CN107349424A - 一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法，属于兽医生物制品技术领域。所述疫苗包含免疫量的猪支原体肺炎活疫苗抗原和免疫量的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥而成。该二联活疫苗各抗原成分相互不干扰或影响，反而有相互增强免疫效果的作用，一次免疫即可达到免疫保护，同时具备安全性好、制备方法简单、免疫方便快捷、降低免疫成本等优点。

Description

一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制 备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，涉及一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征，又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的以母猪发热、流产，断奶前后的仔猪死亡率升高，不同年龄猪呼吸障碍等为临床特征的疾病。它是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒有2个血清型，即美洲型和欧洲型。目前，该病是严重影响养猪业发展的重要疾病。疫苗接种是预防该病的最有效方法。
猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。
自20世纪以来，由猪繁殖与呼吸综合征、猪肺炎支原体为原发性疾病引起的PRDC给世界养猪业造成了严重损失。临床上，通常这2个疾病以混合感染的形式出现。目前面对这2种疾病的感染，由于猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪支原体肺炎活疫苗混合后免疫剂量确定及免疫安全性的问题没有解决，目前市面上仍然没有技术实现一种疫苗预防2这种疾病感染。
上述2种疾病混合感染，单苗需要多次注射，常常会给动物带来应激及安全性问题，同时免疫效果也会下降。因此，本临床上和实际应用中，需要一种能一针防治二种疾病，针对性预防猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎，减少疾病的发生率，降低生产者劳动强度，减轻动物负担。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法，包含免疫量的猪繁殖与呼吸综合征弱毒抗原和免疫量的猪支原体肺炎弱毒抗原，能够一次免疫即可到达2个疾病的免疫保护效果，同时具备安全性好、制备方法简单、免疫方便快捷、降低免疫成本等优点。
技术方案：一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，所述疫苗包含免疫量的猪支原体肺炎活疫苗抗原和免疫量的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥而成。
所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株或猪繁殖与呼吸综合征活疫苗CH-1R株；所述猪支原体肺炎疫苗毒株为猪支原体肺炎活疫苗168株或猪支原体肺炎活疫苗RM48株。
所述组合为猪支原体肺炎活疫苗168株抗原和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗CH-1R株抗原。
所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原含量为105.0-106.0TCID50/头份；猪支原体肺炎活疫苗抗原含量为106.0-107.0CCU/头份。
所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原含量为105.0TCID50/头份；猪支原体肺炎活疫苗抗原含量为106.0CCU/头份。
所述冻干保护剂质量配比为明胶占1.5％和蔗糖占12.5％，其余为水，pH值为7.0。
一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)繁殖培养猪繁殖与呼吸综合征弱毒；
(2)繁殖培养猪肺炎支原体弱毒；
(3)将所述猪繁殖与呼吸综合征弱毒和猪肺炎支原体弱毒抗原混合，按照抗原与保护剂体积比1:1加入上述冻干保护剂，分装后，进行冻干。
猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)，公开于猪繁殖与呼吸综合征病毒R98弱毒株的分离鉴定与ORF3-7基因特性研究(中国兽医学报，2008年1月，第28卷，第1期)。
猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)，公开于中国专利200710001253.0，以保藏号CGMCC No.1883保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)，公开于中国专利200610152519.7，以保藏号CGMCCNo.1816保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
猪支原体肺炎活疫苗(168株)，公开于中国专利99114276.4，以保藏号CGMCCNo.0396保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
繁殖培养猪繁殖与呼吸综合征弱毒，具体方法如下：
1生产用毒种制备 将毒种用乳汉液作适当稀释(或病毒原液)，按1％接种于MARC145细胞培养，37℃吸附30分钟，加入含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养，当CPE达75％以上时收获。
2制苗用细胞毒液的制备
2.1接种 用转瓶细胞培养法。倒去细胞培养液，将毒种液用乳汉液作适当稀释(或病毒原液)，接种于细胞上(50mL/10000mL细胞瓶)，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养(12转/小时)。
2.2观察与收获 接毒后，每日观察1～2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，在-20℃以下保存。
3效力检验 所收获的半成品根据Reed-Muench法计算TCID50。每1mL病毒含量应≥106.0TCID50。
繁殖培养猪肺炎支原体弱毒，具体方法如下：
1、生产用种子的制备 取冻干菌种，以1：100～1000稀释接种在KM2培养基中，在37℃下培养约3～7日，培养物变色，有轻微混浊时，取培养物涂片瑞氏染色，镜检，菌体形态符合标准、纯粹检验合格时，再扩大培养。继代数不超过5代。
2、制苗用培养基KM2培养基。
3、制苗用菌液制备 将生产用种子按1：100～1000接种，制备制苗用菌液培养液，在37℃下通气振荡培养7～14日，pH值达6.5～6.8时，菌数达到108CCU/mL以上时，停止培养。
4、活菌计数 取半成品，以KM2培养基作10倍连续稀释至10-12，另设KM2培养基对照3管，同批作3个重复，置37℃培养10日，检测培养基变色情况，涂片检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。培养基变色的最大稀释倍数为活菌滴度，菌数应不低于108CCU/mL。
优选地，将猪繁殖与呼吸综合征弱毒和猪肺炎支原体弱毒抗原按照1:1(v/v)的比例混合，再将混合物与蔗糖明胶保护剂1:1(v/v)比例混合均匀，最终猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗和猪肺炎支原体弱毒疫苗，优选比例为1:1(头份/头份)；然后进行分装，进行冷冻干燥，制成猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗。
本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
本发明所述提供的二联活疫苗使用方案为，运用于1-2周龄小猪，肺内注射免疫，每次1头份。
有益效果：1、本发明的猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，在一定抗原含量范围内不仅不会产生抗原成分的互相干扰或影响，还有加强相互免疫效果的作用。一次免疫即可达到单苗分次免疫的保护效果。2、本发明的猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗相比单苗，在对猪的注射免疫过程中，猪体的应激反应出人预料地小，因此本发明的二联疫苗安全性更加，避免多次接种出现不良反应。3、本发明的猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗有制备方法简单、方便。多效、低成本、疫苗效价高的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明。这些实施例仅是举例说明，不应被视为对发明总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中用于猪支原体肺炎活疫苗(168株)、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)为例说明本发明。
本发明实施例中肺病变评分标准：记录左尖叶、左心叶、左隔叶、右隔叶、右尖叶、右心叶、副叶病变比率，将0％～25％计1；26％～50％计2；51％～75％计3；76％～100％计4，统计每个试验猪肺脏病变指数(最高28)。
实施例1猪支原体肺炎活疫苗(168株)抗原和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)抗原的制备
1、猪支原体肺炎活疫苗(168株)抗原制备
1.1菌株来源：
制造及检验本品用的猪肺炎支原体168株由贵州福斯特生物科技有限公司提供。
1.2生产用种子的制备 取冻干菌种，以体积比1：100～1000稀释接种在KM2培养基中，在37℃下培养约3～7日，培养物变色，有轻微混浊时，取培养物涂片瑞氏染色，镜检，菌体形态符合标准、纯粹检验合格时，再扩大培养。继代数不超过5代。
1.3制苗用培养基KM2培养基。按照发明申请：一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用。公开号：CN105779362A。
1.4制苗用菌液制备 将生产用种子按体积比1：100～1000接种，制备制苗用菌液培养液，在37℃下通气振荡培养7～14日，pH值达6.5～6.8时，菌数达到108CCU/mL以上时，停止培养，作为半成品待检。
1.5半成品检验
1.5.1纯粹检验 按《中国兽药典》进行检验，应纯粹。
1.5.2活菌计数 取半成品，以KM2培养基作10倍连续稀释至10-12，另设KM2培养基对照3管，同批作3个重复，置37℃培养10日，检测培养基变色情况，涂片检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。培养基变色的最大稀释倍数为活菌滴度，菌数应不低于108CCU/mL。
2、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)抗原制备
2.1生产用毒种制备
2.1.1毒种繁殖 将毒种用乳汉液作适当稀释(或病毒原液)，按1％接种于MARC145细胞培养，37℃吸附30分钟，加入含4％犊牛血清的DMEM细胞维持液，37℃培养，当CPE达75％以上时收获。
2.2制苗材料的选择 MARC145细胞。
2.3制苗用细胞毒液的制备
2.3.1接种 用转瓶细胞培养法。倒去细胞培养液，将毒种液用乳汉液作适当稀释(或病毒原液)，接种于细胞上(50mL/10000mL细胞瓶)，轻轻旋转细胞瓶2周，37℃吸附10分钟，加上细胞维持液，置37℃旋转培养(12转/小时)。
2.3.2观察与收获 接毒后，每日观察1～2次，记录细胞病变情况，当病变细胞达75％以上时收获细胞和细胞液，在-20℃以下保存。
2.4半成品检验
2.4.1无菌检验 逐瓶取样，按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
2.4.2病毒含量 按1.2.1.1项进行，病毒含量应≥106.0TCID50/mL。
实施例2猪繁殖与呼吸综合征(R98株)、猪支原体肺炎(168株)二联活疫苗的制备
1、疫苗冻干保护剂处理
蔗糖明胶佐剂：将1.5％明胶，12.5％蔗糖溶于水，于115℃高压灭菌30min，并用无菌NaOH调节pH值至7.0，同时置于37℃温室备用。
2、配苗
通过无菌操作将猪繁殖与呼吸综合征(R98株)抗原和猪支原体肺炎(168株)抗原按照1:1配比，再加入同体积蔗糖明胶佐剂，混合均匀。使猪繁殖与呼吸综合征(R98株)抗原含量≥105.0TCID50/头份，猪支原体肺炎(168株)抗原含量≥106.0CCU/头份。
3、分装及冻干
将混合均匀的疫苗配制好具体各组分按照下表进行配比，定量分装，迅速进行冷冻真空干燥。
实施例3不同抗原含量猪繁殖与呼吸综合征(R98株)、猪支原体肺炎(168株)二联活疫苗效力试验
1、试验材料
实施例2中已分好组，疫苗1(猪繁殖与呼吸综合征(R98株)104TCID50/头份+猪支原体肺炎(168株)105CCU/头份)，疫苗2(猪繁殖与呼吸综合征(R98株)105TCID50/头份+猪支原体肺炎(168株)106CCU/头份)和疫苗3(猪繁殖与呼吸综合征(R98株)106TCID50/头份+猪支原体肺炎(168株)107CCU/头份)
1-2周龄无猪肺炎支原体和无猪繁殖与呼吸综合征抗体和抗原双阴性巴马猪。
2、试验方法
2.1安全试验
猪安检 用1～2周龄健康易感猪3头，各右侧肺内注射疫苗10头份，观察25日。记录如下重要的症状：咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤和死亡，注射后第1～25日的每日上午检测直肠温度。根据猪安检实验临床症状评判标准(附表)，猪安检实验全部累计总分不大于2判为安全，累计总分大于5判为不安全，累计总分2～5分，可重检1次。重检累计总分不大于2判为安全。
2.2效力试验
1-2周龄无猪肺炎支原体和无猪繁殖与呼吸综合征抗体和抗原双阴性巴马猪50，随机分组10，第1、2组免疫1头份疫苗1，第3、4组免疫1头份疫苗2，第5、6组免疫1头份疫苗3，第7、8组为对照组攻毒，第9、10组为空白组。在14天进行肺内注射免疫1头份相应疫苗。免疫35天后，第1、3、5、7组用猪肺炎支原体组织强毒(JS株)进行气管注射，5mL/头，30天后剖检统计肺部病变；免疫后35天，第2、4、6、8组用猪繁殖与呼吸综合征强毒滴鼻2mL，105.0TCID50/mL，30天后根据临床症状和病毒血症检测结果进行判定。
3试验结果
3.1安全试验结果
对仔猪进行10倍剂量肺内注射，疫苗1、疫苗2、疫苗3，注射后观察体温、食欲、精神状态，咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、食欲不振、震颤等有无可见临床反应和死亡情况。
安全试验结果显示：注射疫苗3组有个别猪体温达到40℃，可能是由于疫苗3抗原含量较其他疫苗组高，导致应激反应。
3.2效力试验结果
效力试验结果显示：免疫组(疫苗1，疫苗2，疫苗3)对猪肺炎支原体保护效率依次分别为(80％，100％，80％)，免疫组(疫苗1，疫苗2，疫苗3)对猪蓝耳病保护效率依次为(60％，80％，80％)。因此猪肺炎支原体和猪蓝耳病保护率二者冲突不大，在抗原含量足够存在前提下，疫苗2(猪繁殖与呼吸综合征(R98株)105TCID50/头份+猪支原体肺炎(168株)106CCU/头份)免疫效果最佳。

Claims (7)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述疫苗包含免疫量的猪支原体肺炎活疫苗抗原和免疫量的猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原，加入冻干保护剂，进行冷冻干燥而成。
2.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征疫苗毒株为猪繁殖与呼吸综合征活疫苗R98株或猪繁殖与呼吸综合征活疫苗CH-1R株；所述猪支原体肺炎疫苗毒株为猪支原体肺炎活疫苗168株或猪支原体肺炎活疫苗RM48株。
3.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述组合为猪支原体肺炎活疫苗168株抗原和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗CH-1R株抗原。
4.根据权利要求2所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原含量为105.0-106.0TCID50/头份；猪支原体肺炎活疫苗抗原含量为106.0-107.0CCU/头份。
5.根据权利要求4所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述猪繁殖与呼吸综合征活疫苗抗原含量为105.0TCID50/头份；猪支原体肺炎活疫苗抗原含量为106.0CCU/头份。
6.根据权利要求1所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗，其特征在于所述冻干保护剂质量配比为明胶占1.5%和蔗糖占12.5%，其余为水，pH值为7.0。
7.权利要求1~6任一所述的一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）繁殖培养猪繁殖与呼吸综合征弱毒；
（2）繁殖培养猪肺炎支原体弱毒；
（3）将所述猪繁殖与呼吸综合征弱毒和猪肺炎支原体弱毒抗原混合，按照抗原与保护剂体积比1:1加入保护剂配方为权利要求6所述，分装后，进行冻干。
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