CN109078003B - 一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法 - Google Patents
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Abstract
一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,其特征在于包括猪支原体肺炎抗原制备,冻干保护剂配制,抗原与保护剂的配比与混合分装,大规格疫苗的冻干组成,最后制成猪肺炎支原体活疫苗。该大规格生产方法,能在每个西林瓶(体积为7mL或10mL)中装50或100头份大规格容量,同时最优化每头份抗原效价能达到≥108CCU(国家标准100倍以上),同时安全性好、制备方法简单、降低成本等优点。
Description
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域,涉及一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法。
背景技术
猪支原体肺炎又称猪气喘病,是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病,广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外,且易继发病毒或细菌感染,造成猪死亡率升高,导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。
近年来,猪支原体肺炎活疫苗应用逐步重视和广泛应用,传统生产10头份、20头份装量产品在免疫使用过程中存在频繁稀释操作的步骤。南京天邦生物科技有限公司申请的发明:一种猪支原体肺炎活疫苗50头份产品快速冻干方法,申请号201711096020.3,只报道了50头份的冻干方法,但是没有50头份及以上100头份的大规格整体生产方法的报道。
因此,应对规模化养殖场使用大规格猪支原体肺炎活疫苗的需求,迫切需要大规格50头份、100头份的大规格整体生产方法,同时使产品质量高度稳定,抗原含量达到国家标准100倍以上。
发明内容
解决的技术问题:本发明提供一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,能在每个西林瓶(体积为7mL或10mL)中装50或100头份大规格容量,且每头份抗原效价能达到≥108CCU(国家标准100倍以上),同时安全性好、制备方法简单、成本降低。
技术方案:一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,包括猪支原体肺炎抗原制备,冻干保护剂配制,抗原与保护剂的配比与混合分装,大规格疫苗的冻干组成,最后制成猪肺炎支原体活疫苗。
上述猪支原体肺炎抗原的制备方法为:1)生产一级种子液制备:从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌种,在无菌操作间,无菌打开,用pH值为7.4-7.6的KM2液体培养基原体积溶解冻干菌种,并按照质量比1:10继代于KM2液体培养基中,放入37℃恒温培养箱48-72小时,待培养物颜色略微变黄,pH值为6.2-6.8时,收获菌液,纯粹检验合格作为一级种子液;2)重复步骤1),分别扩大培养制备二级种子液和三级种子液;3)将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为20L,培养基初始pH值调为7.6,37℃培养,转速设定为100r/min,培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次,pH值为6.2-6.8时,到达要求后收获,经纯粹检验及无菌检验合格后,准备再次放大;4)将30L种子罐内的培养物按照质量比5%-10%接种到300L培养罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为200L,培养基初始pH值为7.6,37℃静置培养24h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化,24h后按照搅拌速度100-150r/min,工作罐压维持在0.06-0.08MPa,通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持在饱和浓度的30%-60%,补充NaOH碱液以维持pH值的稳定在7.2,并在补充葡萄糖维持1000mg/L,培养24h后,每间隔8h,取样进行CCU测定,绘制培养物的生长曲线;5)测定培养物在发酵罐培养64-72h时滴度达到109CCU/mL,收获培养物。
上述冻干保护剂含有明胶和蔗糖,其余为蒸馏水,其中明胶含量为1.5wt.%~10wt.%,蔗糖含量百分比12.5wt.%~25wt.%。
优选的,上述明胶含量为3wt.%或6wt.%,蔗糖含量为25wt.%。
优选的,上述抗原与冻干保护剂在37℃温室下混合,其抗原与冻干保护剂的体积比为5:5、6:4、7:3、8:2或9:1。
优选的,上述抗原与冻干保护剂分装在7mL或10mL西林瓶中,装量体积分别为2mL、3mL或4mL。
上述冻干技术为先进行-40℃预冻3h~4h,一期升华-40℃~-15℃,18h~28h,干燥-15℃~28℃,14h~17h;或者,-40℃预冻4h,一期升华-40℃~-15℃,14h~18h,干燥-15℃~28℃,6h~14h;程序控温设定:-50℃30min;-8℃15h;13℃1h10min;28℃6h50min,最后启动压塞,进行冻干疫苗的压塞、出箱
有益效果:1、本发明的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,采用发酵罐培养方式,大批次培养的抗原量比传统转瓶培养效价更高,生产出的50、100头份成品的抗原含量达到国家标准100倍以上。2、本发明的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,50、100头份在7mL或10mL西林瓶上实现了装量4mL即可达到现行版《中国兽药典》对于猪支原体肺炎活疫苗的质量要求。最终,本发明的猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法具有大产能是传统方式100倍,抗原含量标准又能达到传统方式的100倍,均一性和稳定性,能适应规模化生产的需要。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步描述本发明。这些实施例仅是举例说明,不应被视为对发明总体范围的任何限制。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换,均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中用于猪支原体肺炎活疫苗(168株)为例说明本发明。本发明中的术语“头份”是指每头猪注射的疫苗量。
实施例1猪支原体肺炎活疫苗(168株)抗原制备
1.材料
1.1毒株:猪支原体肺炎活疫苗(168株)由贵州福斯特生物科技有限公司提供。
1.2材料:KM2培养基及相关实验耗材由贵州福斯特生物科技有限公司提供,细菌发酵罐生产车间由湖北大学生命科学学院提供。
2.方法
将猪支原体肺炎活疫苗(168株)按照程序一级种子液、二级种子液、三级种子液、30L种子罐、300L培养罐的培养方式,进行分步放大发酵培养,最后设定培养罐的培养条件的优化设计按照单个变量顺次进行,共进行了个参数的优化,根据发酵结束时支原体滴度的变色单位(Colour Change Unit,CCU)结果判定优化效果。
CCU含量测定方法操作如下:将猪肺炎支原体待测培养物用KM2培养基进行10倍连续稀释,即1.8mL KM2培养基接种0.2mL样品,依次1:10递减连续稀释成10-1、10-2……10-8、10-9、10-10、10-11、10-12,另设KM2培养基对照3管,共15管,同批作3个重复,置37℃培养,每日观察记录培养基颜色变化和混浊度的变化直至第10日,并对培养物涂片,染色,镜检,检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。稀释培养后,菌体生长、变色的最高稀释度为待检培养物CCU含量。
2.1种子罐的培养步骤:
1)生产一级种子液制备:从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌种,在无菌操作间,无菌打开,用KM2液体培养基(pH值为7.4-7.6)原体积溶解冻干菌种,并按照1:10继代于KM2液体培养基中,放入37℃恒温培养箱48-72小时,待培养物颜色略微变黄,pH值为6.2-6.8时,收获菌液,纯粹检验合格作为一级种子液。
2)重复步骤1),分别扩大培养制备二级种子液、三级种子液。
3)将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为20L,培养基初始pH值调为7.6,37℃培养,转速设定为100r/min,培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次,pH值为6.2-6.8时,到达要求后收获,经纯粹检验及无菌检验合格后,准备再次放大。
2.2培养罐的培养步骤及参数优化:
2.2.1培养罐的培养步骤
将30L种子罐内的培养物按照质量比5%-10%接种到300L培养罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为200L,培养基初始pH值为7.6,37℃静置培养24h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化,24h后按照搅拌速度100-150r/min,工作罐压维持在0.06-0.08MPa,通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持溶氧值、补充NaOH碱液以维持pH值的稳定在7.2,并在补充葡萄糖维持1000mg/L,培养24h后,每间隔8h,取样进行CCU测定,绘制培养物的生长曲线;5)测定培养物在发酵罐培养64-72h时滴度达到109CCU/mL,收获培养物。
2.2.2培养罐培养时间的优化
在300L发酵罐中进行,培养基体积为200L,培养基初始pH值调为7.6,将生长稳定的二级种子液按照10wt.%接种,37℃培养,转速设定为100r/min,培养32h、40h、48h、56h、64h、72h、80h各取样1次,分别进行CCU测定。
2.2.3培养罐接种密度的优化
在300L发酵罐中进行,培养基体积为200L,培养基初始pH值调为7.6,将生长稳定的二级种子液按照1wt.%,5wt.%,10wt.%和15wt.%接种量接种到发酵罐中,37℃培养,转速设定为100r/min,培养64h取样,分别进行CCU测定。
2.2.4培养罐pH值的优化
按照5wt.%接种量在300L发酵罐中进行,培养基体积为200L,培养基初始pH值调为7.0、7.2、7.6、7.8和8.2,37℃培养,37℃培养,转速设定为100r/min,培养64h取样,分别进行CCU测定。
2.3.5培养罐搅拌速度的优化
按照5wt.%接种量在300L发酵罐中进行,培养基体积为200L,培养基初始pH值调为7.6,转速分别设定为50r/min、100r/min、200r/min,37℃培养,培养64h取样,分别进行CCU测定。
2.3.6培养罐通气量的优化
按照5wt.%接种量在300L发酵罐中进行,培养基体积为200L,培养基初始pH值调为7.6,转速设定为100r/min,37℃培养。通气方式分3种,分别为发酵前一次性通气、100L/min固定不变、200L/min固定不变和300L/min固定不变,各培养64h取样,分别进行CCU测定。
3.结果
3.1种子罐的培养
根据种子罐的培养步骤,从菌种到一级种子液、二级种子液、三级种子液的过程有活化菌种,提高繁殖性能及放大种子液体积的特点。最后,在pH值为6.2-6.8时,停止培养种子罐,种子罐培养时间确定在48-56小时。
3.2培养罐的培养时间优化
培养罐的不同培养时间的CCU测定结果显示,64-72h为最佳培养时间,过早或过晚停止发酵培养物滴度均偏低(见表1),发酵后64-72h可能猪肺炎支原体正处于对数生长期,尚未进入衰退期,所以滴度相对较高。
表1培养时间对猪肺炎支原体生长的影响
3.3培养罐接种密度的优化
培养罐不同接种密度的CCU测定结果显示,接种密度对猪肺炎支原体产生较大影响,5wt.%-10wt.%的接种量比较适宜(表2)。过低的接种密度会导致支原体生长过慢,过高则会使营养物质早期大量消耗,致使支原体生长提前进入衰亡期。
表2接种密度对猪肺炎支原体生长的影响
3.4培养罐pH值的优化
培养罐不同pH值设定的CCU测定结果显示,发酵前培养基的pH值对猪肺炎支原体发酵有重要影响,pH值在7.2~7.6范围内所得菌数较高,为最适pH值范围(见表3)。pH值过低或过高均达不到良好的效果。
表3pH值对猪肺炎支原体生长的影响
3.5培养罐搅拌速度的优化
培养罐不同搅拌速度设定的CCU测定结果显示,不同搅拌转速对猪肺炎支原体发酵有重要影响,100-150rpm为最适宜转速,过低生长速度较慢,过高则导致菌体大量死亡(见表4)。
表4搅拌速度对猪肺炎支原体生长的影响
3.6培养罐通气量的优化
培养罐不同通气量设定的CCU测定结果显示,通气量的改变对猪肺炎支原体生长有一定程度的影响,一次性通气和100L/min最为适宜,通气量过大会使产量效价降低(见表5)。
表5通气量对猪肺炎支原体生长的影响
4总结
针对猪支原体肺炎活疫苗(168株)从菌种生产发酵最终结束,发酵罐体在300L,使用KM2液体培养基的情况下,对种子罐培养条件、培养罐培养时间、培养罐接种密度、培养罐pH值、培养罐搅拌速度和培养罐通气量等6项发酵参数进行了优化试验,即发酵时选择加入5%的培养罐体积的种子液、调节培养基pH值7.2~7.6、转速100-150rpm,发酵前补入足量灭菌空气,以维持溶氧值在饱和浓度的30%-60%,发酵56-72h后即可收获,得到最优化的生产工艺参数。
实施例2猪支原体肺炎活疫苗(168株)制备的半成品检验
按照实施例1上述最优方案结论,测试得到猪支原体肺炎活疫苗(168株)半成品的培养效价达到109每毫升,纯粹检验合格,达到了现行版《中国兽药典》标准。具体如下要求:
1纯粹检验按现行版《中国兽药典》进行检验,应纯粹。
2活菌计数取半成品,以KM2培养基作10倍连续稀释至10-12,另设KM2培养基对照3管,同批作3个重复,置37℃培养10日,检测培养基变色情况,涂片检查有无典型猪肺炎支原体菌体形态。培养基变色的最大稀释倍数为活菌滴度,菌数应不低于109CCU/mL。
实施例3猪支原体肺炎活疫苗(168株)大规格生产参数确定
按照保护剂配方浓度分别为1.5wt.%、3.0wt.%、6.0wt.%、9.0wt.%、10.0wt.%,蔗糖浓度分别为12.5wt.%、25wt.%,配制好保护剂,同时设定抗原与保护剂的质量配比分别为5:5,6:4,7:3,8:2,9:1,同时设定在10mL西林瓶的装量为2、3、4mL设立正交实验测定不同方案所制备的CCU细菌计数,见表6。
按照以下面程序进行冻干程序设定,-40℃预冻4h,一期升华-40℃~-15℃,28h,干燥-15℃~28℃,17h;或者,-40℃预冻4h,一期升华-40℃~-15℃,18h,干燥-15℃~28℃,14h;-40℃预冻4h,一期升华-40℃~-15℃,14h,干燥-15℃~28℃,6h。进行预实验,测定上述2条冻干曲线的范围,及冻干样品的物理性状。最终设定为,-40℃预冻3h;程序控温设定:-50℃30min;-8℃15h;13℃1h10min;28℃6h50min。最后启动压塞,进行冻干疫苗的压塞、出箱。
表6在不同方案下每瓶疫苗在50头份、100头份计数的CCU测定
结果:在方案8明胶含量6%,蔗糖含量25%,装量2mL的体系,50头份、100头份规格中,能到达每头份细菌计数为107CCU;在方案18、23、28中也能达到每头份细菌计数为107CCU,更优选的在方案29中,50头份、100头份规格每头份细菌计数为108CCU。同步,在7mL西林瓶中进行上述实验方法测定,结果无显著性差异。
实施例4猪支原体肺炎活疫苗(168株)优化方案的成品检验
将实施例3中所得的方案8、18、23、28、29的方案进行成品检验,包括真空度测定,剩余水分测定,纯粹检验,鉴别检验,安全检验,物理性状等项目,具体见表7。
表7猪支原体肺炎活疫苗(168株)优化方案的成品检验结果
结果:在方案8、18、23、28、29中达到现行版《中国兽药典》的标准,根据最优方案,装量4mL的方案29,明胶含量9%,蔗糖含量25%,疫苗半成品与保护剂为8:2,能够达到最佳的CCU测定结果,达到每头份108CCU国家标准100倍。
Claims (1)
1.一种猪肺炎支原体活疫苗大规格生产方法,其特征在于1)生产一级种子液制备:从菌种库里面取出猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌种,在无菌操作间,无菌打开,用pH值为7.4-7.6的KM2液体培养基原体积溶解冻干菌种,并按照质量比1:10继代于KM2液体培养基中,放入37℃恒温培养箱48-72小时,待培养物颜色略微变黄,pH值为6.2-6.8时,收获菌液,纯粹检验合格作为一级种子液;2)重复步骤1),分别扩大培养制备二级种子液和三级种子液;3)将生产及检验好的三级种子液按照质量比1:10接种于30L种子罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为20L,培养基初始pH值调为7.6,37℃培养,转速设定为100r/min,培养24h、32h、40h、48h、56h各取样1次,pH值为6.2-6.8时,到达要求后收获,经纯粹检验及无菌检验合格后,准备再次放大;4)将30L种子罐内的培养物按照质量比5%-10%接种到300L培养罐内的KM2液体培养基中,培养基体积为200L,培养基初始pH值为7.6,37℃静置培养24 h内pH值、溶氧、葡萄糖水平无明显变化,24h后按照搅拌速度100 -150r/min,工作罐压维持在0.06-0.08MPa,通气量维持在100L/min、200L/min、300L/min或一次性通气以维持在饱和浓度的30%-60%,补充NaOH碱液以维持pH值的稳定在7.2,并在补充葡萄糖维持1000mg/L,培养24h后,每间隔8h,取样进行CCU测定,绘制培养物的生长曲线;5)测定培养物在发酵罐培养64-72h时滴度达到109CCU/mL,收获培养物;上述冻干保护剂含有明胶和蔗糖,其余为蒸馏水,其中明胶含量为3wt.%或6wt.%,蔗糖含量为25 wt.%,上述抗原与冻干保护剂在37℃温室下混合,其抗原与冻干保护剂的体积比为5:5、6:4、7:3、8:2或9:1,抗原与冻干保护剂分装在7mL或10mL西林瓶中,装量体积分别为2mL、3mL或4mL,上述冻干技术为先进行-40℃预冻3h~4h,一期升华-40℃~-15℃,18h ~28h,干燥-15℃~28℃,14h ~17h;或者,-40℃预冻4h,一期升华-40℃~-15℃,14h ~18h,干燥-15℃~28℃,6h ~14h;程序控温设定:-50℃30min;-8℃ 15h;13℃ 1h10min;28℃ 6h50min,最后启动压塞,进行冻干疫苗的压塞、出箱。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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