CN103060220B - 一种高效猪肺炎支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高效猪肺炎支原体培养基及其制备方法，属于兽医生物学技术领域。包括A液、B液，主要有MEM、酵母浸出粉、胰蛋白胨，葡萄糖，无机盐等组成，本发明配制的培养基主要优势在于血清含量低，仅为10%～15%，而普通培养基猪血清含量为20%，甚至更高，低血清制备的培养基减轻了猪体的过敏应激反应，同时还兼顾到动物的生物安全；另外用本发明方法制备的半成品菌液效价高达10⁹CCU/ml，远远高于目前普遍技术配制的培养基。

Description

一种高效猪肺炎支原体培养基及其制备方法

技术领域

本发明属于兽医生物学技术领域，涉及一种高效猪肺炎支原体培养基及其制备方法。

背景技术

 猪肺炎支原体主要引起猪的慢性呼吸道疾病，是造成养猪业经济损失的最重要的疾病之一。猪肺炎支原体广泛分布于世界各地，猪感染后导致生长发育不良、生长率和饲料转化率降低，且易引起继发性病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。本病的预防应采用综合的措施、给猪体提供一个理想的环境是基础，包括通风、温度及合理的饲养密度和饲养方式，药物治疗虽有效，但由于长期治疗耗费大量药物，并带来肉质药物残留的突出问题，因此疫苗预防是重要的防制手段。

目前猪肺炎支原体疫苗生产中，培养猪肺炎支原体培养基有很多种，有煮沸猪肺组织的灭活细胞培养基，猪肺埋块无细胞培养基，江苏省农业科学院创造的KM2培养基等。

以上述传统培养基及培养工艺所培养的猪肺炎支原体繁殖能力差、活菌滴度低，加之过量血清制备的活疫苗无疑增加猪体的过敏应激反应，最终影响疫苗的免疫效力。

发明内容

本发明所要解决的问题是提供一种高效猪肺炎支原体培养基，该培养基的特点是低血清含量，培养猪肺炎支原体抗原效价高。

本发明另一目的是提供该猪肺炎支原体培养基的制备方法。

本发明所述问题是以下述技术方案解决的：

    一种高效猪肺炎支原体培养基，该培养基由A液和B液无菌处理后添加健康猪血清、 蒸馏水混合制成，其中的A液和B液的组分分别为：

A液：

（1）MEM                       0.6～0.7%

（2）酵母浸出粉                  0.2～0.4%

（3）胰蛋白胨                    0.6～0.8%

（4）葡萄糖                      0.6～0.8%

（5）质量浓度为1%的酚红溶液     0.1～0.2%

（6）Na₂HPO₄·12H2O              0.1～0.2%

（7）KH₂PO4                    0.005～0.009%

（8）NaCl                        0.2～0.3%

B液：

（9）新鲜酵母粉                    1.2～1.4%

（10）谷氨酰胺                     0.02～0.03%

（11）精氨酸单盐酸盐               0.015%

（12）青霉素                       200～400u/ml

健康猪血清                         10～15%                  

所述的高效猪肺炎支原体培养基制备方法，包括如下步骤：

（1）制备A液：

取上述A液（1）～(8)成分配比逐一溶入500ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min后备用；

（2）制备B液：

按配比称取权利要求1中（9）～(12)各成分逐一溶入200ml蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

（3）高效培养基制备：

此步骤需无菌操作，将过滤的B液添加到高压灭菌后的A液中，然后按配比添加健康猪血清100～150ml，最后用无菌的蒸馏水定容至1000ml，混和均匀，用10%的氢氧化钠溶液调pH至7.4～7.6，分装备用。

    本发明的高效猪肺炎支原体培养基运用微生物学、无机、有机分析化学的技术原理，对不同的氮源、碳源、蛋白质、无机盐和胆固醇等诸多营养组分的组合进行了筛选，对培养基的pH值、渗透压等进行分析，研究出了适合培养高效猪肺炎支原体的培养基。该培养基的配方中除基本成分外，在培养基中还添加了新鲜酵母浸出液、谷氨酰胺、精氨酸单盐酸盐，上述成分的添加能明显提高猪肺炎支原体的活菌滴度；未添加前的活菌滴度为10⁸CCU/ml，添加后活菌滴度为10⁹CCU/ml。而本发明最大的优势在于猪血清用量仅为10%～15%，大大减轻了活疫苗中猪血清对猪体的过敏应激反应，为我们的养殖事业保驾护航。

 具体实施方式

实施例1

1、本发明培养基的制备

1.1A液：

（1）MEM                       6g

（2）酵母浸出粉                  2g

（3）胰蛋白胨                    6g

（4）葡萄糖                      6g

（5）质量浓度为1%的酚红溶液     1ml

（6）Na₂HPO₄·12H2O              1g

（7）KH₂PO4                     0.05g

（8）NaCl                         2g

B液：

（9）新鲜酵母粉                     120g

（10）谷氨酰胺                      0.2g

（11）精氨酸单盐酸盐               0.15g

（12）青霉素                       200u/ml

健康猪血清                         100ml               

2、所述的高效猪肺炎支原体培养基制备方法，包括如下步骤：

（1）制备A液：

取上述A液（1）～(8)成分配比逐一溶入500ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min后备用；

（2）制备B液：

按配比称取权利要求1中（9）～(12)各成分逐一溶入200ml蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

（3）高效培养基制备：

此步骤需无菌操作，将过滤的B液添加到高压灭菌后的A液中，然后按配比添加健康猪血清100ml，最后用无菌的蒸馏水定容至1000ml，混和均匀，用10%的氢氧化钠溶液调pH至7.4～7.6，分装备用。

实施例2

1、本发明培养基的制备

1.1A液：

（2）MEM                       7g

（3）酵母浸出粉                  4g

（4）胰蛋白胨                    8g

（5）葡萄糖                      8g

（5）质量浓度为1%的酚红溶液     2ml

（6）Na₂HPO₄·12H2O              2g

（7）KH₂PO₄                     0.09g

（8）NaCl                         3g

B液：

（9）新鲜酵母粉                   140g

（10）谷氨酰胺                     0.3g

（11）精氨酸单盐酸盐               0.15g

（12）青霉素                       400u/ml

健康猪血清                         150ml                  

2、所述的高效猪肺炎支原体培养基制备方法，包括如下步骤：

（1）制备A液：

取上述A液（1）～(8)成分配比逐一溶入500ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min后备用；

（3）制备B液：

按配比称取权利要求1中（9）～(12)各成分逐一溶入200ml蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

（3）高效培养基制备：

此步骤需无菌操作，将过滤的B液添加到高压灭菌后的A液中，然后按配比添加健康猪血清150ml，最后用无菌的蒸馏水定容至1000ml，混和均匀，用10%的氢氧化钠溶液调pH至7.4～7.6，分装备用。

实施例3

应用猪肺炎支原体分别通过本发明支原体培养基、KM2培养基、PPLO支原体培养基对猪肺炎支原体进行比较培养试验。

1、本发明培养基的制备

A液：

（1）MEM                       6.3g

（2）酵母浸出粉                  2.7g

（3）胰蛋白胨                    6.7g

（4）葡萄糖                      6.7g

（5）质量浓度为1%的酚红溶液     1.5ml

（6）Na₂HPO_4.12H₂O               1.2g

（7）KH₂PO₄                                 0.08g

（8）NaCl                         2.3g

B液：

（9）新鲜酵母粉                   130g

（10）谷氨酰胺                     0.25g

（11）精氨酸单盐酸盐               0.17g

（12）青霉素                       300u/ml

健康猪血清                         120ml                  

2、所述的高效猪肺炎支原体培养基制备方法，包括如下步骤：

（1）制备A液：

取上述A液（1）～(8)成分配比逐一溶入500ml蒸馏水中，116℃高压灭菌30min后备用；

（4）制备B液：

按配比称取权利要求1中（9）～(12)各成分逐一溶入200ml蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

（3）高效培养基制备：

此步骤需无菌操作，将过滤的B液添加到高压灭菌后的A液中，然后按配比添加健康猪血清120ml，最后用无菌的蒸馏水定容至1000ml，混和均匀，用10%的氢氧化钠溶液调pH至7.4～7.6，分装备用。

3、猪肺炎支原体菌株和培养条件

按照江苏省农业科学院兽医研究所猪肺炎支原体168株培养方法，将猪肺炎支原体（冻干菌种由南京天邦生物科技有限公司生产管理部提供）活菌分别接种本发明的高效猪肺炎支原体培养基(本发明所述，血清含量为12%）、KM2培养基（江苏省农业科学院兽医研究所提供，血清含量为20%）、和PPLO支原体培养基（中国兽药监察所提供，血清含量为30%）3种培养基，猪肺炎支原体种子继代复壮后，分别按10%（V/V）的比例接种，37℃培养，当培养基的颜色变黄、pH由7.6降至6.5时，无菌取出培养液。

4、活菌滴度（CCU）测定

取9组无菌试管，每3组作为一种培养液的平行重复试验管，每组13只试管，分别添加对应的猪肺炎支原体培养基，4.5ml/管，在第1管加入0.5ml生长良好的培养液，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2根管，如此进行10倍系列稀释至最末1管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照。之后，将试管放置37℃恒温箱中静止培养，每日观察1次，主要观察培养基的颜色变化，连续观察时间为10天，最后发生颜色变化的小管稀释度即为该培养物的CCU滴度。

5、结果

1）、猪肺炎支原体接种3种培养基3次生长试验CCU（颜色变化单位）测定结果见表1

表1猪肺炎支原体F36株接种3种培养基3次生长试验CCU测定结果

 从猪肺炎支原体（168株）使用本发明制备的培养基、KM2培养基、PPLO支原体培养基的活菌滴度（CCU）测定结果看，在同样的试验条件下，本发明的高效猪肺炎支原体培养基3次试验CCU测定结果均在10⁹CCU/ml；而KM2培养基、PPLO支原体培养基3次试验CCU测定结果均为10⁸CCU/ml。说明本发明的高效猪肺炎支原体培养基具有生长迅速，活菌滴度高的特点。

Claims (3)

1.一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基，其特征是培养基由基础培养基和辅助培养基组成：

基础培养基：

（1）MEM                       6-7g；

（2）酵母浸出粉                  2-4g；

（3）胰蛋白胨                    6-8g；

（4）葡萄糖                      6-8g；

（5）质量浓度为1%的酚红溶液     1-2ml；

（6）Na₂HPO₄·12H₂O              1-2g；

（7）KH₂PO₄                     0.05-0.09g；

（8）NaCl                        2-3g；

（9）蒸馏水                      1000ml；

在116℃灭菌30min，待冷却后，在无菌条件下加入下列辅助培养基成分；

辅助培养基：

（10）猪血清                                 170-180ml；

（11）质量浓度为20%新鲜酵母浸出液           80-90ml；

（12）经过滤除菌的质量浓度为3%的谷氨酰胺    90-100ml；

（13）质量浓度为10%精氨酸单盐酸盐溶液        2ml；

（14）青霉素                                 0.002-0.015mg/ml；

用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.4-7.6。

2.一种权利要求1所述的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，包括如下步骤：

（1）制备基础培养基：

取权利要求1所述的（1）-（8）成分逐一溶入1000ml蒸馏水，高压灭菌后备用；

（2）制备辅助培养基：

取权利要求1所述的（10）-（14）成分混和、搅拌，即得辅助培养基；

将高压灭菌冷却后的基础培养基和辅助培养基混和，调pH至7.4-7.6，分装备用。

3.权利要求1所述的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基在猪肺炎支原体活疫苗抗原制备中的应用。