CN114836341A - 一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪肺炎支原体培养基，该培养基的溶剂为水，该培养基包括15‑25g/L的PPLO肉粉，80‑120ml/L酵母浸出液，6‑8g/L葡萄糖，4‑6g/L高糖DMEM粉，80‑120ml/L无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清和5‑10g/L氨基酸维生素复合物。该培养基培养猪肺炎支原体复壮效果好，培养物滴度高。本发明还公开了该培养基的制备方法以及猪肺炎支原体的培养方法。

Description

一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于兽医生物制品领域，涉及一种猪肺炎支原体培养基及其制备方法。
背景技术
猪支原体肺炎(Swine enzootic hyopneumoniae)，又称猪地方性流行肺炎，俗称猪喘气病，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种慢性、接触性、呼吸道传染病。临床上以气喘、咳嗽和肺部典型的“虾肉”样病变为特征，发病率高。本病广泛分布于世界各地，在我国许多地区的猪场都有发生。该病原在猪体内主要寄居在气管、支气管和细支气的纤毛上，破坏猪呼吸道的物理防卫机制-防御粘膜，增加了猪群对其它呼吸性病原体的易感性，引发猪呼吸道综合征(PRDC)或者其他疾病，严重危害养猪业的发展。
猪肺炎支原体的体外培养具有重要意义，能够扩增繁殖猪肺炎支原体，进而用于对其生理学、遗传学、药物敏感性等方面进行研究，以便研究预防、质量与控制猪支原体肺炎的技术方案，也为猪肺炎支原体疫苗的研发与生产提供了便利条件。
申请号201710123741.2的中国专利文件公开了一种猪肺炎支原体培养基，由基础培养基包括20×Hank’s 25-35ml、酵母提取物1-5g、乳蛋白水解物0.5-3g、牛心提取物5-12g、去离子水770-870ml，辅助培养基包括5％精氨酸溶液1-5ml、5％半胱氨酸溶液1-5ml、5％辅酶Ι1-5ml、10万U/ml青霉素5-10ml和灭活的健康猪血清80-200ml组成。
该培养基材料虽然简单易得，但是在日常生产中牛心提取物、酵母提取物是以干粉的形式加入到培养基中。营养物干粉在原始制备过程中氨基酸虽然得以很大程度的保留，但是一些微量有助于微生物生长的必要营养因子会有损失；该配方血清的用量过大，不适合应用于大量的生产，因此猪血清的用量是一个比较大的开销，所以有必要研发更好的猪肺炎支原体培养基。
发明内容
本发明第一方面提供了一种猪肺炎支原体培养基，所述培养基的溶剂为水，所述培养基包括15-25g/L(例如，16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、23g/L、24g/L中任一值或两值之间的范围)的PPLO肉粉，80-120ml/L(例如，85ml/L、90ml/L、95ml/L、100ml/L、105ml/L、110ml/L、115ml/L中任一值或两值之间的范围)酵母浸出液，6-8g/L(例如，6.2g/L、6.4g/L、6.6g/L、6.8g/L、7.0g/L、7.2g/L、7.4g/L、7.6g/L、7.8g/L中任一值或两值之间的范围)葡萄糖，4-6g/L(例如，4.2g/L、4.4g/L、4.6g/L、4.8g/L、5.0g/L、5.2g/L、5.4g/L、5.6g/L、5.8g/L中任一值或两值之间的范围)高糖DMEM粉和80-120ml/L(例如，85ml/L、90ml/L、95ml/L、100ml/L、105ml/L、110ml/L、115ml/L中任一值或两值之间的范围)无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清。
在一些实施方式中，所述培养基包括20g/L的PPLO肉粉，100ml/L酵母浸出液，7.5g/L葡萄糖，5g/L高糖DMEM粉和100ml/L无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清。
在一些实施方式中，所述培养基还包括5-10g/L(例如，5.5g/L、6.0g/L、6.5g/L、7.0g/L、7.5g/L、8.0g/L、8.5g/L、9.0g/L、9.5g/L中任一值或两值之间的范围)氨基酸维生素复合物。
在一些实施方式中，所述培养基包括6.72g/L氨基酸维生素复合物。
在一些实施方式中，所述氨基酸维生素复合物的组分为：2.5-3.5w/w％L-半胱氨酸盐酸盐，69-74w/w％丙酮酸钠，7.0-8.0w/w％精氨酸，7.0-8.0w/w％赖氨酸，7.0-8.0w/w％组氨酸与2.5-3.5w/w％B族维生素。
在一些实施方式中，所述氨基酸维生素复合物的组分为：2.97w/w％L-半胱氨酸盐酸盐，71.86w/w％丙酮酸钠，7.4w/w％精氨酸，7.4w/w％赖氨酸，7.4w/w％组氨酸与2.97w/w％B族维生素。
在一些实施方式中，所述B族维生素的组分为：20-30w/w％维生素B2，20-30w/w％维生素B6，20-30w/w％维生素B7与20-30w/w％维生素B9。
在一些实施方式中，所述B族维生素的组分为：25w/w％维生素B2，25w/w％维生素B6，25w/w％维生素B7与25w/w％维生素B9。在一些实施方式中，所述酵母浸出液为酸提取的酵母浸出物水溶液，每Kg酵母原料所用水为3-7L(例如，3.5L、4.0L、4.5L、5.0L、5.5L、6.0L、6.5L中任一值或两值之间的范围)。
在一些实施方式中，所述酵母浸出液的制备步骤为：
S1：将酵母加入水中，54-58℃(例如，54.5℃、55.0℃、55.5℃、56.0℃、56.5℃、57.0℃、57.5℃中任一值或两值之间的范围)下灭活，得到第一混合物；
S2：用酸将所述第一混合物的pH调整至2.5-3.5(例如，2.6、2.8、3.0、3.2、3.4中任一值或两值之间的范围)，得到第二混合物；
S3：将所述第二混合物离心，取上清液，将pH调整至6.5-7.5(例如，6.6、6.8、7.0、7.2、7.4中任一值或两值之间的范围)，得到第三混合物；
S4：将所述第四混合物煮沸，降至室温，得到所述酵母浸出液。
在一些实施方式中，所述培养基还包括10-25×104IU/L(例如，12×104IU/L、14×104IU/L、16×104IU/L、18×104IU/L、20×104IU/L、22×104IU/L、24×104IU/L中任一值或两值之间的范围)的抗生素。
在一些实施方式中，所述培养基包括16×104IU/L的抗生素。
在一些实施方式中，所述抗生素为青霉素钠。
在一些实施方式中，所述培养基还包4-6mg/L(例如，4.5mg/L、5.0mg/L、5.5mg/L中任一值或两值之间的范围)酸碱指示剂。
在一些实施方式中，所述培养基包5mg/L酸碱指示剂。
在一些实施方式中，所述酸碱指示剂为苯酚红。
在一些实施方式中，所述培养基的溶剂为蒸馏水。
在一些实施方式中，所述高糖DMEM粉的成分为：45-54w/w％D-葡萄糖，5.0-8.0w/w％L-谷氨酰胺，1.0-1.5w/w％丙酮酸钠和40-45w/w％碳酸氢钠。
在一些实施方式中，所述高糖DMEM粉的成分为：50.6w/w％D-葡萄糖，6.6w/w％L-谷氨酰胺，1.2w/w％丙酮酸钠和41.6w/w％碳酸氢钠。
在一些实施方式中，所述PPLO肉粉与所述酵母浸出液采用高压灭菌后使用。
在一些实施方式中，所述PPLO肉粉与所述酵母浸出液外的其他材料采用过滤除菌后使用。
本发明第二方面提供了本发明第一方面所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述制备方法为：将所述培养基的原料同时或相继加入水中，得到所述猪肺炎支原体培养基。
本发明第三方面提供了一种猪肺炎支原体的培养方法，所述培养方法为：使用本发明第一方面所述的猪肺炎支原体培养基，培养猪肺炎支原体。
在一些实施方式中，所述培养方法为：将猪肺炎支原体接种到本发明第一方面所述的猪肺炎支原体培养基进行培养，当所述的猪肺炎支原体培养基的pH下降到为5.0-5.6时，收获所述猪肺炎支原体。
在一些实施方式中，所述猪肺炎支原体在所述的猪肺炎支原体培养基中的接种量为5-15v/v％。
在一些实施方式中，所述培养的条件为：36.5-37℃下培养72h-168h。
本发明通过调整猪肺炎支原体培养基中碳源的配比和并添加用于培养细胞的复合氨基酸生长因子等简单易得的材料，来对猪肺炎支原体的生长进行一系列的优化测试，最终得到一种适宜的猪肺炎支原体的复壮培养基以及培养方法，以此来降低猪肺炎支原体在配置疫苗过程中的浓缩倍数，每增加一个生长滴度，浓缩倍数就减少10倍，并且通过改变葡萄糖用量以及市场上易得的高糖细胞培养基DMEM、氨基酸维生素复合物就可以适当的降低培养基中其他添加物的浓度，以此达到节约成本的目的。
配制猪肺炎支原体培养基，改变培养基中的葡萄糖含量，以及细胞所必需的氨基酸种类，以此来培养猪肺炎支原体Y株。根据支原体生长的菌数含量，来筛选出适合的猪肺炎支原体Y株培养基。利用猪肺炎支原体Y株的传代实验，依次的扩增培养出7代次的支原体菌液。对不同代次的菌液进行CCU计数实验，来验证来自不同含量的高糖猪肺炎支原体培养基的培养效果。通过CCU计数结果可知，培养基8的效果最好。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
材料
猪肺炎支原体Y株：来自辽宁益康生物股份有限公司种毒库，批号20180414。
无猪肺炎支原体抗体的猪血清(即，猪肺炎支原体抗体阴性猪血清)：购买自兰州民海生物工程有限公司，批号20171116。
PPLO肉粉：购买自美国BD公司，批号211458。
新鲜酵母浸出液：制备步骤为：取鲜酵母1000g，溶于2L蒸馏水中，56℃灭活30min，冷却至室温后加入浓HCL溶液至溶液pH值为3左右；5000r/min离心30min，定容至5L。取上清液调节pH至中性，加热煮沸，室温放置一段时间后，用3层滤纸过滤，过滤后溶液即为自制酵母浸出液。
高糖DMEM粉配方为：50.6w/w％D-葡萄糖，6.6w/w％L-谷氨酰胺，1.2w/w％丙酮酸钠，41.6w/w％碳酸氢钠。
氨基酸维生素复合物：L-半胱氨酸盐酸盐2.97w/w％，丙酮酸钠71.86w/w％，精氨酸7.4w/w％，赖氨酸7.4w/w％，组氨酸7.4w/w％，B族维生素2.97w/w％(其中，B族维生素：维生素B225w/w％，维生素B625w/w％，维生素B725w/w％，维生素B925w/w％)。
实施例1：培养基的配制
(一)培养基的配方
培养基1：PPLO肉粉含量20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基2：PPLO肉粉含量20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为7.5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基3：PPLO肉粉含量20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为10g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基4：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为5g/L，高糖DMEM含量为5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基5：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为7.5g/L，高糖DMEM含量为5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基6：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为10g/L，高糖DMEM含量为5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/，L溶剂为蒸馏水。
培养基7：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为5g/L，高糖DMEM含量为5g/L，氨基酸维生素复合物含量为6.72g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基8：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为7.5g/L，高糖DMEM含量为5g/L，氨基酸维生素复合物含量为6.72g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基9：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为10g/L，高糖DMEM含量为5g/L，氨基酸维生素复合物含量为6.72g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。
培养基10：PPLO肉粉含量50g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为5g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量200ml/L，溶剂为蒸馏水。
(二)培养基的配制
根据前述配方要求按照1L体系所需进行称量原材料，分别将PPLO肉粉溶于适量的蒸馏水，以能形成悬液为准，并混合新鲜酵母浸出液进行常规高温高压灭菌；将称量好的其他成分溶于蒸馏水中，保证材料能够溶解为准，过滤除菌处理，之后过滤部分材料与高压灭菌部分材料混合，定容形成体系为1L的培养基1-10。
实施例2：支原体的培养
(1)菌种的复苏
取猪肺炎支原体Y株20180414批次的冻干菌种10支，分别依次用于测试实施例1所制备的培养基1-10。将培养基1-10的培养和测试分别依次称作组1-组10。
将猪肺炎支原体Y株菌种分别溶于培养基中，以10v/v％接种量，接种于5ml的液体培养基1-10中，接种后分别用无菌NaOH溶液调节pH至7.5到8.0之间，36.5～37℃条件下静置培养，72h～168h后待培养基颜色变为浅黄色、pH降至5.6～6.0时，收获所培养的复苏后的猪肺炎支原体菌液1-10。
(2)猪肺炎支原体的扩增传代实验
复苏后的猪肺炎支原体Y株菌液1-10，分别记作F1代，将10组复苏后的支原体按10v/v％的接种量分别依次接种于培养基1-10，培养体系为20ml，36.5～37℃静置培养72h～168h，待培养基颜色变为明黄，培养液外观清晰，内不溶性颗粒混合物含量较少时收获所培养的菌液，此时菌液的pH为5.0～5.6之间，记作F2代；依照此方法，将一代的支原体培养液按10v/v％的接种量接种于培养基得到下一代支原体培养液，分别将10组培养体系扩增为50ml，100ml，500ml，1000ml，3000ml，依次记作F3、F4、F5、F6、F7。
(3)猪肺炎支原体生长滴度检测
以F2代的10组支原体培养液作为检测对象，用与扩增传代一致的培养基，做CCU生长滴度检测实验，1-10组分别依次使用实施例1所制备的培养基1-10，培养体系为2ml，接种量为200μl。取200μl原倍菌液，与1.8ml培养基充分混合在7ml玻璃瓶中，记作1号瓶；从1号瓶中取200μl原倍菌液，与1.8ml培养基充分混合在7ml玻璃瓶中，记作2号瓶，依照此方法，10倍稀释至12号瓶。完成稀释后，密闭条件培养，36.5～37℃静置培养21天，观察并记录实验结果；F3，F4，F5，F6，F7支原体均按照此方法进行生长滴度实验检测。
(4)实验结果
在10种不同配比的培养基的培养条件下，针对每一种培养基经过6次的CCU生长滴度实验检测，CCU计数结果是滴度的指数，10倍稀释后能够改变颜色的最大稀释倍数，比如，CCU计数为5的含义是：10倍稀释至1号瓶至5号瓶能够改变颜色，10倍稀释至6号瓶至12号瓶不能够改变颜色。每种培养基每个培养世代分别平行测试三次，计算平均值与标准差。得出实验结果如下表1。
表1.猪肺炎支原体ZY猪接种10种血清培养基含菌量结果统计
Figure BDA0003597961780000081
Figure BDA0003597961780000091
Figure BDA0003597961780000101
(5)小结
由此可见，第8组培养及配方比较适合猪肺炎支原体Y株的生长(8组培养及配方：PPLO肉粉含量为20g/L，新鲜酵母浸出液含量100ml/L，注射用青霉素钠含量16万IU/L、苯酚红含量5mg/L，葡萄糖含量为7.5g/L，高糖DMEM含量为5g/L，氨基酸维生素复合物含量为6.72g/L，无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清含量100ml/L，溶剂为蒸馏水。)；适当的增加葡萄糖用量、添加高糖DMEM、以及添加氨基酸维生素复合物对于支原体Y株的生长都有明显的促进作用，且它们的培养效果均要好于第10组，单纯增加血清用量的猪肺炎支原体培养基。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (10)

1.一种猪肺炎支原体培养基，所述培养基的溶剂为水，所述培养基包括15-25g/L的PPLO肉粉，80-120ml/L酵母浸出液，6-8g/L葡萄糖，4-6g/L高糖DMEM粉和80-120ml/L无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清。
2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括20g/L的PPLO肉粉，100ml/L酵母浸出液，7.5g/L葡萄糖，5g/L高糖DMEM粉和100ml/L无猪肺炎支原体抗体的灭活猪血清；
优选地，所述培养基还包括5-10g/L氨基酸维生素复合物；
优选地，所述培养基包括6.72g/L氨基酸维生素复合物；
优选地，所述氨基酸维生素复合物的组分为：2.5-3.5w/w％L-半胱氨酸盐酸盐，69-74w/w％丙酮酸钠，7.0-8.0w/w％精氨酸，7.0-8.0w/w％赖氨酸，7.0-8.0w/w％组氨酸与2.5-3.5w/w％B族维生素；
优选地，所述氨基酸维生素复合物的组分为：2.97w/w％L-半胱氨酸盐酸盐，71.86w/w％丙酮酸钠，7.4w/w％精氨酸，7.4w/w％赖氨酸，7.4w/w％组氨酸与2.97w/w％B族维生素；
优选地，所述B族维生素的组分为：20-30w/w％维生素B2，20-30w/w％维生素B6，20-30w/w％维生素B7与20-30w/w％维生素B9；
优选地，所述B族维生素的组分为：25w/w％维生素B2，25w/w％维生素B6，25w/w％维生素B7与25w/w％维生素B9。
3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述酵母浸出液为酸提取的酵母浸出物水溶液，每Kg酵母原料所用水为3-7L；
优选地，所述酵母浸出液的制备步骤为：
S1：将酵母加入水中，54-58℃下灭活，得到第一混合物；
S2：用酸将所述第一混合物的pH调整至2.5-3.5，得到第二混合物；
S3：将所述第二混合物离心，取上清液，将pH调整至6.5-7.5，得到第三混合物；
S4：将所述第四混合物煮沸，降至室温，得到所述酵母浸出液。
4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括10-25×104IU/L的抗生素；
优选地，所述培养基包括16×104IU/L的抗生素；
优选地，所述抗生素为青霉素钠。
5.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包4-6mg/L酸碱指示剂；
优选地，所述培养基包5mg/L酸碱指示剂；
优选地，所述酸碱指示剂为苯酚红；
优选地，所述培养基的溶剂为蒸馏水。
6.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述高糖DMEM粉的成分为：45-54w/w％D-葡萄糖，5.0-8.0w/w％L-谷氨酰胺，1.0-1.5w/w％丙酮酸钠和40-45w/w％碳酸氢钠；
优选地，所述高糖DMEM粉的成分为：50.6w/w％D-葡萄糖，6.6w/w％L-谷氨酰胺，1.2w/w％丙酮酸钠和41.6w/w％碳酸氢钠。
7.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述PPLO肉粉与所述酵母浸出液采用高压灭菌后使用；
优选地，所述PPLO肉粉与所述酵母浸出液外的其他材料采用过滤除菌后使用。
8.权利要求1-7中任一项所述猪肺炎支原体培养基的制备方法，所述制备方法为：将所述培养基的原料同时或相继加入水中，得到所述猪肺炎支原体培养基。
9.一种猪肺炎支原体的培养方法，所述培养方法为：使用权利要求1-7中任一项所述的猪肺炎支原体培养基，培养猪肺炎支原体。
10.如权利要求9所述的培养方法，所述培养方法为：将猪肺炎支原体接种到权利要求1-7中任一项所述的猪肺炎支原体培养基进行培养，当所述的猪肺炎支原体培养基的pH下降到为5.0-5.6时，收获所述猪肺炎支原体；
优选地，所述猪肺炎支原体在所述的猪肺炎支原体培养基中的接种量为5-15v/v％；
优选地，所述培养的条件为：36.5-37℃下培养72h-168h。
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