CN111154696A - 一种猪肺炎支原体培养基及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物工程技术领域，公开了一种猪肺炎支原体培养基及制备方法，猪肺炎支原体培养基的制备方法包括：量取灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL、双抗溶液50mL，用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6，备用。本发明培养基配制操作简单、无需使用难以买到的醋酸铊溶液，醋酸铊溶液为危险化学品，购买流程复杂，而且本发明无需对配好的培养基过滤除菌，试验证明新培养基优于其他几种常用的猪肺炎支原体培养基。

Description

一种猪肺炎支原体培养基及制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种猪肺炎支原体培养基及制备方法。

背景技术

目前，猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine，Mps又称猪气喘病)的主要病原，也是猪呼吸道疾病综合症的一种重要的原发性病原。Mhp主要感染猪呼吸道，本身致病力不强，临床症状主要以咳嗽和气喘为主，病变特征主要是肺的尖叶、心叶、中间叶和隔叶前缘呈“肉样”或“虾肉样”实变。Mhp感染机体后主要与呼吸道内壁的纤毛黏附，引起纤毛细胞病变和凋亡，导致纤毛断裂和脱落，引起机体发病，并且会严重影响猪的生长发育和饲料转化率，或者破坏粘膜-纤毛屏障，容易继发其他致病菌的感染(特别是对青年猪)，提高致死率，因而给养猪业造成巨大的经济损失。目前猪支原体肺炎的主要防治措施是疫苗和药物，但有效的药物较缺乏，因此，进行该病的疫苗研制将为本病的预防和控制具有重要的意义。

综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术培养基配制操作繁琐，应用的醋酸铊溶液是危险化学品，购买流程十分复杂，配制好的培养基需全部过滤除菌，增加了制备的难度，而且获得的培养基培养效果不理想。

(2)现有的培养基，配制过程复杂，本发明培养基取材容易，配制过程简单，培养效果优于其他几种培养基，解决了猪肺炎支原体难以培养的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪肺炎支原体培养基及制备方法。

本发明是这样实现的，一种猪肺炎支原体液体培养基的制备方法包括：灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL、双抗溶液50mL，用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6。

进一步，Hank’s液的配制，具体包括：

(1)甲液的配制1L：氯化钠160g、氯化钾8g、硫酸镁2g、氯化镁2g、加蒸馏水至800mL溶解后加入氯化钙2.8g，补足蒸馏水至1L，并加2mL氯仿作为防腐剂，于4℃冰箱保存；

(2)乙液的配制1L：磷酸氢二钠3.04g、磷酸二氢钾1.2g、葡萄糖20g，将上述成分溶于800mL蒸馏水中，再加入100mL 0.4％酚红溶液；加蒸馏水至1000mL，并加2mL氯仿防腐，于4℃冰箱保存；

(3)取甲液1份，乙液1份、蒸馏水18份，121℃灭菌15min后，置于4℃冰箱保存备用；使用时用3.5％的碳酸氢钠溶液，将pH值调至7.2～7.6。

进一步，酵母浸液的制备包括：

酵母粉25g加100mL双蒸馏水，煮沸30min，4000r/min离心15分钟，吸取上清于玻璃瓶中，121℃高压灭菌15min。

进一步，1％水解乳蛋白的配制包括：

称取1g水解乳蛋白粉溶于100mLHank’s液，装玻璃瓶内，121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。

本发明另一目的在于提供一种利用所述猪肺炎支原体液体培养基的制备方法制备的猪肺炎支原体液体培养基，由灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL和双抗溶液50mL组成。

进一步，所述猪肺炎支原体培养基用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6。

本发明另一目的在于提供一种利用所述猪肺炎支原体液体培养基制备的猪肺炎支原体固体培养基，按质量比在猪肺炎支原体液体培养基中加入2％琼脂粉，混合后制得猪肺炎支原体固体培养基。

本发明另一目的在于提供一种利用所述在猪肺炎支原体培养基中生长的猪肺炎支原体可为制备猪支原体肺炎灭活疫苗提供足够的支原体。

本发明另一目的在于提供一种利用所述在猪肺炎支原体培养基中生长的猪肺炎支原体可为猪支原体肺炎病原学鉴定提供可靠的病原材料。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明培养基配制操作简单、无需使用难以买到的醋酸铊溶液(危险化学品，购买流程复杂)、无需对全部培养基进行过滤除菌，试验证明新培养基优于其他常用猪肺炎支原体培养基。

本发明将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM₂培养基以及新猪肺炎支原体培养基中进行了培养试验，采用颜色改变单位(CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，对快速、有效地诊断猪支原体肺炎具有重要意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的猪肺炎支原体液体培养基制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的10天时各培养基CCU管的PCR测定结果图。

图3是本发明实施例提供的10天时各培养基10^-8CCU管的PCR测定结果图。

图4是本发明实施例提供的培养10天时新培养基颜色变化情况图。

图5是本发明实施例提供的培养17天时新培养基上菌落形态(20×)图。

图6是本发明实施例提供的培养17天时新培养基上形成的菌落图(40×)图。

图7是本发明实施例提供的经Dienes染色后，在40倍显微镜下观察到猪肺炎支原体菌落被染成蓝色，其余不被染色图。图中：(a)空白对照平板，(b)：被染色的猪肺炎支原体菌落(40×)图。

图8是本发明实施例提供的PCR鉴定结果图。图中：1：病料分离株；2：阳性对照；3：阴性对照；M：DNA标准600。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术培养基配制操作繁琐，应用的醋酸铊溶液成本高，需过滤除菌，增加了制备的难度，而且获得的培养基治疗效果差。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种猪肺炎支原体培养基及制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，包括：

S101，量取灭菌1％水解乳蛋白Hank's液、无菌DMEM溶液、无菌灭活猪血清、灭菌酵母浸液、双抗溶液。

S102，用灭菌的3.5％NaHCO₃调节pH至7.6。

本发明实施例中，提供的DMEM培养基由无水氯化钙.2H₂0 265mg/L、硝酸铁.9H200.1mg/L、氯化钾400mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400mg/L、无水磷酸二氢钠109mg/L、丁二酸75mg/L、丁二酸钠100mg/L、L-盐酸精氨酸84mg/L、L-盐酸胱氨酸63mg/L、甘氨酸30mg/L、L-盐酸组氨酸42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L盐酸赖氨酸146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸72mg/L、L-缬氨酸94mg/L、D-泛酸钙4.00mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.00mg/L、肌醇7.20mg/L、烟酰胺4.00mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、葡萄糖1000.00mg/L、丙酮酸钠110.00mg/L和酚红9.30mg/L组成。

本发明提供一种猪肺炎支原体液体培养基，具体由灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL和双抗溶液50mL组成，所述猪肺炎支原体培养基用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6，制备的猪肺炎支原体液体培养基后，按质量比加入2％琼脂粉可制得猪肺炎支原体固体培养基。

下面结合具体实施例及对比实施例对本发明作进一步描述。

实施例

本发明实施例提供的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，具体包括：

1)Hank’s液的配制

甲液的配制(1L)：氯化钠160g、氯化钾8g、硫酸镁2g、氯化镁2g、加蒸馏水至800mL溶解后加入氯化钙2.8g，补足蒸馏水至1L，并加2mL氯仿作为防腐剂，于4℃冰箱保存。乙液的配置(1L)：磷酸氢二钠3.04g、磷酸二氢钾1.2g、葡萄糖20g，将上述成分溶于800mL蒸馏水中，再加入100mL0.4％酚红溶液。加蒸馏水至1000mL，并加2mL氯仿防腐，于4℃冰箱保存。取甲液1份，乙液1份、蒸馏水18份，121℃灭菌15min后，置于4℃冰箱保存备用。使用时用3.5％的碳酸氢钠(NaHCO₃)溶液，将pH值调至7.2～7.6。

2)酵母浸出液的制备

酵母粉25g加100mL双蒸馏水，煮沸30min，4000r/min离心15分钟，吸取上清于玻璃瓶中，121℃高压灭菌15min。

3)无菌1％水解乳蛋白溶液的配制

称取1g水解乳蛋白粉溶于100mLHank’s液，装玻璃瓶内，121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。

4)新猪肺炎培养基的制备

灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL、双抗溶液50mL，用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6备用。

对比实施例

现有技术制备猪肺炎支原体培养基方法包括：

1)猪胰蛋白酶的制备

称取去脂绞碎的猪胰脏500g，加入乙醇500mL、蒸馏水1500mL，混合后装入玻璃塞瓶内，每日摇匀3～5次。3天后，用绒布过滤挤出其汁，加盐酸至0.05％，放冰箱内保存备用。

2)牛心消化汤的制备

绞碎的牛心1000g、15％氢氧化钠溶液27mL、胰蛋白酶40mL、三氯甲烷1mL、氯化钠10g、蒸馏水2000mL，制作步骤如下：

称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热至80℃，维持15min；加氢氧化钠溶液，使得对pH试纸呈弱碱性，冷至40℃；加胰蛋白酶、氯仿，在36±1℃放置4～5小时，每小时摇动1～2次；4h后，吸取上层液5mL于试管中，加5％硫酸铜溶液0.1mL、4％氢氧化钠溶液5mL，混合之。若呈红色，则不需再消化，可由温箱中取出；加入15％乙酸溶液45mL，使得对pH试纸呈酸性；煮沸15min，使蛋白酶破坏，冷后，放4℃冰箱内一夜；次日吸取上层清液，加氯化钠10g，并加水补足原量，煮沸；用15％氢氧化钠调pH值至7.4～7.6，加热，用滤纸过滤，分装于玻璃瓶中，121℃高压灭菌20min，于4℃冰箱保存备用。

3)Hartley氏消化汤的制备

绞碎的牛心300g，加蒸馏水400mL，加热至80℃时加入0.8％无水碳酸钠500mL，冷至45℃时加入胰蛋白酶10mL，氯仿10mL。上述各物混合后，置于37℃6小时或者45℃3小时，然后加入浓盐酸8mL，100℃水浴1小时，纱布棉花过滤，以氢氧化钠调节pH值至8，再在100℃水浴1小时，趁热用滤纸过滤，矫正pH值至7.6，分装玻璃瓶中，121℃高压灭菌20min，于4℃冰箱保存备用。

下面结合5种猪肺炎支原体培养基的制备对本发明作进一步描述。

本实验将猪肺炎支原体168株和强毒济南株分别接种于Goodwin等复合培养基、驴血清培养基、A26培养基、KM₂培养基以及新猪肺炎支原体培养基的制备中进行了培养试验，采用颜色改变单位(CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在5种培养基中的生长繁殖情况进行了检测与比较，以期筛选出Mhp生长最适培养基，对快速、有效地诊断猪支原体肺炎具有重要意义。

在本发明中，5种猪肺炎支原体培养基的制备包括：

1、A26肉汤培养基(简称A26培养基)制备

1％水解乳蛋白Hank’s液500mL、牛心消化汤250mL、犊牛血清200mL、50％葡萄糖20mL、酵母浸出液10mL、青霉素200IU/mL、1％醋酸铊2.5mL、1％辅酶I 10mL，将以上各组分混匀，调pH值至7.6，备用。

2、驴血清培养基的制备

0.5％水解乳蛋白Hank’s液500mL、牛心消化汤300mL、无菌驴血清200mL、1％醋酸铊溶液25mL、青霉素500IU/mL，将以上各组分混匀，调pH值至7.6，备用。

3、Goodwin等氏复合培养基(简称GW培养基)制备

Hartley氏消化汤300mL、0.5％水解乳蛋白Hank’s液500mL、无菌灭活猪血清200mL、酵母浸出液10mL、青霉素200IU/mL、1％醋酸铊12.5mL，以上各组分混合后，调pH值至7.6，备用。

4、KM₂培养基的制备

Eagle氏液500mL、青霉素5万IU/mL 10mL、1％水解乳蛋白液300mL、1％醋酸铊溶液12.5mL、灭活的正常猪血清200mL、酚红0.02g、酵母抽提物10g加双蒸馏水到总量为1 000毫升。购于江苏农科院兽医所。

5、新猪肺炎支原体培养基(简称新培养基)的制备

灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL、双抗溶液50mL，用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6。

下面结合具体实验方法对本发明作进一步描述。

1试验方法

1.1菌株分离与复苏

将冻存的支必宁和强毒济南株，在无菌条件下，分别用3mL灭菌水稀释，按10％的比例分别接入到5种液体培养基中进行菌株分离与复苏培养，每7天传代1次，共传2～3代。

1.2颜色改变单位计数

将5种液体培养基分别分装于无菌试管中，每管2.7mL，于第一管加入菌液0.3mL，混匀后吸取0.3mL至第二管，依次类推做10倍梯度稀释直到10^-8，从最后一管中吸取0.3mL废弃，设各液体培养基做空白对照，每种培养基做两个平行组。于37℃恒温箱培养，每天观察各培养基的颜色变化，以培养基颜色改变的最末一管作为培养菌液的CCU。

1.3PCR方法检测

合成1对Mhp P36引物，上游引物p1为：5′-CCGTTGAAGCCTT－GCTGTAT-3′，下游引物p2为：5′-CGGTTAGTGTCTCCCGTTATG-3’，扩增片段大小为287bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

模板提取：取各最后一管有颜色变化的培养基1mL，14000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL无菌TE缓冲液洗涤1～3次，之后用60～100μL TE悬浮，于沸水浴10min，置冰上冷却后，10000r/min离心10min，取上清作为模板。

PCR体系(25μL)：10×Buffer 3μL，10mM dNTPs 0.6μL，上下引物各1μL，模板4μL，Taq酶0.3μL，补ddH₂O至25μL。设定以下参数进行PCR反应：94℃预变性3min，94℃变性30S，54.6℃退火30S，72℃延伸40S，进行30个循环，72℃再延伸10min，4℃保存。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.4病料的处理

在超净工作台内取大小为1～3mm³病料组织于无菌研磨器中碾碎，接种于液体培养基中，37℃培养，每日观察培养基中的PH值变化，当培养基颜色变化时，取经0.45μm过滤后的培养液0.5mL接种于新的培养基中，37℃继续培养，如此重复3次。

1.5病原的纯化

取200μL 3次过滤培养后的培养物涂布于固体培养基中，于37℃、5％CO₂条件下培养，每天观察培养基颜色是否有变化和是否有菌落形成。挑取单个菌落于液体培养基中培养，颜色变化后取200μL培养物再次接种于固体培养基中于37℃、5％CO₂条件下纯化培养。

1.6菌落形态观察

将有颜色变化的固体培养基平板直接置于体式数码显微镜观察，无菌切取带有菌落的固体培养基置于载玻片中进行Dienes染色，低倍镜下观察。

1.7PCR鉴定

取纯化后的培养物1mL，14000rpm离心10min，弃上清，沉淀用1mL无菌TE缓冲液洗涤1～3次，之后用60～100μL TE悬浮，于沸水浴10min，置冰上冷却后，10000r/min离心10min，取上清作为模板。

下面结合实验结果对本发明作进一步描述。

1)CCU计数结果

表1培养7天时各培养基CCU结果

“+”表示有颜色变化；“－”表示无颜色变化。

表2培养10天时各培养基变色情况

“+”表示有颜色变化；“－”表示无颜色变化。

各培养基两组平行管中的颜色变化情况基本一致，计数结果显示，猪肺炎支原体在新培养基中颜色改变最快，培养效果最好，其次是KM₂培养基

2)PCR检测结果

于培养的第10天，用PCR方法对各种培养液CCU管进行病原体检测，结果如图2 10天时各培养基CCU管的PCR测定结果图。图2中M：DNA标准600；1：A₂₆培养基(10^-8/CCU)；2：驴血清培养基(10^-8/CCU)；3：GW培养基(10^-8/CCU)；4：KM₂培养基(10^-8/CCU)；5：新培养基(10^-8/CCU)。

如图3所示，10天时各培养基10^-8CCU管的PCR测定结果。图中：M：DNA标准600；1：A₂₆培养基(10^-8/CCU)；2：驴血清培养基(10^-8/CCU)；3：GW培养基(10^-8/CCU)；4：KM₂培养基(10^-8/CCU)；5：新培养基(10^-8/CCU)。

结果显示10天时各培养基CCU管检测都出现了明显的目的条带，即说明当培养基有颜色变化时有猪肺炎支原体的生长，而各管中CCU滴度为10^-8浓度时，只有新培养基出现了明显的目的条带。

3)菌落形态观察

依据CCU计数结果，选择新固体培养基作为纯化培养基进行了菌落形态观察试验。

培养基到第6天时，颜色有轻微的变黄，第10天时，颜色较空白对照明显变黄(图4)，第15天时，20倍镜下观察可见琼脂表面有大小不一、呈点状露珠样菌落(图5)；40倍观察时可见菌落形态为圆形或者椭圆形，菌落稍嵌入琼脂，中间颜色较深有的呈点状，菌落周围颜色较浅(图6)。

经Dienes染色后，在40倍显微镜下观察到猪肺炎支原体菌落被染成蓝色，其余不被染色(图7)。图7(a)：空白对照平板，(b)：被染色的猪肺炎支原体菌落(40×)。

4)PCR鉴定结果，如图8所示。图中，1：病料分离株；2：阳性对照；3：阴性对照；M：DNA标准600。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体液体培养基的制备方法包括：

量取灭菌1％水解乳蛋白Hank's液、无菌DMEM溶液、无菌灭活猪血清、灭菌酵母浸液、双抗溶液，用灭菌的3.5％NaHCO₃调节pH。

2.如权利要求1所述的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基的制备方法进一步包括：量取灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL、双抗溶液50mL，用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6。

3.如权利要求1所述的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，其特征在于，Hank’s液的配制方法包括：

(1)甲液的配制1L：氯化钠160g、氯化钾8g、硫酸镁2g、氯化镁2g、加蒸馏水至800mL溶解后加入氯化钙2.8g，补足蒸馏水至1L，并加2mL氯仿作为防腐剂，于4℃冰箱保存；

(2)乙液的配制1L：磷酸氢二钠3.04g、磷酸二氢钾1.2g、葡萄糖20g，将上述成分溶于800mL蒸馏水中，再加入100mL 0.4％酚红溶液；加蒸馏水至1000mL，并加2mL氯仿防腐，于4℃冰箱保存；

(3)取甲液1份，乙液1份、蒸馏水18份，121℃灭菌15min后，置于4℃冰箱保存备用；使用时用3.5％的灭菌碳酸氢钠溶液，将pH值调至7.2～7.6。

4.如权利要求1所述的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，其特征在于，酵母浸液的制备方法包括：

酵母粉25g加100mL双蒸馏水，煮沸30min，4000r/min离心15分钟，吸取上清于玻璃瓶中，121℃高压灭菌15min。

5.如权利要求1所述的猪肺炎支原体液体培养基的制备方法，其特征在于，1％水解乳蛋白的配制方法包括：

称取1g水解乳蛋白粉溶于100mLHank’s液，装玻璃瓶内，121℃高压灭菌15min，4℃冰箱保存备用。

6.一种利用权利要求1～5任意一项所述猪肺炎支原体液体培养基的制备方法制备的猪肺炎支原体液体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体液体培养基由灭菌1％水解乳蛋白Hank's液400mL、无菌DMEM溶液400mL、无菌灭活猪血清200mL、灭菌酵母浸液10mL和双抗溶液50mL组成。

7.如权利要求6所述的猪肺炎支原体液体培养基，其特征在于，所述猪肺炎支原体培养基用灭菌的3.5％NaHCO₃调pH至7.6。

8.一种利用权利要求6～7任意一项所述猪肺炎支原体液体培养基制备的猪肺炎支原体固体培养基，所述猪肺炎支原体固体培养基按质量比在猪肺炎支原体液体培养基中加入2％琼脂粉，混合后制得猪肺炎支原体固体培养基。

9.一种利用权利要求6～7任意一项所述猪肺炎支原体液体培养基中生长的猪肺炎支原体制备猪支原体肺炎灭活疫苗。

10.一种利用权利要求6～7任意一项所述猪肺炎支原体液体培养基中生长的猪肺炎支原体为猪支原体肺炎病原学鉴定提供的可靠病原材料。

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