抵抗猪肺炎支原体感染，保护力好于目前市场上广泛使用的灭活疫苗。 

表7：滴鼻免疫猪支原体肺炎减毒活疫苗AN306株的免疫保护力评价 

实施例7：猪支原体肺炎活疫苗AN306株与副猪嗜血杆菌病灭活疫苗二联苗的免疫保护作用评价 

疫苗制备： 

猪肺炎支原体AN306株新鲜培养物，滴度为1×10⁶CCU/mL。 

血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株（该菌株为江苏省农业科学院兽医研究所自行分离得到，免疫原性好，试验证实适合用于制备副猪嗜血杆菌病灭活疫苗，保护效果良好）新鲜培养物，活菌计数后用终浓度0.2%甲醛溶液灭活12h，加入焦亚硫酸钠0.2%终止灭活。将菌数浓缩成1×10¹⁰CFU/mL。 

佐剂采用以无菌磷酸盐缓冲液配制的含有5mg/mL卡波姆和免疫刺激复合物基质（成份为Quil A500μg/mL、胆固醇100μg/mL、磷脂100μg/mL）的混合物佐剂。 

将0.5mL猪肺炎支原体新鲜培养物与0.5mL血清5型副猪嗜血杆菌灭活抗原及佐剂按照体积比1:1:2混合均匀，免疫动物。 

动物免疫及攻毒： 

10日龄左右的健康阴性苏钟猪30头，随机分成4组：G1组为健康对照组，10头，不免疫不攻毒，其中5头与G2、G3组动物同时剖检，另外5头与G4、G5组动物同时剖检；G2组为联苗免疫猪肺炎支原体攻毒组，5头，肌肉注射免 疫上述制备的联苗2mL(AN306活疫苗2.5×10⁵CCU/mL,血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株灭活抗原2.5×10⁹CFU/mL），于首次免疫后3周再次免疫，首次免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒；G3组为猪肺炎支原体攻毒对照组，5头，不免疫，与G2组动物同样攻毒；G4组为联苗免疫副猪嗜血杆菌攻毒组，5头，肌肉注射免疫上述制备的联苗2mL(AN306活疫苗2.5×10⁵CCU/mL,血清5型副猪嗜血杆菌XX0306株灭活抗原2.5×10⁹CFU/mL），于首次免疫后3周再次免疫，于首次免疫后6周腹腔注射副猪嗜血杆菌强毒攻毒；G5组为副猪嗜血杆菌攻毒对照组，5头，不免疫，与G4组动物同样攻毒。 

结果： 

（1）对猪肺炎支原体感染的保护作用 

攻毒后28天剖检，采用实施例1中描述方法对肺部猪支原体肺炎病变进行评分，记录于下表，结果可见联苗免疫后可显著减轻肺脏病变的发生程度（P<0.01）。 

（2）对副猪嗜血杆菌感染的保护作用 

副猪嗜血杆菌病临床症状表现为食欲降低，被毛粗乱，耳朵及全身皮肤发红，鼻液增多，后期出现呼吸困难，关节肿胀，卧地不起。剖检可见胸腔、腹腔积液，有不同程度的胸膜、腹膜粘连，关节肿胀、关节腔粘液增多，肺脏出血，淋巴结肿胀等病变。由上述指标判断各组动物副猪嗜血杆菌病的发病情况，总结记录于下表。结果表明联苗免疫后可显著减少动物副猪嗜血杆菌病的发病率。 

表8：猪支原体肺炎活疫苗AN306株与副猪嗜血杆菌病灭活疫苗二联苗的免疫保护作用评价 

实施例8：猪支原体肺炎活疫苗AN306株与猪繁殖与呼吸综合征活疫苗二联苗的免疫保护作用评价 

疫苗制备： 

用无菌磷酸盐缓冲液配制含有10mg/mL壳聚糖和10mg/mL左旋咪唑的混合物佐剂。取猪支原体肺炎活疫苗AN306株冻干苗，用1.5mL佐剂溶解猪肺炎支原体AN306株冻干苗，得到1头份（5×10⁵CCU）/1.5mL的猪支原体肺炎活疫苗溶液。 

商品化猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（ATCC VR-2332株）。用生理盐水溶解活疫苗，得到2头份/mL的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗溶液。 

将两种疫苗溶液按3:1(体积比)混合，免疫动物，每头动物接种2mL，即1头份猪支原体肺炎活疫苗和1头份猪繁殖与呼吸综合征活疫苗。 

动物免疫及攻毒： 

10日龄左右的健康阴性苏钟猪30头，随机分成4组：G1组为健康对照组，10头，不免疫不攻毒，其中5头与G2、G3组动物同时剖检，另外5头与G4、G5组动物同时剖检；G2组为联苗免疫猪肺炎支原体攻毒组，5头，肌肉注射免疫上述制备的联苗2mL，于首次免疫后2周再次免疫，首次免疫后8周气管内注射猪肺炎支原体强毒攻毒；G3组为猪肺炎支原体攻毒对照组，5头，不免疫，与G2组动物同样攻毒；G4组为联苗免疫猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒组，5头，肌肉注射免疫上述制备的联苗2mL，于首次免疫后2周再次免疫，于首次免疫后6周颈部肌肉注射猪繁殖与呼吸综合征病毒强毒攻毒；G5组为猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒对照组，5头，不免疫，与G4组动物同样攻毒。 

结果： 

（1）对猪肺炎支原体感染的保护作用 

攻毒后28天剖检，采用实施例1中描述方法对肺部猪支原体肺炎病变进行评分，记录于下表，结果可见联苗免疫后可显著减轻肺脏病变的发生程度（P<0.01）。 

（2）对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的保护作用 

攻毒后每日对动物进行观察并测温，发病猪的判定标准为：持续3天以上出现41℃以上高热，精神、食欲下降，出现眼结膜炎及咳嗽、喘气等呼吸道症状，死亡，剖检肺出现片状实变。结果发现猪繁殖与呼吸综合征病毒攻毒对照组动物全部发病，其中2头死亡，联苗免疫组动物无明显发病症状，全部存活。 

表9：猪支原体肺炎活疫苗AN306株与猪繁殖与呼吸综合征活疫苗二联苗的免疫保护作用评价 

Claims (13)

1.一种猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2012431。

2.权利要求1所述猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306在防治猪肺炎支原体感染疾病中的应用。

3.权利要求1所述猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306在制备猪支原体肺炎疫苗或多联疫苗中的应用。

4.一种猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗包括权利要求1所述猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306。

5.如权利要求4所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有药学上可接受的载体或辅料。

6.如权利要求4或5所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一种免疫佐剂。

7.如权利要求4或5所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一种其他病原的免疫原。

8.如权利要求7所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述其他病原包括病毒、细菌、真菌、寄生虫中的至少一种。

9.如权利要求8所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述其他病原为猪圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪鼻支原体、猪滑液支原体、猪流感病毒。

10.如权利要求4-9中的任一权利要求所述猪支原体肺炎减毒活疫苗，其特征在于所述疫苗采用的制剂为肺内注射剂、肌肉注射剂、气雾剂、口服剂或滴鼻剂。

11.一种制备猪支原体肺炎减毒活疫苗的方法，其特征在于，将权利要求1所述的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)弱毒株AN306与药学上可接受的载体或辅料，以及至少一种免疫佐剂，至少一种其他病原的免疫原组合在一起。

12.权利要求4-9中的任一权利要求所述疫苗在防治猪肺炎支原体感染疾病的中的应用。

13.如权利要求12所述的应用，所述猪肺炎支原体感染相关疾病包括猪肺炎支原体单独感染及与其他病原混合感染所导致的猪支原体肺炎疾病。