CN108441457B - 一种水貂源d型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法 - Google Patents

一种水貂源d型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法 Download PDF

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Abstract

一种水貂源D型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法，属于疫苗制备技术领域。针对目前缺少预防水貂假单胞菌肺炎的特定血清型疫苗的问题，本发明提供了一种水貂源D型绿脓杆菌LN17‑D株，其保藏编号为CGMCC NO.15426；所述水貂源D型绿脓杆菌LN17‑D经培养后灭活，然后加入铝胶佐剂可制备水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗。本发明适用于水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的生产。

Description

一种水貂源D型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫 苗的制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种水貂源D型绿脓杆菌及其应用、其灭活疫苗以及该灭活疫苗的制备方法。
背景技术
水貂假单胞菌肺炎又名水貂出血性肺炎，是主要发生在每年9-11月份水貂换毛季节的急性传染病，具有发病急，出血性肺炎、死前呼吸困难，鼻孔流出鲜红血液，剖检可见肺部弥漫性出血，败血症，一旦发病，可造成10％～50％的死亡率，是危害水貂养殖的重要细菌性传染病。假单胞菌即绿脓杆菌是引起水貂出血性肺炎的病原，因其包含多种血清型，同时各型间交叉保护的效果不好，同时，该病发病急，抗生素治疗往往来不及，因此，开发针对某一特定血清型的疫苗是预防该病的有效手段。
发明内容
针对目前缺少预防水貂假单胞菌肺炎的特定血清型疫苗的问题，本发明提供了一种水貂源D型绿脓杆菌，所述水貂源D型绿脓杆菌为水貂源D型绿脓杆菌LN17-D，其保藏编号为CGMCC NO.15426。
本发明还提供了一种水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗，所述灭活疫苗含有灭活后的水貂源D型绿脓杆菌LN17-D。
所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)绿脓杆菌LN17-D菌株种子批制备：将绿脓杆菌LN17-D菌种F8代，接种于PYG琼脂培养基中，经培养获得F9代，将F9代接种于PYG琼脂斜面培养基，经培养获得一级种子，即F10代，取一级种子接种于PYG液体培养基中，经培养获得F11代，将F11代接种于PYG液体培养基中，经培养获得二级种子液；
2)制苗用菌液的制备：将步骤1)获得的二级种子液接种于PYG液体培养基中获得绿脓杆菌LN17-D制苗菌液；
3)菌液灭活：向步骤2)获得的绿脓杆菌LN17-D制苗菌液中加入甲醛溶液将菌株灭活；
4)疫苗的配制：向菌液中加入氢氧化铝胶、硫柳汞混合后制备获得水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗。
优选地，步骤1)中所述获得F9代的培养条件为36～37℃培养18～24小时；获得一级种子的培养条件为36～37℃培养18～24小时；获得F11代的培养条件为36～37℃，180r/min振摇12小时；所述F11代按照3％的体积比接种于PYG液体培养基，37℃180r/min振摇12小时，获得二级种子。
优选地，步骤2)所述的二级种子液以5％的体积比例接种于PYG液体培养基中，37℃通气培养12小时，获得制苗菌液。
优选地，步骤3)所述的灭活是指向绿脓杆菌LN17-D株的菌液总量中加入菌液体积总量0.18％的甲醛溶液，37℃下搅拌灭活24小时，所述甲醛溶液为35％～40％的甲醛水溶液。
优选地，步骤4)所述氢氧化铝胶在灭活疫苗中的终浓度为5％质量含量，硫柳汞在灭活疫苗中的终浓度为0.005％质量含量。
本发明提供了所述水貂源D型绿脓杆菌LN17-D在制备水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗中的应用，是将水貂源D型绿脓杆菌LN17-D经培养后灭活，然后加入铝胶佐剂制备水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗。
有益效果
本发明制备的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗对免疫动物具有良好的安全性，免疫后可产生理想的针对D型绿脓杆菌的免疫效果，因此，本发明在防治水貂绿脓杆菌肺炎领域将具有广阔的应用前景。
具体实施方式
本发明利用多只发病死亡的水貂肺部中分离出8株水貂绿脓杆菌D型菌株，对8株菌株进行筛选，得到致病力较好的3株菌株，进一步进行免疫原性和稳定性筛选，得到一株致病力强、免疫原性好、稳定性高的绿脓杆菌血清型D型LN17-D株，将分离的LN17-D株提交专利认可的机构进行保藏。
本发明所述的毒株水貂源D型绿脓杆菌LN17-D(绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.15426。
下述实施例所使用的PYG液体培养基：蛋白胨2.5％，葡萄糖1.5％，氯化钠0.5％，酵母粉0.35％，所述各成分浓度为质量分数，用纯化水配制，调整为pH值7.2～7.4，116℃灭菌30分钟。
PYG固体培养基是指向每升PYG液体培养基中添加20g琼脂制备而成。
实施例1.水貂源D型绿脓杆菌LN17-D的分离与鉴定
一、细菌的分离与鉴定
无菌采集疑似患有水貂出血性肺炎的水貂病例的肺脏，接种PYG琼脂平板，37℃培养18h，挑取疑似菌落划线接种绿脓菌素测定用培养基，37℃培养24h，可见培养基颜色变绿。挑取阳性菌落，接种PYG液体培养基，37℃过液培养，培养18-24h收获，记为F1代。对收获的菌液进行生化鉴定,结果均为阳性菌株，对阳性菌株采用日本生研株式会社分型血清进行分型，结果显示，分出8株D型绿脓杆菌。
二、菌株的筛选
1).通过清洁级昆明小鼠攻毒试验确定强毒力菌株：将上述获得的8株菌株接种在PYG液体培养基中，37℃振摇培养12小时，进行细菌计数后将菌数调整到50亿CFU/ml，将菌液分别进行1:10、1:100、1:1000稀释，即每1ml菌量分别为5亿CFU、5000万CFU和500万CFU；分别用三个浓度接种清洁级昆明小鼠，每株菌每个浓度接种5只清洁级昆明小鼠，每只小鼠皮下接种0.2ml，接种后观察7日。
菌株对清洁级昆明小鼠半数致死量(LD50)：筛选的3株毒力较强的菌株分别纯化后接种于PYG液体培养基中，37℃培养12小时后进行菌落计数；将菌数均调整为50亿CFU/ml，每株菌纯培养物分别进行1:10、1:100、1:1000、1:10000稀释后，分别皮下注射清洁级昆明小鼠，每组试验接种8只清洁级昆明小鼠，每只接种0.2ml，连续观察7日。
强毒力菌株的筛选结果：1∶100稀释致小鼠48小时内半数以上死亡，1∶10稀释致小鼠48小时全部死亡的菌株共3株，将3株毒力较强的菌株作为备选疫苗株和攻毒用强毒株。
对3株备选毒株进行清洁级昆明小鼠攻毒试验，测定绿脓杆菌强毒力菌株对清洁级昆明小鼠的LD50。结果如下表1所述：
表1清洁级昆明小鼠攻毒试验结果
Figure BDA0001701068150000031
2)3株菌株传代稳定性试验：
将3株绿脓杆菌绿脓杆菌进行连续传代，共传20代，取F2，F4，F6，F8，F10、F12、F14、F16、F18、F20代进行活菌计数及细菌形态观察，结果如下表2：(单位：108CFU/ml)
表2绿脓杆菌进行连续传代培养后的活菌计数(单位：108CFU/ml)
Figure BDA0001701068150000041
菌株编号为1和2的菌株较稳定。菌株编号为2的菌株更稳定
3)3株菌株免疫原性试验：
将3株菌株的F2代菌液调整菌数至6.0×108CFU/ml，按菌液总体积的0.18％加入甲醛溶液，所述甲醛水溶液中甲醛质量含量为35％～37％，37℃灭活24小时，取灭活后的菌液按照6:1的质量比例加入氢氧化铝胶混匀制成疫苗。
疫苗质量检验
将上述3株菌株制备的疫苗进行质量检验：
a性状：每批疫苗随机取5瓶，观察记录。
b无菌检验：每批疫苗随机取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行。
c安全检验：每批疫苗分别接种2～10月龄健康易感水貂5只，每只后肢内侧肌肉接种疫苗3ml，分3点注射，观察15日，记录精神、食欲、体温与粪便变化。
d甲醛残留量测定：按现行《中国兽药典》进行测定，甲醛残留量不超过0.20％。
上述各项检测结果如表3所示。
表3.疫苗品质检验
Figure BDA0001701068150000042
皮下接种小鼠10只，免疫21天后，连同对照小鼠用与免疫所用毒株相同毒株用10LD50剂量攻毒，连续观察7日。结果如下表4所示：
表4.3株菌株的灭活疫苗攻毒试验结果
Figure BDA0001701068150000043
Figure BDA0001701068150000051
根据攻毒试验、稳定性试验和免疫原性试验，选取菌株为02号菌株，将其命名为LN17-D株。
实施例2.水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备。
1)绿脓杆菌LN17-D菌株种子批制备：
a疫苗生产菌种：绿脓杆菌LN17-D株。
b检验强毒株：绿脓杆菌LN17-D株，其对水貂的LD50为180万CFU；对小白鼠的LD50为76万CFU。
c试验动物:2～12月龄健康易感水貂，16～18g昆明系小白鼠。
具体制备方法如下：
将绿脓杆菌LN17-D菌种F8代，用灭菌生理盐水适当稀释后，接种于PYG琼脂培养基中于36～37℃培养18～24小时，挑选5个以上典型菌落(即F9代)混合于少量PYG液体培养基中，接种于PYG琼脂斜面36～37℃培养18～24小时，作为一级种子(即F10代)，2～8℃保存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
取一级种子接种于若干支5ml PYG液体培养基中，36～37℃摇床180r/min振摇12小时(即F11代)，再按3％体积比例接种于较大量的PYG液体培养基中，37℃摇床180r/min振摇12小时，即为二级种子液(即F12代)，2～8℃保存，使用期不超过4日；按照该方法分别制备生产菌种种子批各三批，分别为F12-1、F12-2和F12-3。
种子纯粹检验：按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹。
活菌计数：按现行《中国兽药典》附录分别进行细菌计数，测定细菌含量。
2)制苗用菌液的制备：
a绿脓杆菌LN17-D株制苗用菌液的制备：取LN17-D株二级种子液以5％体积比例接种于装有PYG液体培养基的发酵罐中37℃通气培养12小时，即为制苗菌液。
按上述方法制备3批作为制苗菌液，分别为201701、201702、201703。
b制苗菌液的检验:
纯粹检验:取培养的各批菌液按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验。
对生产用LN17-D二级种子纯粹性检验合格，均无杂菌污染，菌种细菌数为85亿CFU/ml。
菌液活菌计数:取培养的各批菌液分别进行细菌菌落计数，按现行《中国兽药典》附录进行，每1ml菌液活菌数应不低于60亿CFU。
c菌液处理:根据计数结果用无菌生理盐水将菌液菌数调整到细菌含量为60亿CFU/ml，并立即灭活。
3)菌液灭活:
选用甲醛作为绿脓杆菌疫苗灭活剂,按菌液总量的0.18％加入甲醛的水溶液，所述甲醛水溶液中甲醛质量含量为35％～37％，边加边搅拌，37℃下搅拌灭活24小时，进行灭活检验。半成品检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。
表5.制苗菌液检验
Figure BDA0001701068150000061
4)疫苗的配制:
将检验合格的菌液加入氢氧化铝胶，使氢氧化铝胶的终浓度达到5％，并按总质量0.005％加入硫柳汞，充分混匀。
分装：无菌检验合格后充分混合后定量分装，分装时随时搅拌，2～8℃贮存。
对上述制备的疫苗进行检验：
一、成品品质检验
a性状：每批疫苗随机取3瓶，观察记录。
b无菌检验：每批疫苗随机取5瓶，按现行《中国兽药典》附录进行。
c安全检验：每批疫苗分别接种2～10月龄健康易感水貂5只，每只后肢内侧肌肉接种疫苗3ml，分3点注射，观察15日，记录精神、食欲、体温与粪便变化。
d甲醛、硫柳汞残留量测定，按现行《中国兽药典》进行测定，甲醛残留量不超过0.20％，硫柳汞不超过0.01％。
上述各项检测结果如表6所示。
表6.疫苗成品指标检验
Figure BDA0001701068150000062
Figure BDA0001701068150000071
二、效力检验
每批疫苗用体重16～18g小白鼠20只(分2组，每组10只)，各皮下注射疫苗0.2ml，21日后连同饲养条件相同的对照小白鼠20只(分2组，每组10只)，分别皮下注射含10LD50的LN17-D的强毒液，观察7日，记录结果，如表7所示。
表7疫苗成品的效力试验结果
Figure BDA0001701068150000072
三、交叉保护性试验
挑取水貂源G型和水貂源B型强毒单菌落分别于PYG液体培养基中37℃振荡培养12小时，分别将培养的菌液计数后菌量调整为60亿CFU/ml，按菌液总体积的0.18％加入甲醛水溶液，所述甲醛水溶液中甲醛质量含量为35％～37％，37℃灭活24小时，将检验合格的菌液加入氢氧化铝胶，使氢氧化铝胶的终浓度达到5％，并按疫苗总质量的0.005％加入硫柳汞，硫柳汞起到防腐剂的作用，充分混匀，分别制成G型疫苗和B型疫苗。
按下表进行免疫和攻毒小鼠，每组10只，具体分组情况见表8，免疫剂量为每只小鼠0.2ml，免疫后21天进行攻毒，每只攻毒剂量10LD50，攻毒情况及结果如下表8所示，说明各血清型之间的交叉保护率为30％～50％。
表8各疫苗攻毒试验结果
Figure BDA0001701068150000073
Figure BDA0001701068150000081
其中SD05株和DL09株，分别于山东和辽宁发病水貂肺脏中分离获得，经血清型鉴定分别为铜绿假单胞菌G型铜绿假单胞菌和B型。
对LN17-D株进行免疫原性和毒力测定，毒力测定结果为：对清洁级昆明小鼠的LD50为7.6×105，对水貂的LD50为1.8×106；免疫原性测定表明：该菌株F3代制备灭活疫苗免疫水貂5只，免疫后21天进行攻毒，采用10LD50进行攻毒，免疫组5/5保护，对照组5/5发病，以上结果表达绿脓杆菌D型LN17-D株免疫原性良好。
将LN17-D株培养后灭活，加入铝胶佐剂，制备成灭活疫苗，所述制备方法参照步骤3)、4)所述。用该疫苗对水貂进行单剂量重复(对水貂进行两次接种，每次接种1ml/只，两次接种间隔15天)和超剂量(对水貂进行接种，每次5ml/只)安全试验，结果表明，全身和局部无不良反应，无不良反应，同时对该疫苗进行效力检验，效力检验结果表明免疫组保护率均为5/5，对照组5/5发病。6个月的免疫保护率仍为80％。

Claims (9)

1.一种水貂源D型铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）LN17-D ，其保藏编号为CGMCC NO.15426。
2.一种水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗，其特征在于，所述灭活疫苗含有灭活后的权利要求1所述的水貂源D型铜绿假单胞菌LN17-D。
3.权利要求2所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）铜绿假单胞菌LN17-D菌株种子批制备：将铜绿假单胞菌LN17-D菌种F8代，接种于PYG琼脂培养基中，经培养获得F9代，将F9 代接种于PYG琼脂斜面培养基，经培养获得一级种子，即F10代，取一级种子接种于PYG液体培养基中，经培养获得F11代，将F11代接种于PYG液体培养基中，经培养获得二级种子液；
2）制苗用菌液的制备：将步骤1)获得的二级种子液接种于PYG液体培养基中获得铜绿假单胞菌LN17-D制苗菌液；
3）菌液灭活：向步骤2）获得的铜绿假单胞菌LN17-D制苗菌液中加入甲醛溶液将菌株灭活；
4）疫苗的配制：向菌液中加入氢氧化铝胶、硫柳汞混合后制备获得水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述获得F9代的培养条件为36～37℃培养18～24小时；获得一级种子的培养条件为36～37℃培养18～24小时；获得F11代的培养条件为36～37℃，180r/min振摇12小时；所述F11代按照3%的体积比接种于PYG液体培养基，37℃ 180r/min振摇12小时，获得二级种子。
5.根据权利要求3所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2）所述的二级种子液以5%的体积比例接种于PYG液体培养基中，37℃通气培养12小时，获得制苗菌液。
6.根据权利要求3所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3）所述的灭活是指向铜绿假单胞菌LN17-D株的菌液总量中加入菌液体积总量0.18%的甲醛溶液，37℃下搅拌灭活24小时，所述甲醛溶液为质量分数为35%～40%的甲醛水溶液。
7.根据权利要求3所述的水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4）所述氢氧化铝胶在灭活疫苗中的终浓度为5%质量含量，硫柳汞在灭活疫苗中的终浓度为0.005%质量含量。
8.权利要求1所述的水貂源D型铜绿假单胞菌LN17-D在制备水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是将水貂源D型铜绿假单胞菌LN17-D经培养后灭活，然后加入铝胶佐剂制备水貂源D型绿脓杆菌灭活疫苗。
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