CN105779362A

CN105779362A - 一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN105779362A
Application number: CN201610320680.4A
Authority: CN
Inventors: 朱燕锋; 罗意; 卢业云; 许俊才
Original assignee: Nanjing Dayao Network Technology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Dayao Network Technology Co Ltd
Priority date: 2016-05-16
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2016-07-20

Abstract

一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用，该培养基由基础培养基和辅助培养基制成，主要成分有MEM，胆固醇，氨基酸，无机盐，葡萄糖，猪血清等组成，基础培养基通过高压灭菌和辅助培养基通过过滤除菌，最终混合后，调整pH值，既得到猪肺炎支原体液体培养基。本发明所述的培养基，既简化了传统培养基的复杂成分物质，降低了企业的生产成本，又减少了猪血清的使用量，降低了猪血清对猪体的过敏反应，同时用CCU方法测定该培养基制备的菌液效价达到10^8‑9/mL，适用于培养猪肺炎支原体168株生长。

Description

一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，涉及一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。

目前，培养猪肺炎支原体活疫苗的培养基主要有1975年Goodwin等发明的Friis培养基，2006年农业行业标准中提出的A₂₆培养基，以及江苏省农科院发明的KM₂培养基等。

南京天邦生物科技有限公司，于2012年发明的一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，初步解决了培养基及其培养工艺在培养猪肺炎支原体168株存在的所用动物血清过多易引起过敏反应，降低血清中外源病毒或其他微生物会加大猪肺炎支原体活疫苗培养的风险。

在以上所有培养基及培养方式上，仍然需要进一步降低血清的使用剂量，甚至无血清培养基的高效培养方式，才能达到目前的培养需求。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用，能够降低培养猪肺炎支原体所需的血清用量，达到传统培养基的培养效果。

技术方案：一种低血清培养猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中基础培养基包括MEM3-4g、酵母粉1-2g、葡萄糖3-4g、蛋白胨6-8g、0.5wt.%酚红溶液1-2mL、氯化钠1-2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.5-1.0g、KH₂PO₄0.1-0.2g、去离子水400-600mL；辅助培养基包括酵母浸出汁30-60mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5-1mL，3wt.%谷氨酰胺溶液40-50mL，青霉素终浓度为100-300U/mL，灭活的猪血清40-100mL；所述基础培养基还含有氯化钾0.1-0.5g；所述辅助培养基还含有0.01g/mL胆固醇甘油溶液5-10mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5-1mL，10wt.%L-半胱氨酸溶液1-2mL；最后，将配置好的基础培养基和辅助培养基混合，并用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4-7.6。

上述方案中，以整体计每400mL培养基中加灭活的猪血清不高于40mL，即整体培养基中血清添加的体积比例小于10%。

上述0.01g/mL胆固醇甘油溶液的制备方法为：用0.1-0.5g胆固醇溶于10-50mL甘油内，并在116℃灭菌30min，冷却至37℃。

低血清培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，按照下列步骤进行：a、制备基础培养基：将基础培养基的所有成分，搅拌均匀混合，全部溶解，在116℃灭菌30min，待冷却后备用；b、制备辅助培养基：将辅助培养基的成分过滤除菌，混合搅拌，既得辅助培养基；c、将高压冷却灭菌好的基础培养基和辅助培养基混合，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值7.4-7.6，分装备用。

上述培养基在培养猪肺炎支原体中的应用。

有益效果：1、本发明制备的猪肺炎支原体培养基，在培养肺炎支原体时可以降低培养基中血清的使用量，达到传统培养基的培养效果，并能减少动物应激反应。

2、本发明制备的猪肺炎支原体培养基，用CCU方法测定该培养基制备的菌液效价达到10^8-9/mL，在培养基原料种类及成本上明显优于KM₂培养基，达到培养猪支原体肺炎弱毒活疫苗（168株）的生产要求。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在不背离发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、制备基础培养基：

将基础培养基为MEM3.1g、酵母粉1.3g、葡萄糖3.3g、蛋白胨3.3g、0.5wt.%酚红溶液1.5mL、氯化钠1.15g、氯化钾0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.6g、KH₂PO₄0.04g、搅拌混匀，溶解至离子水400mL中，在116℃灭菌30min，待冷却后备用。

2、制备辅助培养基：

辅助培养基的各成分按照如下步骤进行：

a、酵母浸出汁45mL，按照如下方法配置：取鲜酵母25g，加双蒸水150mL，37℃搅拌充分溶解后，煮沸5min，快速冷却，5000rpm离心30min，取上清，过滤除菌或115℃高压20min后，无菌分装，经性状，无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

b、0.01g/mL胆固醇甘油溶液5mL，按照如下方法配置：用0.1g胆固醇溶于10mL甘油内，并在116℃灭菌30min，冷却至37℃，贴签，2-8℃保存备。

c、10wt.%甘氨酸溶液0.5mL，按照如下方法配置：将10g甘氨酸溶于100mL双蒸水中，经过无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

d、20wt.%L-精氨酸溶液0.5mL，按照如下方法配置：将20gL-精氨酸盐酸盐溶于100mL双蒸水中，经过滤无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

e、10wt.%L-半胱氨酸溶液1.0mL，按照如下方法配置：将10gL-半胱氨酸溶于100mL双蒸水中，经过滤无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

f、3wt.%谷氨酰胺溶液50mL，按照如下方法配置：将3g谷氨酰胺溶于100mL双蒸水中，经过滤无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

g、青霉素200U/mL，按照如下方法配置：将青霉素钠1万-15万单位溶于10mL双蒸水中，经过滤无菌检验合格后，贴签，-20℃保存备用。

h、灭活的猪血清50mL，猪血清经辐照灭菌处理。

将辅助培养基为酵母浸出汁45mL，0.01g/mL胆固醇甘油溶液5mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5mL，20wt.%L-半胱氨酸溶液0.5mL，3wt.%谷氨酰胺溶液50mL，青霉素终浓度为200U/mL，灭活的猪血清50mL，处理好后，将各成分混合均匀。

3、将高压冷却灭菌好的基础培养基和处理好的辅助培养基混合，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值7.4-7.6，既得到低血清培养猪肺炎支原体培养基，分装备用。

实施例2

1、制备基础培养基：

将基础培养基为MEM3.1g、酵母粉1.3g、葡萄糖3.3g、蛋白胨3.3g、0.5wt.%酚红溶液1.5mL、氯化钠1.15g、氯化钾0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.6g、KH₂PO₄0.04g、搅拌混匀，溶解至离子水500mL中，在116℃灭菌30min，待冷却后备用。

2、制备辅助培养基：

辅助培养基的各成分按照如下步骤进行：

b、0.01g/mL胆固醇甘油溶液6mL，按照如下方法配置：用0.5g胆固醇溶于50mL甘油内，并在116℃灭菌30min，冷却至37℃，贴签，2-8℃保存备。

h、灭活的猪血清68mL，猪血清经辐照灭菌处理。

将辅助培养基为酵母浸出汁45mL，0.01g/mL胆固醇甘油溶液6mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5mL，10wt.%L-半胱氨酸溶液1mL，3wt.%谷氨酰胺溶液50mL，青霉素终浓度200U/mL，灭活的猪血清68mL，处理好后，将各成分混合均匀。

实施例3

1、分别制备本发明的培养基由无相关成份

按照江苏省农科院兽医所猪肺炎支原体168株培养方法，分别接种于本发明的低血清培养猪肺炎支原体培养基1（根据实施例1要求进行配制）及培养基2（根据实施例1要求进行配制）但未添加0.01g/mL胆固醇甘油溶液、10%甘氨酸溶液，10%L-半胱氨酸溶液的成份；种子继代复壮后，按照1:10的体积比例接种（菌种1：培养基10），37℃培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.6降至6.5-6.8时，取出培养物。

2、CCU（颜色变化单位）：

CCU测定取13个10mL管制玻璃瓶，每瓶分装待检KM₂培养基1.8mL，接种0.2mL连续复壮后的菌种培养物至第一瓶，更换枪头吹打混匀，每个稀释瓶固定吹打15次，吸取0.2mL再接种至第2瓶，依次做10倍系列稀释至第12瓶。第13瓶为阴性对照。做好标记，放置37℃培养10天，每日观察记录培养基颜色变化情况。观察至第10日，结果判定，如培养基对照管不变色，液体培养物按其稀释度依次有颜色变化，则试验成立。每组管制玻璃瓶中液体培养物变色的最高稀释度即为CCU含量，记录3组平行实验结果。

3、结果CCU/0.2mL

由CCU测定可知，本发明制备的培养基1测得3个平行组的结果分别为10⁹CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，结果换算成5×10⁹CCU/mL；而培养基2（未添加0.01g/mL胆固醇甘油溶液、10%甘氨酸溶液，10%L-半胱氨酸溶液）测得3个平行组的结果分别为10⁷CCU/0.2mL，10⁷CCU/0.2mL，10⁸CCU/0.2mL，结果换算成5×10⁷CCU/mL。

未添加胆固醇甘油溶液、甘氨酸溶液，L-半胱氨酸溶液的培养基2与已添加上述成份的培养基1，培养效果差异显著，差距约100倍，说明在本发明中的相关成份对猪肺炎支原体168株培养效果有一定作用。

实施例4

1、猪肺炎支原体菌株与培养条件

按照江苏省农科院兽医所猪肺炎支原体168株培养方法，分别接种于本发明的低血清培养猪肺炎支原体培养基（根据实施例1要求进行配制）、KM₂培养基，以及南京天邦生物科技有限公司2012年发明的低血清高效培养基（CN103060220A），种子继代复壮后，按照1:10的体积比例接种（菌种1：培养基10），37℃培养，当培养基的颜色变黄、pH值由7.6降至6.5-6.8时，取出培养物。

2、CCU（颜色变化单位）：

3、结果CCU/0.2mL

由CCU测定可知，本发明制备的培养基测得3个平行组的结果分别为10⁹CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，结果换算成5×10⁹CCU/mL；而KM₂培养基测得3个平行组的结果分别为10⁸CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，10⁸CCU/0.2mL，结果换算成5×10⁸CCU/mL；南京天邦生物科技有限公司制备的培养基测得3个平行组的结果分别为10⁸CCU/0.2mL，10⁸CCU/0.2mL，10⁹CCU/0.2mL，结果换算成5×10⁸CCU/mL。

从猪肺炎支原体（168株）使用本发明制备的培养基、KM2培养基、南京天邦生物科技有限公司的培养基的活菌滴度（CCU）测定结果看，在同样的试验条件下，本发明的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基CCU测定结果均在5×10⁹CCU/mL；而KM2培养基、南京天邦生物科技有限公司发明的培养基CCU测定结果均为5×10⁸CCU/mL。说明本发明的低血清高效培养猪肺炎支原体具有生长迅速，活菌滴度高的特点。

Claims

1.一种低血清培养猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中基础培养基包括MEM3-4g、酵母粉1-2g、葡萄糖3-4g、蛋白胨6-8g、0.5wt.%酚红溶液1-2mL、氯化钠1-2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.5-1.0g、KH₂PO₄0.1-0.2g、去离子水400-600mL；辅助培养基包括酵母浸出汁30-60mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5-1mL，3wt.%谷氨酰胺溶液40-50mL，青霉素终浓度为100-300U/mL，灭活的猪血清40-100mL；其特征在于所述基础培养基还含有氯化钾0.1-0.5g；所述辅助培养基还含有0.01g/mL胆固醇甘油溶液5-10mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5-1mL，10wt.%L-半胱氨酸溶液1-2mL；最后，将配置好的基础培养基和辅助培养基混合，并用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4-7.6。

2.根据权利要求1所述的一种低血清培养猪肺炎支原体培养基，其特征在于以整体计每400mL培养基中加灭活的猪血清不高于40mL，即整体培养基中血清添加的体积比例小于10%。

3.根据权利要求1所述的一种低血清培养猪肺炎支原体培养基，其特征在于所述0.01g/mL胆固醇甘油溶液的制备方法为：用0.1-0.5g胆固醇溶于10-50mL甘油内，并在116℃灭菌30min，冷却至37℃。

4.根据权利要求1~3任一所述低血清培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于按照下列步骤进行：

a、制备基础培养基：将基础培养基的所有成分，搅拌均匀混合，全部溶解，在116℃灭菌30min，待冷却后备用；

b、制备辅助培养基：将辅助培养基的成分过滤除菌，混合搅拌，既得辅助培养基；

c、将高压冷却灭菌好的基础培养基和辅助培养基混合，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值7.4-7.6，分装备用。

5.权利要求1~3任一所述培养基在培养猪肺炎支原体中的应用。