CN105420153B - 一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法 - Google Patents

一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及发酵培养技术领域，特别涉及一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法。该发酵培养基包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。本发明发酵培养基适合绿脓杆菌高密度发酵生长，可大大提供绿脓杆菌的活菌数；与原有传统培养基相比，本发明提供的改良培养基明显将对数生长期由4～8h延长至4～10h，菌数由140～159亿提高至240～250亿，pH值稳定在7.0，大大提高了绿脓杆菌的产量。

Description

一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法
技术领域
本发明涉及发酵培养技术领域，特别涉及一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法。
背景技术
水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌引起水貂的一种急性传染病，多发生于秋季温暖潮湿，以咳嗽、呼吸困难、吐血、鼻出血为临床特症、以肺大面积出血、肺肝样变、肺水肿为主要病变特征，发病率为20％-50％，死亡率为100％。病貂发病急，死亡快，常呈地方性暴发性流行。近年来由于水貂养殖规模和集约化程度明显提高，水貂出血性肺炎的发病率显著上升，该病危害程度逐年加深，已成为危害我国水貂养殖的主要传染病之一。
鉴于该病的发病特点及该菌易产生耐药性问题，用药物治疗该病往往很困难，灭活疫苗是预防该病的最有效方法，将水貂中流行的血清型的菌株灭活后制备成多价灭活疫苗，可有效预防同类血清型菌株引起的该病，“水貂绿脓杆菌分离株的生物学特性比较分析和血清型调查”，以及“水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法”(专利号：ZL201010203879.1)公开了我国引起水貂出血性肺炎的绿脓杆菌的主要血清型为G型和B型，并利用这2种血清型菌株DL15(国家菌种保藏号CGMCC NO.3811)和JL08(国家菌种保藏号CGMCC NO.3812)研制出了可用于预防水貂出血性肺炎的二价灭活疫苗，2011年该产品获得了农业部的临床试验批件，并同时进行了临床推广应用。经最小免疫剂量及免疫期测定等研究实验表明，该菌菌数的多少与免疫原性高低呈直接相关性，因此提高疫苗菌数直接决定着疫苗的质量及生产成本。
目前，绿脓杆菌的培养方式主要为转瓶培养方法，如专利号ZL201010203879.1的专利公开了一种水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法，其制备方法是使用转瓶进行通气培养菌体，按PYG培养基体积的3％～4％接种，通气培养12～15h，菌数在20～40亿CFU/mL之间，PYG培养基成分为：蛋白胨2％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，酵母粉0.3％，用去离子水配制，配完调pH值7.2～7.4，116℃，30min。该方法不能充分利用培养基营养成份，菌数低，产量低，工艺繁琐，生产周期长，生产成本高，生产量低，且易于污染，适用于疫苗研制前期的小批量生产，不适用于规模化生产。
申请号CN201210095852.4的专利公开了一种水貂绿脓杆菌蜂胶灭活疫苗及制备工艺，提及了用发酵罐生产绿脓杆菌，将菌种按2％体积加入到含2％胎牛血清的发酵培养基中，在37℃通气搅拌培养12～16h，使用终浓度为0.5％的甲醛灭活24h，该发明未提及使用培养基成份，未提及生产工艺如通气量、pH值，气压，种子液的接种比例及存放时间，而且所用的甲醛灭活浓度过高。申请人按该专利方法采用常规的发酵培养基及发酵参数进行发酵，生产的菌数较少，无法满足产业化要求。因此，急需提供一种生产菌数多的绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法。该发酵培养基适合绿脓杆菌高密度发酵生长，可大大提供绿脓杆菌的活菌数，在疫苗研制的基础上大大提高了产量，使产品更利于市场推广应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基，包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。
发酵生产过程中培养基成分对发酵结果有很大的影响，本发明通过大量研究发现一种适合绿脓杆菌高密度发酵生长的发酵培养基，可大大提供绿脓杆菌的活菌数，在疫苗研制的基础上大大提高了产量，使产品更利于市场推广应用。
作为优选，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10～30份，葡萄糖10～30份，酵母粉1～3份，氯化钠4～6份，Na2HPO41～5份，KH2PO40.4～1.6份，MgSO40.1～0.5份，枸橼酸钠0.1～0.5份，尿素2～6份，复合维生素B0.0002～0.0004份。
优选地，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
作为优选，复合维生素B包括生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇或尼古丁酸中的一种或两种以上的混合物。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为(10～20)：(1～5)：(150～200)：(1000～1200)：(400～500)：(400～500)。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为20：2：200：1000：400：400。
作为优选，培养基的pH值为7.0～7.2。
在本发明提供的一些实施例中，该发酵培养基的制备方法为：将蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素、复合维生素B溶于水中，调节pH值至7.0～7.2，灭菌。
该培养基中各组分用量为：蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉1～3g/L，氯化钠4～6g/L，Na2HPO41～5g/L，KH2PO40.4～1.6g/L，MgSO40.1～0.5g/L，枸橼酸钠0.1～0.5g/L，尿素2～6g/L，复合维生素B 0.0002～0.0004g/L，水补足。
本发明还提供了一种绿脓杆菌的发酵培养方法，包括如下步骤：
一级种子制备：取绿脓杆菌冻干菌接种于琼脂培养基，36～37℃培养18～24h，挑菌落接种于斜面培养基，36～37℃培养18～24h，获得一级种子；
二级种子制备：取一级种子接种于液体培养基，36～37℃培养12h，然后再接种于液体培养基，36～37℃培养12h，获得二级种子；
发酵种子液制备：将二级种子接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度100～120r/min、进气流量70～90L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养7h，获得发酵种子液；
一级发酵：取发酵种子液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～110r/min、进气流量80～120L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得一级发酵液；
二级发酵：取一级发酵液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～100r/min、进气流量90～136L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得二级发酵液；
发酵培养基包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。
发酵生产过程中的各种因素如培养基成份、接种量、接种比例、pH值、温度等均对发酵结果有大的影响，本发明建立了一种适用于绿脓杆菌高密度发酵的培养基及生产工艺，可大大提高绿脓杆菌的活菌数，在疫苗研制的基础上大大提高了产量，使产品更利于市场推广应用。
作为优选，一级种子置2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代；二级种子置2～8℃保存，保存应不超过4日；发酵种子保存不超过4天，传代不超过3代。
作为优选，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10～30份，葡萄糖10～30份，酵母粉1～3份，氯化钠4～6份，Na2HPO41～5份，KH2PO40.4～1.6份，MgSO40.1～0.5份，枸橼酸钠0.1～0.5份，尿素2～6份，复合维生素B0.0002～0.0004份。
优选地，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
作为优选，复合维生素B包括生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇或尼古丁酸中的一种或两种以上的混合物。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为(10～20)：(1～5)：(150～200)：(1000～1200)：(400～500)：(400～500)。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为20：2：200：1000：400：400。
作为优选，培养基的pH值为7.0～7.2。
在本发明提供的一些实施例中，该发酵培养基的制备方法为：将蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素、复合维生素B溶于水中，调节pH值至7.0～7.2，灭菌。
该培养基中各组分用量为：蛋白胨10～30g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉1～3g/L，氯化钠4～6g/L，Na2HPO41～5g/L，KH2PO40.4～1.6g/L，MgSO40.1～0.5g/L，枸橼酸钠0.1～0.5g/L，尿素2～6g/L，复合维生素B 0.0002～0.0004g/L，水补足。
作为优选，一级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素，二级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素。
在本发明提供的一些实施例中，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为10g/L，尿素在发酵培养基中的浓度为2g/L。
作为优选，一级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤，二级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤。
在本发明提供的一些实施例中，发酵种子液制备中二级种子的接种体积百分含量为2％，一级发酵中发酵种子液的接种体积百分含量为3％，二级发酵中一级发酵液的接种体积百分含量为4％。
本发明还提供了一种水貂出血性肺炎疫苗的制备方法，包括如下步骤：
一级种子制备：取绿脓杆菌冻干菌接种于琼脂培养基，36～37℃培养18～24h，挑菌落接种于斜面培养基，36～37℃培养18～24h，获得一级种子；
二级种子制备：取一级种子接种于液体培养基，36～37℃培养12h，然后再接种于液体培养基，36～37℃培养12h，获得二级种子；
发酵种子液制备：将二级种子接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度100～120r/min、进气流量70～90L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养7h，获得发酵种子液；
一级发酵：取发酵种子液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～110r/min、进气流量80～120L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得一级发酵液；
二级发酵：取一级发酵液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～100r/min、进气流量90～136L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得二级发酵液；
疫苗脱毒：取二级发酵液脱毒，获得水貂出血性肺炎疫苗；
发酵培养基包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。
在本发明提供的一些实施例中，脱毒采用的试剂为0.5％的甲醛溶液。
在本发明提供的一些实施例中，脱毒的温度为37℃，脱毒的时间为24h。
作为优选，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10～30份，葡萄糖10～30份，酵母粉1～3份，氯化钠4～6份，Na2HPO41～5份，KH2PO40.4～1.6份，MgSO40.1～0.5份，枸橼酸钠0.1～0.5份，尿素2～6份，复合维生素B0.0002～0.0004份。
优选地，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.1份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HPO42.5份，KH2PO40.83份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.1份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.1份，尿素6份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.3份，尿素2份，复合维生素B 0.0003份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HPO41份，KH2PO40.4份，MgSO40.1份，枸橼酸钠0.3份，尿素4份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.3份，尿素6份，复合维生素B 0.0002份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.3份，枸橼酸钠0.5份，尿素2份，复合维生素B 0.0004份。
在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠4份，Na2HPO45份，KH2PO41.6份，MgSO40.5份，枸橼酸钠0.5份，尿素4份，复合维生素B 0.0002份。
作为优选，复合维生素B包括生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇或尼古丁酸中的一种或两种以上的混合物。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为(10～20)：(1～5)：(150～200)：(1000～1200)：(400～500)：(400～500)。
作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为20：2：200：1000：400：400。
作为优选，培养基的pH值为7.0～7.2。
绿脓杆菌属于好氧微生物，发酵罐生产中由于养分及氧气充足可使菌数快速上升，菌体对糖的分解产物如乙醇、甲醇、乙酸、芳香族化合物等对绿脓杆菌生长产生抑制作用，根据绿脓杆菌可利用葡萄糖和尿素的生化特性，采用单一补料分批发酵的方式在培养6～7h后补加葡萄糖作为碳源和尿素作为氮源，使发酵系统中保持合适的营养物浓度，保持微生物生长的适宜环境条件以达到高菌体浓度。作为优选，一级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素，二级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素。
在本发明提供的一些实施例中，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为10g/L，尿素在发酵培养基中的浓度为2g/L。
作为优选，一级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤，二级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤。
在本发明提供的一些实施例中，发酵种子液制备中二级种子的接种体积百分含量为2％，一级发酵中发酵种子液的接种体积百分含量为3％，二级发酵中一级发酵液的接种体积百分含量为4％。
本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法。该发酵培养基包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B。本发明至少具有如下优势之一：
1、本发明发酵培养基适合绿脓杆菌高密度发酵生长，可大大提供绿脓杆菌的活菌数；与原有传统培养基相比，本发明提供的改良培养基明显将对数生长期由4～8h延长至4～10h，菌数由140～159亿提高至240～250亿，pH值稳定在7.0，大大提高了绿脓杆菌的产量；
2、本发明研究发现在发酵培养的6～7h补充葡萄糖和尿素可提高绿脓杆菌的活菌数，采用本发明发酵培养基对绿脓杆菌进行发酵培养时，不补料的情况下对数生长期为4～9h，稳定期为9～12h，菌数稳定在196～200亿；补料情况下菌体的对数生长期为4～10h，稳定期为10～12h，菌数稳定在240～250亿，pH值在培养的1～12h内均稳定在7.0左右。
3、本发明通过100L、500L、1000L发酵罐逐级发酵方法的建立，确定了种子液的菌数、接种比例，种子液保存时间，传代次数，发酵收获时间，改良后的培养基及发酵罐的生产工艺可使菌数稳定到250亿CFU，比转瓶培养法菌数提高了5～10倍，可大批量生产。
附图说明
图1示实施例1改良培养基与对比例1传统培养基对发酵过程中pH值的影响；
图2示实施例1、实施例19与对比例1发酵工艺绿脓杆菌的生长曲线对比。
具体实施方式
本发明公开了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法中所用试剂、培养基成分均可由市场购得。
复合维生素B液组成：生物素20mg/L，叶酸2mg/L，核黄素200mg/L，肌醇1000mg/L，盐酸吡哆醇400mg/L，尼古丁酸400mg/L。116℃20min单独高压灭菌。
PYG培养基成分：蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠5g/L，调节pH值为7.2。116℃30min。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1～3发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表1发酵培养基成分
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度120r/min，进气流量70L/min，罐压70Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度110r/min，进气流量80L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度100r/min，进气流量90L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见表2。
表2发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例1 253±16 7.2±0.14
实施例2 242±7 7.0±0.08
实施例3 239±12 7.1±0.13
实施例4～6发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表3发酵培养基成分
组分 实施例4培养基 实施例5培养基 实施例6培养基
蛋白胨/g/L 10 20 30
葡萄糖/g/L 10 20 30
酵母粉/g/L 1 2 3
氯化钠/g/L 6 6 6
枸橼酸钠/g/L 0.1 0.1 0.1
尿素/g/L 2 4 6
维生素液/mL/L 10 15 20
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/g/L 1 1 1
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/g/L 0.4 0.4 0.4
MgSO<sub>4</sub>/g/L 0.1 0.3 0.5
水 补足 补足 补足
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.1℃，搅拌速度116r/min，进气流量74L/min，罐压62Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养6.5h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.1℃，搅拌速度104r/min，进气流量88L/min，罐压62Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养6.5h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.1℃，搅拌速度96r/min，进气流量99L/min，罐压62Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见下表。
表4发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例4 234±14 7.1±0.05
实施例5 236±8 7.0±0.04
实施例6 231±11 7.2±0.16
实施例7～9发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表5发酵培养基成分
组分 实施例7培养基 实施例8培养基 实施例9培养基
蛋白胨/g/L 10 20 30
葡萄糖/g/L 30 10 10
酵母粉/g/L 1 2 1
氯化钠/g/L 4 4 4
枸橼酸钠/g/L 0.3 0.3 0.5
尿素/g/L 4 6 4
维生素液/mL/L 15 20 20
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/g/L 5 5 5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/g/L 1.6 1.6 1.6
MgSO<sub>4</sub>/g/L 0.5 0.1 0.3
水 补足 补足 补足
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.2℃，搅拌速度112r/min，进气流量78L/min，罐压54Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养7h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.2℃，搅拌速度98r/min，进气流量96L/min，罐压54Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养7h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.2℃，搅拌速度92r/min，进气流量108L/min，罐压54Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见下表。
表6发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例10～12发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表7发酵培养基成分
组分 实施例10培养基 实施例11培养基 实施例12培养基
蛋白胨/g/L 10 20 30
葡萄糖/g/L 20 20 30
酵母粉/g/L 2 1 2
氯化钠/g/L 5 5 5
枸橼酸钠/g/L 0.5 0.1 0.1
尿素/g/L 6 2 4
维生素液/mL/L 10 20 10
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/g/L 2.5 2.5 2.5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/g/L 0.83 0.83 0.83
MgSO<sub>4</sub>/g/L 0.5 0.5 0.1
水 补足 补足 补足
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.3℃，搅拌速度108r/min，进气流量82L/min，罐压46Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.3℃，搅拌速度92r/min，进气流量104L/min，罐压46Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.3℃，搅拌速度88r/min，进气流量117L/min，罐压46Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见下表。
表8发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例10 234±9 7.3±0.05
实施例11 229±12 7.2±0.12
实施例12 235±7 6.9±0.13
实施例13～15发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表9发酵培养基成分
组分 实施例13培养基 实施例14培养基 实施例15培养基
蛋白胨/g/L 10 30 10
葡萄糖/g/L 10 10 20
酵母粉/g/L 3 2 3
氯化钠/g/L 6 6 6
枸橼酸钠/g/L 0.1 0.3 0.3
尿素/g/L 6 2 4
维生素液/mL/L 15 15 20
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/g/L 1 1 1
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/g/L 0.4 0.4 0.4
MgSO<sub>4</sub>/g/L 0.3 0.5 0.1
水 补足 补足 补足
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.4℃，搅拌速度104r/min，进气流量86L/min，罐压38Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养6.5h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.4℃，搅拌速度86r/min，进气流量112L/min，罐压38Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养6.5h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.4℃，搅拌速度84r/min，进气流量126L/min，罐压38Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见下表。
表10发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例13 237±5 7.3±0.14
实施例14 215±14 7.2±0.21
实施例15 236±10 7.2±0.07
实施例16～18发酵培养基及发酵培养方法
本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
表11发酵培养基成分
组分 实施例16培养基 实施例17培养基 实施例18培养基
蛋白胨/g/L 20 10 20
葡萄糖/g/L 30 30 10
酵母粉/g/L 1 2 3
氯化钠/g/L 4 4 4
枸橼酸钠/g/L 0.3 0.5 0.5
尿素/g/L 6 2 4
维生素液/mL/L 10 20 10
Na<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>/g/L 5 5 5
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>/g/L 1.6 1.6 1.6
MgSO<sub>4</sub>/g/L 0.3 0.3 0.5
水 补足 补足 补足
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.5℃，搅拌速度100r/min，进气流量90L/min，罐压30Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养7h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.5℃，搅拌速度80r/min，进气流量120L/min，罐压30Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，培养7h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37.5℃，搅拌速度80r/min，进气流量136L/min，罐压30Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见下表。
表12发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例16 229±6 7.1±0.08
实施例17 238±8 7.2±0.11
实施例18 225±10 7.2±0.09
实施例19发酵培养基及发酵培养方法
本实施例与实施例1的发酵培养基一致，发酵工艺基本一致，唯一不同的是在发酵菌液的制备过程中(包括一级发酵和二级发酵)未补充碳源。
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度120r/min，进气流量70L/min，罐压70Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度110r/min，进气流量80L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度100r/min，进气流量90L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见表13。
表13发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
实施例19 196±15 7.2±0.11
可见，在发酵培养过程中进行补料与不进行补料相比，可显著提高活菌数。
对比例1采用传统PYG培养基发酵工艺
采用传统PYG培养基对绿脓杆菌进行发酵培养，传统PYG培养基成份：蛋白胨2％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，酵母粉0.3％，用去离子水配制，配完调pH值7.2～7.4，116℃30min。
发酵生产工艺流程如下：
一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释，分别接种PYG琼脂培养基，37℃培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37℃培养24小时，作为一级种子。2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
二级种子制备：取一级种子接种若干支5mL PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，再按3％比例接种较大量的PYG液体培养基中，37℃振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为二级种子，置2～8℃保存，保存应不超过4日。
发酵种子液的制备：将二级种子液按传统PYG培养基体积的2％比例接种于装有50～60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度120r/min，进气流量70L/min，罐压70Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存不超过4天，传代不超过3代。
发酵菌液的制备：
一级发酵：将发酵种子液按传统PYG培养基体积的3％比例接种于装有250～300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度110r/min，进气流量80L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
二级发酵：将发酵的二级种子液按传统PYG培养基体积的4％比例接种于装有500L～600L培养基的1000L发酵罐，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐温37℃，搅拌速度100r/min，进气流量90L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌数及pH值见表14。
表14发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较(发酵12h)
实施例 菌数(×10<sup>8</sup>cfu/mL) pH
对比例1 159±15 5.6±0.14
可见，与传统PYG培养基相比，采用本发明实施例1～19提供的发酵培养基对绿脓杆菌进行发酵，发酵pH值稳定，可显著提高活菌数(见图1、图2)。
结论：
试验结果表明实施例1培养基组成为发酵液中最佳组合，其中各组分浓度为蛋白胨3％，葡萄糖2％，酵母粉0.3％，氯化钠0.5％，Na2HPO42.5g/L，KH2PO40.83g/L，MgSO40.3g/L，枸橼酸钠0.3g/L，尿素2g/L，维生素液10mL/L，该浓度组合培养出的菌数最高，为253×108CFU/mL，pH值稳定在7.2，其余组合的菌数为(215～242)×108CFU/mL，pH值在6.8～7.3之间，菌数与实施例1最高组比差异显著(P&lt;0.05)。
同时，测定了改良培养基在发酵培养过程中补料与否和原有传统培养基培养菌12h内的生长曲线及pH值曲线(见图2)，结果表明，改良培养基不补料的情况下对数生长期为4～9h，稳定期为9～12h，菌数稳定在196～200亿；改良培养基补料情况下菌体的对数生长期为4～10h，稳定期为10～12h，菌数稳定在240～250亿，pH值在培养的1～12h内均稳定在7.0左右；原有传统培养基对数生长期为4～8h，8～12h菌数为140～150亿；pH值从7h开始下降，至12h下降到5.6。可见，与原有传统培养基相比，本发明提供的改良培养基明显将对数生长期由4～8h延长至4～10h，菌数由140～159亿提高至240～250亿，pH值稳定在7.0，大大提高了绿脓杆菌的产量。
实施例20疫苗生产工艺流程
疫苗脱毒：采用0.5％的甲醛溶液对实施例1～19中任一实施例获得的绿脓杆菌进行脱毒37℃24h；
疫苗检验：通过成品检验合格后的疫苗即可入库。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种绿脓杆菌发酵培养基，其特征在于，其有效成分由蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、枸橼酸钠、尿素和复合维生素B组成；
以重量份计，所述培养基中各组分用量为：
蛋白胨10～30份，葡萄糖10～30份，酵母粉1～3份，氯化钠4～6份，Na2HPO4 1～5份，KH2PO4 0.4～1.6份，MgSO4 0.1～0.5份，枸橼酸钠0.1～0.5份，尿素2～6份，复合维生素B0.0002～0.0004份；
所述复合维生素B为生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇和尼古丁酸的混合物；所述生物素、所述叶酸、所述核黄素、所述肌醇、所述盐酸吡哆醇与所述尼古丁酸的质量比为(10～20)：(1～5)：(150～200)：(1000～1200)：(400～500)：(400～500)；
所述培养基的pH值为7.0～7.2。
2.一种绿脓杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
一级种子制备：取绿脓杆菌冻干菌接种于琼脂培养基，36～37℃培养18～24h，挑菌落接种于斜面培养基，36～37℃培养18～24h，获得一级种子；
二级种子制备：取所述一级种子接种于液体培养基，36～37℃培养12h，然后再接种于液体培养基，36～37℃培养12h，获得二级种子；
发酵种子液制备：将所述二级种子接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度100～120r/min、进气流量70～90L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养7h，获得发酵种子液；
一级发酵：取所述发酵种子液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～110r/min、进气流量80～120L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得一级发酵液；
二级发酵：取所述一级发酵液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～100r/min、进气流量90～136L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得二级发酵液；
所述发酵培养基为权利要求1所述绿脓杆菌发酵培养基。
3.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述一级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素，所述二级发酵培养至6～7h补加葡萄糖和尿素。
4.根据权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，所述一级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤，所述二级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的发酵培养方法，其特征在于，所述发酵种子液制备中二级种子的接种体积百分含量为2％，所述一级发酵中发酵种子液的接种体积百分含量为3％，所述二级发酵中一级发酵液的接种体积百分含量为4％。
6.一种水貂出血性肺炎疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一级种子制备：取绿脓杆菌冻干菌接种于琼脂培养基，36～37℃培养18～24h，挑菌落接种于斜面培养基，36～37℃培养18～24h，获得一级种子；
二级种子制备：取所述一级种子接种于液体培养基，36～37℃培养12h，然后再接种于液体培养基，36～37℃培养12h，获得二级种子；
发酵种子液制备：将所述二级种子接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度100～120r/min、进气流量70～90L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养7h，获得发酵种子液；
一级发酵：取所述发酵种子液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～110r/min、进气流量80～120L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得一级发酵液；
二级发酵：取所述一级发酵液接种于发酵培养基，在温度37～37.5℃、搅拌速度80～100r/min、进气流量90～136L/min、压力30～70Kpa条件下发酵培养12h，获得二级发酵液；
疫苗脱毒：取所述二级发酵液脱毒，获得水貂出血性肺炎疫苗；
所述发酵培养基为权利要求1所述绿脓杆菌发酵培养基。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108220168A (zh) * 2016-12-14 2018-06-29 康盛时代（北京）生物技术有限公司 一种培养基及其应用
CN108441457B (zh) * 2018-06-20 2021-04-13 中国农业科学院特产研究所 一种水貂源d型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB914464A (en) * 1960-10-19 1963-01-02 Tanabe Seiyaku Co The production of isoleucine by fermentation
CN101406697A (zh) * 2008-11-21 2009-04-15 黑龙江省科学院微生物研究所 一种绿脓杆菌疫苗及其制备方法
CN102286391A (zh) * 2010-06-21 2011-12-21 中国农业科学院特产研究所 水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法
CN103304040A (zh) * 2013-05-23 2013-09-18 东北电力大学 一种利用碳纤维毡固定化铜绿假单胞菌处理含氮废水的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB914464A (en) * 1960-10-19 1963-01-02 Tanabe Seiyaku Co The production of isoleucine by fermentation
CN101406697A (zh) * 2008-11-21 2009-04-15 黑龙江省科学院微生物研究所 一种绿脓杆菌疫苗及其制备方法
CN102286391A (zh) * 2010-06-21 2011-12-21 中国农业科学院特产研究所 水貂出血性肺炎二价灭活疫苗及其制备方法
CN103304040A (zh) * 2013-05-23 2013-09-18 东北电力大学 一种利用碳纤维毡固定化铜绿假单胞菌处理含氮废水的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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关于分离鉴定铜绿假单胞菌的培养基研究;齐佐臣等;《哈尔滨医药》;19901231;第10卷;第32-34页 *

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