CN106497826B - 低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法。所述低血清高效培养猪肺炎支原体培养基包括基础培养基及添加包，所述基础培养基包括：M199、脑浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鲜酵母提取物、Hepes、柠檬酸铁、氯化钙.2H2O、酚红、dd H2O，所述添加包的组份包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、乙醇、猪血清。本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法通过一些水解物以及脂类的添加，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，提高猪肺炎支原体抗原效价。

Description

低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基。
背景技术
猪肺炎支原体会引起猪的慢性呼吸道疾病，造成养猪业经济损失。肺炎支原体的培养和保存条件非常苛刻，是疫苗规模化生产的工艺难题。猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。在支原体细胞壁组成成分当中，脂类含量很高，其中胆固醇的含量就有约36％，所以脂类是非常重要的一个成分。在培养基中，添加血清会造成成本较高，利用脂类来代替血清，也是近些年来研究的热点，本发明利用脂类的合理添加，使得培养支原体所用的血清浓度降低到5％以下，大大的节省了成本。目前，市场上的支原体培养如：A26、KM2培养基基成分较为简单。
发明内容
为了解决上述培养基成本较高、成分简单的技术问题，本发明提供一种成本低及效果好的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基。
本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基包括基础培养基及添加包，所述基础培养基包括：M199、脑浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鲜酵母提取物、Hepes、柠檬酸铁、氯化钙.2H2O、酚红、dd H2O，所述添加包的组份包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、乙醇、猪血清；
所述M199的质量浓度为5-17g/L，所述脑浸出粉的质量浓度为3-15g/L，所述水解乳蛋白的质量浓度为0.5-3g/L，所述BSA的质量浓度为2-8g/L，所述葡萄糖的质量浓度为4-8g/L，所述新鲜酵母提取物的质量浓度为3-60g/L，所述Hepes的质量浓度为1-5g/L，所述柠檬酸铁的质量浓度为0.01-5g/L，所述氯化钙.2H2O的质量浓度为0.01-5g/L，所述酚红的浓度为1-6ml/L，所述dd H2O的质量浓度为500-2000ml/L；
所述胆固醇的质量浓度为50-90mg/L、所述亚油酸的质量浓度为30-100mg/L、所述亚麻酸的质量浓度为30-100mg/L、所述软脂酸的质量浓度为30-100mg/L、所述乙醇的浓度为10-15ml/L、所述猪血清的浓度为30-100mg/L。
在本发明提供的所述低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、配制基础培养基：按照基础培养基组分配方配制基础培养基；
步骤二、PH值调节：用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.4-7.6；
步骤三、灭菌：对基础培养基进行高温消毒；
步骤四、加入添加包：无菌条件下加入添加包，即制得成品。
在本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法一种较佳实施例中，所述步骤四中添加包的制备方法具体为：
步骤一、在一个容器中加5-30ml的无水乙醇，并且将其温度控制在10-60℃；
步骤二、将胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸及乙醇的组分缓慢加入；
步骤三、在恒温条件下对添加包混合组分进行震荡或搅拌至完全溶解；
步骤四、将步骤三中的溶液冷却至室温，同时加入猪血清；
步骤五、配制好后过滤。
本发明的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法的注意事项及有益效果：
利用成分相对复杂的培养基M199作为基础培养基的一部分，可以避免的培养基成分单一所造成的影响培养基性能的作用；该猪肺炎支原体培养基能够降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液效价高达109CCU/ml，可用于疫苗等相关领域的生产和研究。有利于高效生产猪肺炎支原体培养基的研制，通过一些水解物以及脂类的添加，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，提高猪肺炎支原体抗原效价。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法一种实施例的工艺流程图；
图2是图1所示的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法中添加包的制备方法一种实施例的工艺流程图；
图3是猪肺炎支原体在不同的培养基中的生长情况，纵坐标表示LogCCU，横坐标表示时间(h)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
所述低血清高效培养猪肺炎支原体培养基1包括基础培养基及添加包。所述基础培养基包括：M199、脑浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鲜酵母提取物、Hepes、柠檬酸铁、氯化钙.2H2O、酚红、dd H2O。所述添加包的组份包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、乙醇、猪血清。
所述M199的质量浓度为5-17g/L，所述脑浸出粉的质量浓度为3-15g/L，所述水解乳蛋白的质量浓度为0.5-3g/L，所述BSA的质量浓度为2-8g/L，所述葡萄糖的质量浓度为4-8g/L，所述新鲜酵母提取物的质量浓度为3-60g/L，所述Hepes的质量浓度为1-5g/L，所述柠檬酸铁的质量浓度为0.01-5g/L，所述氯化钙.2H2O的质量浓度为0.01-5g/L，所述酚红的浓度为1-6ml/L，所述dd H2O的质量浓度为500-2000ml/L，。
所述胆固醇的质量浓度为50-90mg/L、所述亚油酸的质量浓度为30-100mg/L、所述亚麻酸的质量浓度为30-100mg/L、所述软脂酸的质量浓度为30-100mg/L、所述乙醇的浓度为10-15ml/L、所述猪血清的浓度为30-100mg/L。
请参阅图1，是本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法一种实施例的工艺流程图。
所述低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法S1，包括如下步骤：
步骤S11、配制基础培养基：按照基础培养基组分配方配制基础培养基；
步骤S12、PH值调节：用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.4-7.6；
步骤S13、灭菌：对基础培养基进行高温消毒；
步骤S14、加入添加包：无菌条件下加入添加包，即制得成品。
请参阅图2，是本发明提供的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法中添加包的制备方法一种实施例的工艺流程图。
所述步骤四中添加包的制备方法S14具体为：
步骤S141、在一个容器中加5-30ml的无水乙醇，并且将其温度控制在10-60℃；
步骤S142、将胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸及乙醇的组分缓慢加入；
步骤S143、在恒温条件下对添加包混合组分进行震荡或搅拌至完全溶解；
步骤S144、将步骤S143中的溶液冷却至室温，同时加入猪血清；
步骤S145、配制好后过滤。
本发明的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基1及其制备方法具有如下有益效果：
利用成分相对复杂的培养基M199作为基础培养基的一部分，可以避免的培养基成分单一所造成的影响培养基性能的作用；该猪肺炎支原体培养基能够降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液效价高达109CCU/ml，可用于疫苗等相关领域的生产和研究。有利于高效生产猪肺炎支原体培养基的研制，通过一些水解物以及脂类的添加，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，提高猪肺炎支原体抗原效价。
采用本发明提供的培养基对猪肺炎支原体菌株进行培养试验：
本实验选取的支原体是猪肺炎支原体168株，培养方法如下：在以KM2、A26添加20％的猪血清作为对照试验，以本发明培养基JYK-MHM+5％猪血清作为实验组进行了猪肺炎支原体培养试验。在37℃、转速100rpm、PH 7.5的条件下培养使得支原体种子复壮，当培养基的颜色变黄时，即培养基的PH值间于5-6之间时，在无菌条件下取出培养物，进行活菌滴度的测定。
活菌滴度(CCU)测定
在培养的猪肺炎支原体培养基中，每隔6时进行采样。具体方法如下：将培养基(包括：KM2+20％猪血清、A26+20％猪血清和自主研发的JYK-MHM+5％猪血清)分别分装成每管2.7ml，第1号管加入待测菌液0.3ml，吹打混匀后，取0.3ml加入第2号试管中，吹打混匀后，取0.3ml加入第3号试管中，依次重复以上操作至第10管，将第10管中混匀后取0.3ml弃去。由此待测菌液被稀释为10-1，10-2，10-3至10-10不同的稀释度。每个时间点取样3份，将试管置于37℃恒温培养箱培养，以未接种菌液的培养基为阴性对照。连续计数60h每天观察试管颜色变化，直至无试管颜色发生变化为止，最后一个变色的试管即为待测菌液的生长滴度，用颜色变化单位(color change unit，CCU)表示。
生长情况如图3所示。
从图3可以看出，本发明的培养基培养猪肺炎支原体的颜色变化单位CCU为109/ml，明显高于对照组KM2+20％猪血清、A26+20％猪血清。该猪肺炎支原体培养基能够降低血清的用量，可以使得血清的添加量低于5％，从而降低了成本，同时也使得支原体的质量提升，既保证半成品生长滴度高而且稳定，用本发明方法制备的半成品菌液效价高达109CCU/ml，可用于疫苗等相关领域的生产和研究。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基，其特征在于，包括基础培养基及添加包，所述基础培养基包括：M199、脑浸出粉、水解乳蛋白、BSA、葡萄糖、新鲜酵母提取物、Hepes、柠檬酸铁、氯化钙.2H2O、酚红、dd H2O，所述添加包的组份包括胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸、乙醇、猪血清；
所述M199的质量浓度为5-17g/L，所述脑浸出粉的质量浓度为3-15g/L，所述水解乳蛋白的质量浓度为0.5-3g/L，所述BSA的质量浓度为2-8g/L，所述葡萄糖的质量浓度为4-8g/L，所述新鲜酵母提取物的质量浓度为3-60g/L，所述Hepes的质量浓度为1-5g/L，所述柠檬酸铁的质量浓度为0.01-5g/L，所述氯化钙.2H2O的质量浓度为0.01-5g/L，所述酚红的浓度为1-6ml/L，所述dd H2O的质量浓度为500-2000ml/L；
所述胆固醇的质量浓度为50-90mg/L、所述亚油酸的质量浓度为30-100mg/L、所述亚麻酸的质量浓度为30-100mg/L、所述软脂酸的质量浓度为30-100mg/L、所述乙醇的浓度为10-15ml/L、所述猪血清的浓度为30-100mg/L。
2.一种利用要求1所述的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、配制基础培养基：按照基础培养基组分配方配制基础培养基；
步骤二、PH值调节：用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至7.4-7.6；
步骤三、灭菌：对基础培养基进行高温消毒；
步骤四、加入添加包：无菌条件下加入添加包，即制得成品。
3.根据权利要求2所述的低血清高效培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，其特征在于，所述步骤四中添加包的制备方法具体为：
步骤一、在一个容器中加5-30ml的无水乙醇，并且将其温度控制在10-60℃；
步骤二、将胆固醇、亚油酸、亚麻酸、软脂酸及乙醇的组分缓慢加入；
步骤三、在恒温条件下对添加包混合组分进行震荡或搅拌至完全溶解；
步骤四、将步骤三中的溶液冷却至室温，同时加入猪血清；
步骤五、配制好后过滤。
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