CN105199999B - 一种深层王祖农氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种深层王祖农氏菌，其保藏号为CGMCC No.9078。本发明的深层王祖农氏菌用于制备防治盾纤毛虫的制品。本发明的深层王祖农氏菌IO‑125(Zunongwangia profunda IO‑125)在与海水养殖动物盾纤毛虫病原共培养时，能够在24小时内杀灭共培养体系中95％以上的盾纤毛虫，该菌株的发现为防治海水养殖动物盾纤毛虫病提供了新思路。

Description

一种深层王祖农氏菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一种深层王祖农氏菌。

背景技术

海水养殖业中的病害问题,一直是影响着水产品养殖成败的重要因素之一,其中，因纤毛虫原生动物所致的病害，其发生近年来愈加频繁，日益引起人们的关注。盾纤毛虫属一种兼性寄生纤毛虫，可在水体中自由生存，以细菌和有机碎屑为食，入侵养殖动物体后，破坏组织和细胞，可能引起养殖动物大批死亡。报道显示，我国各地工厂化养殖车间从12～26℃均可出现盾纤毛虫病，几乎全年均可发病；盾纤毛虫病在牙鲆中发病最为凶猛，控制不力会出现90％以上的死亡率。目前我国海水鱼工厂化养殖中所发现的盾纤类纤毛虫主要有弗州拟尾丝虫、蟹栖异阿脑虫、指状拟舟虫、水滴伪康纤虫、贪食迈阿密虫。另外在海参稚参养殖过程，夏季高温季节6～7月份也易发生纤毛虫病，一般在水温20℃左右，刺参幼体附板后的2～3d。感染率高，发病时间短，传染速度快，在很短时间内既可造成稚参的大规模死亡。发病的稚参在显微镜下观察，可见纤毛虫进入稚参体内，然后在稚参体内大量繁殖，造成稚参解体死亡。为防控盾纤毛虫病对我国海水养殖产业的危害，国内多家单位针对盾纤毛虫进行了防治药物的筛选，但目前水产上对该病的治疗仍集中于福尔马林、硫酸铜、硫酸锌的使用，这些药物基本作用于蛋白变性，其虽然可以杀死水体中盾纤毛虫，但很难根治杀死在养殖动物体内的盾纤毛虫，而且这些药物对鱼和人体细胞没有鉴别能力，同样可以发挥作用，引起严重后果。

为安全有效治疗纤毛虫病，开发微生物类生防细菌是理想方法之一。在自然界，存在着许多对病原害虫有致病作用的微生物，利用这种致病性来防治病原害虫是一种有效的生物防治方法。随着现代生物技术和基因工程的发展以及它们在药物中的应用，高效、低毒、无残留的微生物防治已成为生物农药研制中较为活跃的研究领域之一。微生物杀虫剂就是利用微生物的活体及其代谢产物制成的。从微生物中筛选出施用方便、药效稳定、对人、养殖动物和环境安全的菌种，进行工业规模的生产开发，从而制成微生物杀虫剂。微生物杀虫剂的特点主要是对脊椎动物、人体和环境无害，且防病对象不易产生抗药性，微生物杀虫剂可以说是一种环保生物农药。另外微生物在生态环境中定植后可以自然繁殖，长期发挥杀灭病原害虫的目的，这是任何其它药物所不具备的特点。但目前利用微生物来拮抗防治海水养殖动物病原性盾纤毛虫还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供能够杀灭海水养殖动物病原性盾纤毛虫的微生物深层王祖农氏菌，从而弥补现有技术的不足。

本发明提供的深层王祖农氏菌(Zunongwangia profunda IO-125)IO-125，已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.9078，保藏日期为2014年04月18号。

该菌为革兰氏阴性菌，其接触酶反应为阴性，氧化酶反应为阴性，在MA培养基(Difco，货号：212185)上形成微黄色菌落，菌落圆形中间微凸起；该菌ONPG、明胶液化、精氨酸双水解酶实验反应为阳性，发酵葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、蔗糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖产酸。

本发明的深层王祖农氏菌用于制备防治盾纤毛虫的制品；

所述的制品，为微生物菌液或菌粉；或是培养液的上清液。

本发明的深层王祖农氏菌IO-125(Zunongwangia profunda IO-125)在与海水养殖动物盾纤毛虫病原共培养时，能够在24小时内杀灭共培养体系中95％以上的盾纤毛虫，该菌株的发现为防治海水养殖动物盾纤毛虫病提供了新思路。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述，其中述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。

使用的海水2216E液体培养基，其配比如下：酵母提取物1g，蛋白胨5g，磷酸铁0.1g，琼脂20g，pH7.6～7.8，1L陈海水。

实施例1IO-125菌株的筛选培养

步骤1.菌株分纯培养：本发明所获得菌株IO-125的原始样品采集地点为印度洋(E111°22’10”；N21°27’30”)，样品采集后，立即无菌涂布到MA2216培养基(Difco，货号：212185)上，用涂布好的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，挑取长出的单菌落，在MA 2216培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，挑取长出的单菌落，再次在MA 2216培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，待单一菌落长出，挑取单菌落到1ml海水2216E液体培养基中，并用封口膜密封备用，接种好单菌落的海水2216E液体培养基置于25℃摇菌24-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.7，用封口膜密封备用。

步骤2.盾纤毛虫液制备：取实验室保存的盾纤毛虫液体，10倍梯度稀释后挑含1个纤毛虫的液滴立即转移到1ml鱼汤培养基中置于14-18℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上时，将该1ml鱼汤培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于14-18℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上，做为盾纤毛虫培养液备用。

所述的步骤2中的鱼汤培养基配法为：取50ml陈海水，经过121℃，20min灭菌，冷却后加入1ml鱼肉汤母液。

上所述的鱼肉汤母液配置方法为：取大菱鲆鱼肉10-30g于锥形瓶中，加入50ml的蒸馏水，电炉煮沸10min冷却，将上清液分装至灭好菌的1.5ml的离心管中，每管分装1ml，放置于—20℃冰箱备用。

步骤3.杀虫活性菌株筛选：将分离获得的海洋细菌与盾纤毛虫在96孔板中进行共培养。取一个96孔板，96孔板的A1、B1孔做空白对照，加160μl灭菌海水，其余孔为实验组；取步骤(1)细菌菌液160μl加入到96孔板中，每种细菌设2个平行，即每一种细菌加两孔；取步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向96孔板加注了灭菌海水或细菌菌液的孔中再加注160μl盾纤毛虫培养液，将加好样的96孔板置于湿盒中，放到16℃共培养；监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌。开始共培养后，每隔12小时，从培养箱中取出96孔板，将每孔液体吹匀后取出20μl液体在显微镜下观察盾纤毛虫生长情况和存活率，液体中观察不到活跃的盾纤毛虫或活跃的纤毛虫个体少于1个，则细菌为有效菌。通过该步骤，有效细菌IO-125被筛选出并留存。

所述的步骤3中细菌留存，其方法为，将IO-125从保存备用平皿上挑取单菌落到1毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌36-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.6，加入灭菌的甘油，使甘油的终浓度为30-50％，-80℃保存备用。

实施例2菌株IO-125的鉴定与保藏

步骤1.菌株的生理生化分析:菌株IO-125的生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》操作，鉴定结果为该菌为革兰氏阴性菌，其接触酶反应为阴性，氧化酶反应为阴性，在MA培养基(Difco，货号：212185)上形成微黄色菌落，菌落圆形中间微凸起；该菌ONPG、明胶液化、精氨酸双水解酶实验反应为阳性，发酵葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、蔗糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖产酸。

步骤2.菌株的16S rRNA基因的扩增与序列分析

16S rRNA基因模板的制备：从IO-125保存备用平皿上挑取单菌落到MA 2216培养基平板上进行划线分纯，将划好线的培养皿倒置于25℃培养24-96小时，待单一菌落长出，用灭菌的牙签挑取2～3个单菌落于20μL RNA free水中混匀，菌液浓度略微浑浊即可。置于PCR仪，99℃，15min。取上清液做为PCR扩增模板。

PCR扩增：PCR扩增所用引物为27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACT T-3')。PCR反应体系60μL：2×Taq Mix 30μL，引物：27F，1492R各3μL，模板3μL，无菌水补足至60μL。PCR反应条件：95℃，5min；94℃，45s；57℃，1min30s；72℃，1min 30s，30个循环；72℃，10min。将PCR产物测序，序列比对后将IO-125鉴定为深层王祖农氏菌IO-125(Zunongwangia profunda IO-125)。

步骤3.菌株IO-125的保藏：该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No.9078，保藏日期为2014年04月18号。

在实验室中，该菌株长期保藏方式为将菌株加入含30％甘油的MB 2216培养基(Difco，货号：279110)培养基中，在-80℃保存；短期保藏方式为将菌株接种在MA 2216培养基(Difco，货号：212185)斜面上，在4℃保存备用。

实施例3IO-125菌株培养液的杀虫效果

步骤1.菌株培养：将IO-125从保存备用平皿上挑取单菌落到1毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌36-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.7做为种子液转移到100毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌培养36-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.7用封口膜密封备用。

步骤2.盾纤毛虫液制备：取实验室保存的盾纤毛虫液体，10倍梯度稀释后挑含1个纤毛虫的液滴立即转移到1ml鱼汤培养基中置于14-18℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上时，将该1ml鱼汤培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于14-18℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上，做为盾纤毛虫培养液备用。

步骤3.IO-125菌株培养液杀虫效果验证：将分离获得的IO-125菌株与盾纤毛虫在三角瓶中进行共培养。取6个100ml三角瓶，其中三个做空白对照，各加20ml灭菌海水；其余三瓶为实验组，各取步骤(1)细菌菌液20ml加入到三角瓶；取步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向6个加注了灭菌海水或细菌菌液的三角瓶中再加注20ml盾纤毛虫培养液，将加好样的三角瓶放到16℃共培养；监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌。开始共培养后，每隔12小时，从培养箱中取出三角瓶，将每孔液体吹匀后取出20μl液体在显微镜下观察盾纤毛虫生长情况和存活率。共培养12小时后，20μl共培养液体中活跃的盾纤毛虫少于5个，共培养12小时后，20μl共培养液体中已经观察不到活跃的盾纤毛虫，验证了IO-125菌株的杀虫活性。

实施例4菌株IO-125培养液上清的杀虫效果

步骤1.菌株培养：将IO-125从保存备用平皿上挑取单菌落到1毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌36-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.7做为种子液转移到100毫升海水2216E液体培养基中置于25℃摇菌培养36-96小时，至其0D₆₀₀达到0.4-0.7时，采用5000rpm条件离心10分钟，离心后将上清液转移到一新的灭菌管中用封口膜密封备用。

步骤2.盾纤毛虫液制备：取实验室保存的盾纤毛虫液体，10倍梯度稀释后挑含1个纤毛虫的液滴立即转移到1ml鱼汤培养基中置于14-18℃培养，待鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上时，将该1ml鱼汤培养基转移到50ml鱼汤培养基中置于14-18℃继续培养，直至该50ml鱼汤培养基中盾纤毛虫密度达到5×10³个/ml以上，做为盾纤毛虫培养液备用。

步骤3.IO-125菌株培养液上清杀虫效果验证：将分离获得的IO-125菌株培养液上清与盾纤毛虫在三角瓶中进行共培养。取6个100ml三角瓶，其中三个做空白对照，各加20ml灭菌海水；其余三瓶为实验组，各取步骤(1)IO-125菌株培养液上清20ml加入到三角瓶；取步骤(2)获得的盾纤毛虫培养液，依次向6个加注了灭菌海水或菌株培养液上清的三角瓶中再加注20ml盾纤毛虫培养液，将加好样的三角瓶放到16℃共培养；监测共培养体系中盾纤毛虫的存活率确定杀虫细菌。开始共培养后，每隔12小时，从培养箱中取出三角瓶，将每孔液体吹匀后取出20μl液体在显微镜下观察盾纤毛虫生长情况和存活率。共培养12小时后，20μl共培养液体中活跃的盾纤毛虫少于5个，共培养12小时后，20μl共培养液体中已经观察不到活跃的盾纤毛虫，验证了IO-125菌株培养液上清的杀虫活性。

Claims (5)

1.一种深层王祖农氏菌，其特征在于，所述的深层王祖农氏菌（Zunongwangiaprofunda）的保藏号为CGMCC No. 9078。

2.权利要求1所述的深层王祖农氏菌在制备防治盾纤毛虫的制品中的应用。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述的制品为微生物菌液或菌粉。

4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述的制品为微生物菌液的上清液。

5.一种菌液，其特征在于，所述的菌液为权利要求1所述的深层王祖农氏菌的扩大培养液。