CN111635876A

CN111635876A - 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111635876A
Application number: CN202010548417.7A
Authority: CN
Inventors: 徐高原; 顾伟; 陈关平; 周明光; 曹毅; 韩进; 田苏英; 喻慧芳; 金建云
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2020-09-08

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法与应用。本发明的猪肺炎支原体培养基，包括肌醇，并进一步包括配合所述肌醇添加的PPLO肉汤、脑心浸粉、胰蛋白胨和丙酮酸钠。本发明发现，当在猪肺炎支原体培养基中加入肌醇，并配合特定的营养物质选择时，可部分替代血清在培养基中的作用，从而在降低血清用量的情况下，仍提升了增殖效率，实现了低血清下的高密度培养。极大地降低了生产成本，提高了产品纯度，减轻了血清对猪体的过敏应激反应，提高了抗原的效价，适于应用于猪肺炎支原体疫苗的生产。

Description

一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法与应用。

背景技术

猪支原体肺炎，又称地方流行性肺炎，是一种慢性呼吸道疾病,其原发病原是猪肺炎支原体和其它呼吸道病原，如猪鼻支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪源支气管败血波氏杆菌、多杀巴氏杆菌等也经常继发感染，猪支原体肺炎病是一种分布广泛的猪呼吸道疾病，其特点是发病率高，流行广并难以净化。长期以来，对养猪业造成重大经济损失，有研究显示，自然感染该病的病猪生长率降低了12.7％，在哺乳期接种母猪自然感染仔猪的实验中，患病小猪的生长率降低了15.9％，饲料转化率降低了13.8％，使饲料成本增加并延长了饲养期，导致了生产成本的增加。本病虽为老病，但近年来由于经常和PRRS、圆环病毒等其它病原混合感染，造成了更严重的损失。因此，有必要对其进行大量研究。

目前，培养猪肺炎支原体培养基有很多种，有煮沸猪肺组织的灭活细胞培养基，猪肺埋块无细胞培养基，江苏省农业科学院创造的KM2培养基以及以脑心浸粉和PPLO肉汤为主要原料的猪肺炎支原体培养基。上述支原体培养存在培养难度大，血清需求量大等问题。现有专利所描述的培养基还普遍存在原材料成本高，培养基配制繁琐以及原材料成分复杂和各批次间稳定性差等问题，是目前支原体疫苗规模化生产亟需解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种可在低血清下实现高效猪肺炎支原体培养的培养基。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种猪肺炎支原体培养基，所述培养基包括肌醇，并进一步包括配合所述肌醇添加的PPLO肉汤、脑心浸粉、胰蛋白胨和丙酮酸钠。

猪肺炎支原体作为最小的原核微生物，其基因组小且数量有限，从而导致生物合成途径缺乏，需要从外界摄取氨基酸、糖类、微量元素等多种物质，还需加入较高量的动物血清才能保证其高效增殖。而血清用量高，增加了培养成本及猪的过敏风险，且在后续用于生产猪肺炎支原体疫苗时，易影响抗原效价。本发明经大量研究发现，当在猪肺炎支原体培养基中加入肌醇，并配合特定的营养物质选择时，可部分替代血清在培养基中的作用，从而在降低血清用量的情况下，仍提升了增殖效率，实现了低血清下的高密度培养。若改变本申请的该组合方式，则效果不理想。

优选的，所述猪肺炎支原体为猪肺炎支原体J株。

本发明中，所述肌醇的质量与所述PPLO肉汤、所述脑心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸钠的总质量之比为1：(10～60)，优选为：1：(50-55)；更优选1：53。以本发明的特定比例配合，培养基碳氮源搭配更合理，猪肺炎支原体在该培养基组合培养下所得CCU高，同时培养基来源明确，批间次差异小，配制简便，价格低廉。

本发明中，所述PPLO肉汤、所述脑心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸钠的质量之比为(5～30)：(1～10)：(5～20)：(1～10)，优选为：(28～30)：(1～3)：(18～20)：(1～3)，更优选为：30：1：20：2；该培养基组合成本低，并且培养所得生物量高。

与肌醇配合的各组分之间，在以本发明的配比进行组合后，可更好地平衡培养基组分对猪肺炎支原体的促生作用，保证低血清下的高效培养效果。

本发明中，培养基还包括3～10％(V/V)的血清，优选为3％。

更优选的，所述肌醇与所述血清的质量体积比为1：(30～100)g/mL，优选为1：30g/mL，以既保证增殖效果，又降低成本，避免血清对产品纯度的影响。

本发明在研究时发现，肌醇与血清的用量在本发明的限定内时，可更好地保证猪肺炎支原体在低血清下以高增殖速率扩增。

进一步优选的，所述血清为猪血清。

本发明中，培养基进一步包括酵母浸出粉、水解乳蛋白、10×Hanks平衡缓冲液和酚红。

以本发明的整体配方，无需额外添加脂类物质、氨基酸或无机盐等营养成分，既实现了低血清下高效培养，又降低了培养成本。

本发明的培养基中包括：5～30g/L的所述PPLO肉汤、1～10g/L的所述脑心浸粉、1～20g/L的所述酵母浸出粉、5～20g/L的所述胰蛋白胨、1～10g/L的所述水解乳蛋白、1～10％(V/V)的所述10×Hanks平衡缓冲液、0.1～10g/L的所述肌醇、1～10g/L的所述丙酮酸钠、0.5％～5％(V/V)的质量浓度为0.4％的所述酚红和3～10％(V/V)的所述猪血清。

作为本发明的一个优选方案，所述培养基中包括：30g/L的所述PPLO肉汤、1g/L的所述脑心浸粉、10g/L的所述酵母浸出粉、20g/L的所述胰蛋白胨、1g/L的所述水解乳蛋白、5％(V/V)的所述10×Hanks平衡缓冲液、1g/L的所述肌醇、2g/L的所述丙酮酸钠、3％(V/V)的质量浓度为0.4％的所述酚红和3％(V/V)的所述猪血清。

本发明培养基中各组分浓度适宜，可维持理想的渗透压，既提升了培养效果，又节约了成本，避免原料浪费。

本发明培养基还可在液体培养基的基础上增加琼脂，获得适于猪肺炎支原体培养的固体培养基。

本发明还提供一种制备上述培养基的方法，其包括：

(1)将PPLO肉汤、胰蛋白胨、脑心浸粉和酵母浸出粉混合后高压灭菌，获得A液；

(2)将水解乳蛋白、10×Hanks平衡缓冲液、肌醇、丙酮酸钠和酚红溶液混合后过滤除菌，获得B液；

(3)将所述A液、所述B液与血清混合后调pH值。

作为一个优选方式，本发明的制备上述培养基的方法具体步骤如下：

(1)按配比称取PPLO肉汤、胰蛋白胨、脑心浸粉和酵母浸出粉，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，121℃高压灭菌15分钟获得A液，冷却后备用；

(2)按配比称取水解乳蛋白、10×Hanks平衡缓冲液、肌醇、丙酮酸钠和0.4％酚红溶液，将各组分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌获得B液，4℃保存备用。

(3)按配比称取灭活猪血清，将A液、B液和其充分混合均匀，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.2～7.8，即得猪肺炎支原体培养基。

本发明另提供一种上述培养基或方法在培养猪肺炎支原体或制备猪肺炎支原体疫苗抗原中的应用。

以本发明的培养基培养猪肺炎支原体，生长时间为36h，含菌量为1.0×10¹⁰CCU/ml，达到最终含菌量的测定时间为10-11日，获得的活菌滴度较高，生产周期短。且血清含量低，减轻了血清对猪体的过敏应激反应，提高了抗原的效价。

本发明的有益效果至少在于：

本发明获得了一种可在低血清浓度下实现高效培养的培养基，该培养基的原料制备简单，成本低廉，较常规的培养基既能保证猪肺炎支原体生长旺盛，进行正常代谢，又能提高生长速度，缩短生产时间，节省劳动力成本。且该培养基需要的血清量低，仅为3～10％V/V，极大地降低了生产成本，提高了产品纯度，减轻了血清对猪体的过敏应激反应，提高了抗原的效价，适于应用于猪肺炎支原体疫苗的生产。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

本实施例提供一种本发明的猪肺炎支原体培养基。

培养基配方为：

A组分：PPLO肉汤5g/L、脑心浸粉1g/L、酵母浸出粉1g/L、胰蛋白胨10g/L；

B组分：水解乳蛋白1g/L、10×Hanks平衡缓冲液1％V/V、肌醇0.5g/L、丙酮酸钠1g/L、质量浓度为0.4％的酚红0.5％V/V；

C组分：灭活猪血清3％V/V。

本发明培养基的制备：

(1)按配比称取A组分中各成分，将各成分混合，搅拌，使之完全溶解，121℃高压灭菌15分钟，冷却后备用；

(2)按配比称取B组分，将各组分混合，搅拌，使之完全溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(3)按配比称取C组分，将A液、B液和C液充分混合均匀，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.4，即得猪肺炎支原体培养基。

实施例2

本实施例提供一种本发明的猪肺炎支原体培养基。

培养基配方为：

A组分：PPLO肉汤30g/L、脑心浸粉10g/L、酵母浸出粉20g/L、胰蛋白胨20g/L；

B组分：水解乳蛋白10g/L、10×Hanks平衡缓冲液10％V/V、肌醇7g/L、丙酮酸钠10g/L、质量浓度为0.4％的酚红5％V/V；

C组分：灭活猪血清10％V/V。

本发明培养基的制备方法同实施例1，区别仅在于：第(3)步中，调整pH至7.2。

实施例3

本实施例提供一种本发明的猪肺炎支原体培养基。

培养基配方为：

A组分：PPLO肉汤15g/L、脑心浸粉5g/L、酵母浸出粉4g/L、胰蛋白胨5g/L；

B组分：水解乳蛋白5g/L、10×Hanks平衡缓冲液1％V/V、肌醇0.5g/L、丙酮酸钠2g/L、质量浓度为0.4％的酚红4％V/V；

C组分：灭活猪血清9％V/V。

本发明培养基的制备方法同实施例1，区别仅在于：第(3)步中，调整pH至7.5。

实施例4

本实施例提供一种本发明的猪肺炎支原体培养基。

培养基配方为：

A组分：PPLO肉汤25g/L、脑心浸粉10g/L、酵母浸出粉15g/L、胰蛋白胨15g/L；

B组分：水解乳蛋白10g/L、10×Hanks平衡缓冲液8％V/V、肌醇5g/L、丙酮酸钠9g/L、质量浓度为0.4％的酚红5％V/V；

C组分：灭活猪血清7％V/V。

本发明培养基的制备方法同实施例1，区别仅在于：第(3)步中，调整pH至7.7。

实施例5

本实施例提供一种本发明的猪肺炎支原体培养基。

培养基配方为：

A组分：PPLO肉汤30g/L、脑心浸粉1g/L、酵母浸出粉10g/L、胰蛋白胨20g/L；

B组分：水解乳蛋白1g/L、10×Hanks平衡缓冲液5％V/V、肌醇1g/L、丙酮酸钠2g/L、质量浓度为0.4％的酚红3％V/V；

C组分：灭活猪血清3％V/V。

本发明培养基的制备方法同实施例1，区别仅在于：第(3)步中，调整pH至7.6。

对比例1

本对比例提供一种猪肺炎支原体培养基。

培养基配方与实施例5相同，区别仅在于：以示蛋白胨替代胰蛋白胨。

对比例2

本对比例提供一种猪肺炎支原体培养基。

培养基配方与实施例5相同，区别仅在于：肌醇1g/L、PPLO肉汤28g/L、脑心浸粉8g/L、胰蛋白胨17g/L、丙酮酸钠10g/L。所述肌醇的质量与所述PPLO肉汤、所述脑心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸钠的总质量之比为1：63。

对比例3

本对比例提供一种猪肺炎支原体培养基。

培养基配方与实施例5相同，区别仅在于：PPLO肉汤20g/L、脑心浸粉15g/L、胰蛋白胨18g/L、丙酮酸钠0.5g/L。

对比例4

本对比例提供一种猪肺炎支原体培养基。

培养基配方与实施例5相同，区别仅在于：不加入猪血清。

实验例1

本实验例以实施例1-5和对比例1-4制得的培养基进行猪肺炎支原体培养。

1.猪肺炎支原体菌株和培养条件。

将猪肺炎支原体J株，购自北京生泰尔科技股份有限公司，批号：20190601。

种子液制备：将2ml猪肺炎支原体J株菌液经低温真空干燥获得的冻干粉中加入2mL A26液体培养基。混合均匀后，将该菌液转入18mL A26液体培养基中扩大培养，当培养至48h～72h，pH降至6.5～6.8时，猪肺炎支原体J株的种子液即制备完成。

将猪肺炎支原体种子液按10％(V/V)的比例分别接种于本发明具体实施方式记载的猪肺炎支原体培养基(实施例1-5和对比例1-4)和常用的2种猪肺炎支原体培养基(常用培养基1：A26培养基；常用培养基2：KM2培养基)中，37℃培养，当培养基颜色变黄，pH降至6.5-6.8时，无菌取出培养物，进行CCU滴度测定。

2.活菌计数(CCU法)

每个菌株培养物取11支无菌试管，每管装4.5ml含猪肺炎支原体培养基，在第1管加入0.5ml步骤1中取出的培养物，混合均匀后，吸取0.5ml加入第2只管，如此进行10倍系列稀释至最后一管，同时设未加菌液的猪肺炎支原体培养基作为阴性对照，试验管作三个重复。系列稀释后将试管放置37℃恒温培养箱中静止培养，每日观察一次，主要观察培养基的颜色变化和浑浊度，连续观察时间为12日，最后发生颜色变化的试管稀释度即为该培养物的CCU滴度。

3、结果

猪肺炎支原体J株接种于实施例1-5、对比例1-4培养基和常用培养基1-2的3次生长实验CCU测定结果见表1。

表1

从猪肺炎支原体J株使用本发明制备的培养基同现有技术中的2种培养基的活菌滴度(CCU)测定结果来看，在同样的试验条件下，本发明的实施例5低血清高效培养猪肺炎支原体培养基3次试验的CCU测定结果均在10¹⁰CCU/ml；高于其它实施例、对比例和现有常用培养基。实验结果说明，本发明的猪肺炎支原体培养基具有生长迅速，活菌滴度高的特点。该培养基极大地降低了猪血清的用量，降低了生产成本。因此培养基具有更广泛的使用性，适用于大规模的工业生产。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种猪肺炎支原体培养基，其特征在于，所述培养基包括肌醇，并进一步包括配合所述肌醇添加的PPLO肉汤、脑心浸粉、胰蛋白胨和丙酮酸钠。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述肌醇的质量与所述PPLO肉汤、所述脑心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸钠的总质量之比为1：(10～60)。

3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述PPLO肉汤、所述脑心浸粉、所述胰蛋白胨和所述丙酮酸钠的质量之比为：(5～30)：(1～10)：(5～20)：(1～10)，优选为(28～30)：(1～3)：(18～20)：(1～3)。

4.根据权利要求1-3任一项所述的培养基，其特征在于，还包括3～10％(V/V)的血清，优选的，所述肌醇与所述血清的质量体积比为1：(30～100)g/mL，更优选的，所述血清为猪血清；

和/或，进一步包括酵母浸出粉、水解乳蛋白、10×Hanks平衡缓冲液和酚红。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括：5～30g/L的所述PPLO肉汤、1～10g/L的所述脑心浸粉、1～20g/L的所述酵母浸出粉、5～20g/L的所述胰蛋白胨、1～10g/L的所述水解乳蛋白、1～10％(V/V)的所述10×Hanks平衡缓冲液、0.1～10g/L的所述肌醇、1～10g/L的所述丙酮酸钠、0.5％～5％(V/V)的质量浓度为0.4％的所述酚红和3～10％(V/V)的所述猪血清。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述培养基中包括：30g/L的所述PPLO肉汤、1g/L的所述脑心浸粉、10g/L的所述酵母浸出粉、20g/L的所述胰蛋白胨、1g/L的所述水解乳蛋白、5％(V/V)的所述10×Hanks平衡缓冲液、1g/L的所述肌醇、2g/L的所述丙酮酸钠、3％(V/V)的质量浓度为0.4％的所述酚红和3％(V/V)的所述猪血清。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的培养基的方法，其特征在于，包括：

(3)将所述A液、所述B液与血清混合后调pH值。

8.权利要求1-6任一项所述的培养基或权利要求7所述的方法在培养猪肺炎支原体中的应用。

9.权利要求1-6任一项所述的培养基或权利要求7所述的方法在制备猪肺炎支原体疫苗抗原中的应用。