CN104271153A - Pcv/猪肺炎支原体/prrs组合疫苗 - Google Patents
Pcv/猪肺炎支原体/prrs组合疫苗 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104271153A CN104271153A CN201380023653.5A CN201380023653A CN104271153A CN 104271153 A CN104271153 A CN 104271153A CN 201380023653 A CN201380023653 A CN 201380023653A CN 104271153 A CN104271153 A CN 104271153A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hyo
- antigen
- pcv2
- compositions
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0208—Specific bacteria not otherwise provided for
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0241—Mollicutes, e.g. Mycoplasma, Erysipelothrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/30—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycoplasmatales, e.g. Pleuropneumonia-like organisms [PPLO]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/10011—Arteriviridae
- C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本发明提供三价免疫原性组合物,其包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分;猪圆环病毒2型(PCV2)抗原;和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原,其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
Description
发明领域
本发明涉及猪圆环病毒、猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae(M.hyopneumoniae或M.hyo))和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒。更具体地,本发明涉及三价免疫原性组合物,其包含M.hyo全细胞制备物的可溶性部分、PCV2抗原和PRRS病毒抗原,以及所述组合物在用于保护猪抵抗地方性动物病肺炎和断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的疫苗中的应用。
发明背景
猪中的地方性动物病肺炎,也被称为支原体肺炎,是由M.hyo引起的。该疾病是一种慢性的、非致命性的疾病,影响各种年龄的猪。受感染的猪仅仅表现出咳嗽和发烧的轻微症状,但是这种疾病对经济有重要的影响,因为饲料转化效率降低并且体重增长减少。地方性动物病肺炎由受感染猪的肺排出的空气传播微生物通过鼻道在猪之间传播。M.hyo的初次感染可能跟随着其它支原体物种(猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)和絮状支原体(Mycoplasma flocculare))以及其它细菌病原体的继发感染。
M.hyo是小的原核微生物,能够自由生活地存在,虽然它经常被发现与真核细胞相联系,因为它对外源甾醇和脂肪酸有绝对需求。这些需求通常需要在含血清的培养基中生长。M.hyo由细胞膜而不是细胞壁包被。
支原体和宿主细胞表面的物理结合是地方性动物病肺炎发生和持续存在的基础。M.hyo感染猪的呼吸道,在气管、支气管、细支气管建群。支原体产生纤毛停滞因子,其导致呼吸道内侧的纤毛停止运动。最终纤毛退化,使猪易于受到次级病原体的感染。在感染动物中观察到紫色到灰色的实变区域的典型病灶。对屠宰动物的调查揭示在30-80%的猪中存在病灶。来自13个州的37个畜群的结果表明99%的畜群有符合地方性动物病肺炎典型特征的肺炎病灶。因此,对有效预防和治疗措施的需求很大。
抗生素如硫姆林、甲氧苄氨嘧啶、四环素和林可霉素有一些益处,但是价格昂贵并且需要长期使用。此外,抗生素尚未被证明有效消除M.hyo的传播或二次感染。通过维持无病原体畜群来预防有时是可行的,但是经常发生M.hyo的再次引入。由于猪肺炎的严重的经济后果,已经在寻找针对M.hyo的疫苗。含有在含血清培养基中生长的支原体生物体制备物的疫苗已进入市场,但是引起了对于免疫物质中存在的血清组分(例如免疫复合物或非免疫原性特异性蛋白)诱导的副反应的关注。提供M.hyo疫苗的其它尝试已有成功者,但是这种疾病仍然广泛流行。
M.hyo和猪圆环病毒2型(PCV2)是猪产业中遇到的两种最为普遍的病原体。被PCV2感染的猪表现出通常被称为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的综合征。PMWS的临床特征是衰弱、皮肤苍白、瘦弱、呼吸窘迫、腹泻、黄疸(icterus)和黄疸(jaundice)。除了PMWS之外,PCV2与几种其它的感染包括假狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、格雷舍氏病(Glasser’s disease)、链球菌脑膜炎、沙门氏菌病、断奶后大肠杆菌病、饮食肝病和化脓性支气管肺炎相关。M.hyo与地方性动物病肺炎相关,而且已被显示是猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的发生中的主要辅因子。
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)由动脉炎病毒引起,该病毒与巨噬细胞,特别是存在于肺中的巨噬细胞(肺泡巨噬细胞)有特别的亲和力。这些巨噬细胞摄取并除去入侵的细菌和病毒,但在PRRS病毒(PRRSV)的情况中并非如此。在PRRS病毒的情况中,它在巨噬细胞内部繁殖,产生更多的病毒并杀死巨噬细胞。一旦PRRSV进入畜群,它便会无限期地存在并有活性。高达40%的巨噬细胞被破坏,这使得细菌和其它病毒增殖并进行破坏。这种事件的一个常见的实例是在幼年/老年团体(grower/finisher units)中,当它们受到PRRS病毒感染时,地方性动物病肺炎的严重程度显著增加。超过一半的断奶期PRRS病毒阴性的猪在进入市场之前被感染。
所需要的是针对猪中PCV2、支原体和PRRSV感染的PCV2/M.hyo/PRRS三价疫苗。提供单次剂量(single dose)的三价疫苗将会是合乎需要的。优选地,疫苗的PCV2/M.hyo组分以即用型单瓶液体组合物的形式提供,其可以容易地与PRRSV组分组合以使得所有抗原被同时给药给猪。
发明简述
本发明提供三价免疫原性组合物,其包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分;猪圆环病毒2型(PCV2)抗原;和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原,其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。在一个方面,M.hyo全细胞制备物的可溶性部分在被加入到免疫原性组合物之前已用蛋白-A或蛋白-G进行处理。在另一个方面,M.hyo制备物的可溶性部分和PCV2抗原是即用型液体组合物的形式。
在一个实施方案中,PRRS病毒抗原是基因修饰的活病毒。在另一个实施方案中,基因修饰的活PRRS病毒是冻干组合物的形式。
在一个实施方案中,M.hyo制备物的可溶性部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。在另一个实施方案中,M.hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种M.hyo蛋白抗原。
在一个实施方案中,PCV2抗原是嵌合1型-2型圆环病毒的形式,嵌合病毒包含灭活的表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。在另一个实施方案中,PCV2抗原是重组ORF2蛋白的形式。在又一个实施方案中,重组ORF2蛋白从杆状病毒载体表达。
在一些实施方案中,本发明的三价组合物引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。在其它实施方案中,本发明的免疫原性组合物进一步包含至少一种其它抗原。在一个实施方案中,至少一种其它抗原针对在猪中可能引起疾病的微生物提供保护。
在一个实施方案中、微生物包括细菌、病毒或原生动物。在另一个实施方案中,微生物选自但不限于下列种类:猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、猪葡萄球菌(Staphylococcushyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、猪鼻支原体(Mycoplama hyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒、细环病毒(TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病、典型性猪瘟(CSF)的致病原和猪传染性肠胃炎的致病原,或其组合。
在一些实施方案中,本发明的组合物进一步包含佐剂。在一个实施方案中,佐剂选自但不限于下列种类:水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。在另一个实施方案中,本发明的组合物进一步包含药学可接受的载体。
在特定的实施方案中,本发明的组合物当以单次剂量给药的形式进行给药时,引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。
本发明还提供免疫猪以抵抗M.hyo,PCV2和PRRS病毒的方法。该方法包括给猪施用包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶部分;猪圆环病毒2型(PCV2)抗原;和PRRS病毒抗原的三价免疫原性组合物,其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
在本发明方法的一个实施方案中,三价组合物被肌内、皮内、经皮或皮下给药。在本发明方法的另一个实施方案中,三价组合物以单次剂量的形式给药。
在进一步的实施方案中,组合物被给药给具有来自母体的针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的至少一种的抗体的猪。在又一个实施方案中,组合物被给药给具有来自母体的针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的抗体的猪。
在一个实施方案中,组合物被给药给3周龄或更大的猪。
本发明还提供制备根据本发明的免疫原性组合物的方法。该方法包括i)在合适的培养基中培养M.hyo 18-144小时的时间;ii)随后灭活M.hyo培养物;iii)收获灭活的培养液,其中灭活的培养液包含M.hyo全细胞制备物,所述全细胞制备物包含可溶性液体级分和不可溶细胞物质;iv)从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分;v)从分离的可溶性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物,以形成M.hyo全细胞制备物的可溶性级分;以及vi)随后将M.hyo全细胞制备物的可溶性部分与PCV2抗原和PRRS病毒抗原组合。在一个实施方案中,步骤vi)包括将包含PCV2抗原和M.hyo可溶性部分的即用型液体组合物与冻干的PRRS病毒抗原组合。
在一个实施方案中,根据本发明的试剂盒包括第一瓶(或其它合适的容器),其包含组合物,所述组合物包含PCV2抗原和猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分,其中M.hyo全细胞制备物的可溶性部分基本不含(i)IgG和(ii)抗原/免疫球蛋白免疫复合物;和第二瓶,其包含PRRS病毒抗原。在一个实施方案中,第一瓶中的组合物以即用型液体组合物的形式提供。在另一个实施方案中,试剂盒中的PRRS病毒抗原组分以冻干组合物的形式提供。在另一个实施方案中,试剂盒包括提供关于将第一瓶的内容物与第二瓶的内容物组合的说明的使用说明书。在又一个实施方案中,使用说明书进一步包括将组合的第一和第二瓶的内容物给药给猪的说明。
附图简述
图1是显示用进行不同处理的M.hyo抗原制备的M.hyo单价疫苗(实施例3中描述的T02-T10)相对于安慰剂(T01)的效力的图。结果表示为%肺损伤最小平方平均值(%Lung Lesion Least Square Meanvalues)。
图2是显示与灭活的PCV 1型-2型嵌合病毒组合的M.hyo疫苗的PCV2抗原功效结果(PCV2抗原ELISA)的图。组合物中包含的嵌合病毒的初始水平是大约1.6≤RP。每个样品的结果表示为相对功效(RP)。
图3是显示用使用不同佐剂平台的PCV/M.hyo疫苗制剂观察到的PCV2病毒血症结果(PCV2定量PCR)的图。
图4是显示在攻毒第1、20和42天,用使用不同佐剂平台的PCV/M.hyo疫苗制剂观察到的PCV2抗体ELISA(S/P)血清学结果的图。
图5是显示实施例7中所述的T02-T04处理相对于安慰剂(T01)获得的PCV2粪便脱落的图。结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。
图6是显示实施例7中所述的T02-T04处理相对于安慰剂(T01)获得的PCV2鼻脱落的图。结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。
图7(A&B)是显示测定PCV2-特异性细胞介导免疫(CMI)应答的干扰素-γ(IFN-γ)检测结果的图。接种后/攻毒前的结果显示于图7A,接种后/攻毒后的结果显示于图7B。5x 106个细胞的刺激被认为是显著的。
图8显示SP-油中的PCV2/M.hyo试验性疫苗制剂的M.hyo效力。使用M.hyo处理T02-T08的制剂相对于安慰剂(T01)的肺部评分以图显示在图8A中。图8B中的表显示了处理T02-T08与安慰剂的对比。
图9是显示用于制备PCV2-相容的蛋白-A处理的M.hyo抗原的制造过程的一个实施方案的流程图。
图10是显示针对PRRS病毒的杀病毒活性的佐剂评价的表。
图11是显示用PCV2/M.hyo/PRRS试验性疫苗制剂观察到的PCV2病毒血症结果(PCV2定量PCR)的图。
图12是显示在研究的第1、7、13、20、28、35和42天(攻毒是第21天),用PCV2/M.hyo/PRRS试验性疫苗制剂观察到的PCV2ELISA结果的图。
图13是显示用实施例14中描述的T02和T03处理(PCV2/M.hyo/PRRS试验性疫苗制剂)相对于安慰剂(T01)获得的PCV2粪便脱落的图。
序列简述
SEQ ID NO:1是编码来自M.hyo的P-5722株的p46的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:2是来自M.hyo的P-5722株的p46的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:3是编码来自M.hyo的P-5722株的p97的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:4是来自M.hyo的P-5722株的p97的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:5是编码嵌合PCV1-2病毒的基因组序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:6是相应于猪圆环病毒ORF2的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:7是相应于猪圆环病毒ORF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:8是编码嵌合PCV1-2病毒的基因组序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:9是相应于猪圆环病毒ORF2的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:10是相应于猪圆环病毒ORF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:11是相应于猪圆环病毒ORF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:12是编码SEQ ID NO:11的氨基酸序列的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:13是相应于猪圆环病毒ORF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:14是编码SEQ ID NO:13的氨基酸序列的核苷酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:15是相应于猪圆环病毒ORF2多肽的氨基酸序列的一个实施方案;
SEQ ID NO:16是被称为P129的北美PRRS病毒分离物的非-强毒性形式的基因组序列的一个实施方案;以及
SEQ ID NO:17是相应于被称为ISU-55的PRRS病毒分离物的ORF2至ORF5的核苷酸序列的一个实施方案。
SEQ ID NO:18是相应于被称为ISU-55的PRRS病毒分离物的ORF6和ORF7的核苷酸序列的一个实施方案。
发明详述
本发明提供三价免疫原性组合物,其包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分;猪圆环病毒2型(PCV2)抗原;和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原,其中M.hyo制备物的可溶部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。在一个实施方案中,三价组合物在猪中引发针对PCV2、M.hyo和PRRS病毒的保护性免疫反应。
申请人令人惊讶地发现M.hyo全细胞培养物的不可溶级分是无免疫原性的。相反,不含IgG的M.hyo可溶性制备物是有免疫原性的,并能有效与来自其它病原体,如PCV2和PRRSV的抗原组合,而在抗原之间没有分析干扰或免疫干扰。这使得M.hyo可溶性制备物成为本发明的多价疫苗的有效平台。申请人还令人惊讶地发现从M.hyo制备物除去免疫球蛋白和不可溶细胞碎片增强了免疫原性组合物的安全性。
如说明书和权利要求书中所使用的,单数形式“一个”,“一种”和“该”包括复数引用,除非上下文另外明确规定。例如,术语“一个蛋白抗原”包括多个蛋白抗原,包括其混合物。
如本文所使用的,术语“包含”是指组合物和方法包括所述及的要素,但不排除其它要素。
如本文所定义的,M.hyo全细胞培养物的可溶性部分指在分离了不可溶物质并基本上去除了IgG和抗原结合的免疫复合物之后的M.hyo全细胞培养物的可溶性液体级分。M.hyo可溶性部分在文本中还可以被称为上清级分、培养物上清等等。它包含已从不可溶蛋白、全细菌和其它不可溶M.hyo细胞物质通过传统方法(如离心、过滤或沉淀)分离的M.hyo-表达的可溶性蛋白(M.hyo蛋白抗原)。除了包含M.hyo-特异的可溶性蛋白,M.hyo全细胞培养物的可溶性部分还包含异源蛋白,例如那些M.hyo发酵使用的培养基中含有的异源蛋白。
术语“抗原”指能在动物中刺激产生抗体或T-细胞应答,或二者的化合物、组合物、或免疫原性物质,包括给动物注射或被动物吸收的组合物。免疫反应可以针对整个分子或者针对分子的一部分(例如表位或半抗原)产生。
如本文所定义的,“免疫原性组合物或免疫组合物”,指包含至少一种抗原的组合物,所述抗原在宿主中引发对感兴趣的组合物或疫苗发生细胞和/或抗体-介导的免疫应答而导致的免疫反应。
本文使用的术语“免疫反应”指在动物中引发的反应。免疫反应可以指细胞免疫(CMI);体液免疫或者可以包括二者。本发明还考虑限于免疫系统一部分的反应。通常,“免疫反应”包括,但不限于,下述效果的一种或多种:特异性针对感兴趣的组合物或疫苗中所包含的一种或多种抗原的抗体,B细胞,辅助T细胞,抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的产生或激活。优选地,宿主将会显示出治疗性或保护性免疫反应,从而增强对新的感染的抗性和/或减轻疾病的临床严重程度。这种保护将通过受感染宿主通常表现出的症状的减少或消失,更快的恢复时间和/或受感染宿主中更低的病毒滴度来证明。
如本文所使用的,术语“免疫原性”指能够在宿主动物中产生针对一个或多个抗原的免疫反应。这种免疫反应构成由疫苗引发的针对特定的感染性生物体的保护性免疫的基础。
本文使用的“佐剂”指包含一种或多种增强对抗原免疫反应的物质的组合物。佐剂的作用机理还不完全清楚。认为一些佐剂通过缓慢释放抗原增强免疫反应,而其它佐剂自身具有强的免疫原性,并被认为是通过协同作用发挥功能。
如本文所使用的,术语“多价”指包含来自于同一个物种(即猪肺炎支原体的不同分离物)或是来自不同的物种(即来自溶血性巴斯德菌(Pasteurella hemolytica)和多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)二者的分离物)的超过一种抗原的疫苗,或者包含来自不同属的抗原的组合的疫苗(例如,包含来自多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)和梭菌(Clostridium)的抗原的疫苗)。
本文使用的术语“猪”或“小猪”指猪起源的动物,而“母猪”指处于生育年龄并具有生育能力的雌性。“小母猪”指从未怀孕的雌性猪。
本文所使用的术语“毒性的”指保留了其在动物宿主中感染能力的分离物。
“灭活疫苗”指包含不再能复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。病原体的来源可以是细菌、病毒、原生动物或真菌。灭活可以通过多种方法实现,包括冻融、化学处理(例如用硫柳汞或福尔马林处理)、超声、辐射、热或任何其它足以防止该生物体复制或生长但保留其免疫原性的惯用方法。
本文使用的术语“变体”指多肽或编码多肽的核酸序列,其具有一个或多个保守氨基酸的变化或其它微小的修饰,以使得相应的多肽与野生型多肽相比具有基本上相同的功能。
“保守变化”表示用另一个生物学相似的残基替换氨基酸残基,或者替换核酸序列中的核苷酸以使得编码的氨基酸残基不变或者是另一个生物学相似的残基。保守变化的实例包括将一个疏水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)取代为另一个疏水性残基,或者一个极性残基的取代,例如精氨酸取代为赖氨酸,谷氨酸取代为天冬氨酸,或谷氨酰胺取代为天冬酰胺,等等。术语“保守变化”还包括用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸,条件是用取代的多肽激发的抗体也能与未取代的多肽发生免疫反应。
本文所使用的术语“药学可接受的载体”和“药学可接受的媒介物”可以互换使用,指可以被注射到宿主中且没有副作用的包含疫苗抗原的液体媒介物。本领域已知的合适的药学可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖或缓冲液。载体可以包括助剂,包括但不限于稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH缓冲剂、粘度增强添加剂、染料等。
本文所使用的术语“疫苗组合物”包括在药学可接受媒介物中的至少一种抗原或免疫原,用于在宿主中诱导免疫反应。疫苗组合物可以剂量形式并通过医学或兽医领域技术人员公知的技术给药,并考虑这些因素:年龄,性别,体重,物种和受体动物的条件,以及给药方式。给药方式可以是经皮、经粘膜给药(例如口服、经鼻、经肛门、经阴道)或者通过肠胃外方式给药(皮内、经皮、肌内、皮下、静脉内或腹膜内)。疫苗组合物可以单独给药,或者可以与其它治疗或疗法共同给药或顺序给药。给药的形式可以包括混悬剂、糖浆剂或酏剂,以及用于肠胃外、皮下、皮内、肌内或静脉内给药(例如注射给药)的制备物,如无菌混悬液或乳液。疫苗组合物可以作为喷雾或混合在食物和/或水中给药,或者与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合给药。组合物可以包含辅助性物质例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、佐剂、胶凝及或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、染料等,这取决于给药方式和所希望的制备物。可以参考标准的药学文献,例如"Remington's Pharmaceutical Sciences,"1990制备合适的制备物,而无需过度的试验。
“北美PRRS病毒”指具有与北美PRRS病毒分离物相关的遗传特征的任何PRRS病毒,例如,但不限于1990年代早期左右在美国首次分离的PRRS病毒(参见,例如,Collins,J.E.,et al.,1992,J.Vet.Diagn.Invest.4:117-126);北美PRRS病毒分离物MN-1b(Kwang,J.et al.,1994,J.Vet.Diagn.Invest.6:293-296);PRRS病毒的魁北克LAF-exp91株(Mardassi,H.et al.,1995,Arch.Virol.140:1405-1418);和北美PRRS病毒分离物VR 2385(Meng,X.-J et al.,1994,J.Gen.Virol.75:1795-1801)。北美PRRS病毒株的其它实例在本文中描述。遗传特征指北美PRRS病毒株之间的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。中国PRRS病毒株通常与北美猪显示出大约80-93%的核苷酸序列相似性。
“欧洲PRRS病毒”指具有与1991年左右在欧洲首次分离的PRRS病毒相关的遗传特征的任何PRRS病毒株(参见,例如,Wensvoort,G.,et al.,1991,Vet.Q.13:121-130)。“欧洲PRRS病毒”在本领域中有时还指“莱利斯塔德病毒(Lelystad virus)”。欧洲PRRS病毒株的其它实例在本文中描述。
如果基因修饰的病毒比未修饰的亲本株毒性较小,则它是“减毒的”。如果毒株在确定疾病严重性的一个或多个参数上表现出统计学的显著降低,则该毒株为“毒性较小的”。这种参数可以包括病毒血症的水平,发热,呼吸窘迫的严重性,繁殖症状的严重性或肺损伤的数量或严重性等。
“感染性克隆”是病原体(例如病毒)的分离的或克隆的基因组,其能在实验室被特定地和有目的地改造,然后用于再生产活体的基因修饰的生物体。从感染性克隆产生的活体的基因修饰的生物体可以用在活体病毒疫苗中。或者,可以通过用灭活剂如福尔马林或疏水溶剂,酸等,通过紫外线或X-射线辐射,通过加热等处理来自感染性克隆的活病毒制备灭活的病毒疫苗。
所有目前可获得的M.hyo和M.hyo组合疫苗都是用灭活的全细胞支原体制备物(菌苗)制造的。相反,本发明使用猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分与PCV2和PRRSV抗原组合,其中M.hyo制备物的可溶部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
M.hyo对于外源甾醇和脂肪酸有绝对需求。这些需求通常需要在含血清的培养基,例如猪血清中生长M.hyo。从M.hyo全细胞制备物的可溶性蛋白分离不可溶物质(例如通过离心,过滤或沉淀)并不会去除猪IgG或免疫复合物。在本发明的一个实施方案中,用蛋白-A或蛋白-G处理M.hyo可溶性部分以基本上除去培养物上清中包含的IgG和免疫复合物。在该实施方案中,应当理解蛋白A处理发生在M.hyo发酵之后。在本文中这也可以被称为下游蛋白A处理。在另一个实施方案中,可以使用对生长培养基的上游蛋白A处理(即在M.hyo发酵之前)。蛋白A与IgG的Fc部分结合。蛋白G优先与IgG的Fc部分结合,但是也可以和Fab区域结合。从粗蛋白混合物,如组织培养物上清,血清和腹水中纯化/除去总IgG的方法是本领域已知的。
在一些实施方案中,M.hyo制备物的可溶性部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。在其它实施方案中,M.hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种M.hyo蛋白抗原。
在一个实施方案中,M.hyo上清级分包含一种或多种下述M.hyo特异性蛋白抗原:大约46kD(p46)、64kD(p64)和97kD(p97)分子量的M.hyo蛋白。在另一个实施方案中,上清级分至少包含p46、p64和p97M.hyo蛋白抗原。本文中大约64kD的M.hyo蛋白(p64)也可以被称为M.hyo的p65表面抗原,由Kim et al.[Infect.Immun.58(8):2637-2643(1990)]和美国专利No.5,788,962描述。
Futo et al.描述了M.hyo的46kD表面蛋白的克隆和表征,其可以用在本发明的组合物中[J.Bact 177:1915-1917(1995)]。在一个实施方案中,M.hyo培养物上清包含p46,它的来自P-5722株的相应的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。进一步考虑的是,这种p46的变体可以用在本发明的组合物中,如下文所述。
Zhang et al.描述了M.hyo的p97粘附素蛋白的表征[Infect.Immun.63:1013-1019,1995]。此外,King et al.描述了来自M.hyo的P-5722株的被称为Mhp1的124kD蛋白,并给出数据表明Mhp1和p97是同一个蛋白[Vaccine 15:25-35(1997)]。这种p97蛋白可以用在本发明的组合物中。在一个实施方案中,M.hyo培养物上清包括p97,它的来自P-5722株的相应的核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ IDNO:3和4所示。进一步考虑的是,这种p97的变体可以用在本发明的组合物中,如下文所述。
M.hyo培养物上清可以进一步包含M.hyo的特定蛋白抗原,例如但不限于大约41kD(p41)、42kD(p42)、89kD(p89)和65kD(p65)的蛋白。参见,Okada et al.,2000,J.Vet.Med.B 47:527-533和Kim et al.,1990,Infect.Immun.58(8):2637-2643。此外,M.hyo培养物上清可以包含大约102kD(p102)和216kD(p216)的M.hyo的特定蛋白抗原。参见Minnion et al的美国专利Nos.6,162,435和7,419,806。
可以使用任何M.hyo株作为起始材料产生本发明的组合物的M.hyo制备物的可溶性部分。合适的M.hyo株可以从商业来源或学术来源获得,包括保藏机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,Va.)和NRRL培养物保藏中心(Agricultural ResearchService,U.S.Department of Agriculture,Peoria,Ill.)。ATCC单独列出了下面六个M.hyo株用于出售:M.hyo ATCC 25095,M.hyo ATCC25617,M.hyo ATCC 25934,M.hyo ATCC 27714,M.hyo ATCC27715和M.hyo ATCC 25934D。用于本发明实施方案的优选的M.hyo株被认为是P-5722-3株,ATCC#55052,1990年5月30日按照美国专利商标局的要求的可获得性规则进行了保藏。考虑到疾病的广泛传播,还可以通过从受到在猪中引起支原体肺炎的已知株感染的猪的肺分泌物或组织回收M.hyo获得毒株。
本领域技术人员应当理解M.hyo序列的变体可以被用在本发明的组合物中。这种变体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化,且仍然保留使其能够用在免疫组合物中的抗原特性。优选地,M.hyo变体与野生型M.hyo株的全长基因组序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性。免疫组合物的抗原特性可以,例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且,当修饰的抗原提供与野生型M.hyo蛋白相比至少70%、优选80%、更优选90%的保护性免疫时,则修饰的M.hyo抗原的抗原特性仍然保留。
在一个实施方案中,M.hyo可溶性p46抗原被包含在本发明的组合物中,其终浓度为大约1.5μg/ml至大约10μg/ml、优选为大约2μg/ml至大约6μg/ml。应当注意p46是用于M.hyo功效检测的蛋白(参见下文的实施例部分)。在另一个实施方案中,M.hyo抗原可以以最终量为M.hyo全细胞培养物蛋白A处理的上清的大约5.5%至大约35%的量被包含在组合物中。
本发明的M.hyo可溶性制备物是安全的并且对于M.hyo是有效的,且适合于单次剂量给药。此外,申请人令人惊讶地发现M.hyo可溶性制备物可以有效地与来自其它病原体,包括PCV2和PRRS病毒的抗原组合,而在抗原之间没有免疫干扰。这使得M.hyo可溶性制备物成为多价疫苗,包括本发明的PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗的有效平台。PCV2和PRRS病毒抗原可以与M.hyo组合物同时给药(即作为三个单独的单次疫苗),但优选M.hyo可溶性制备物和PCV2抗原组合在一起成为即用型液体组合物的形式。这种即用型PCV2/M.hyo液体组合物然后可以与PRRS病毒抗原组合,以使得所有抗原可以被同时给药给猪。在一些实施方案中,PRRS病毒抗原处于冻干状态,PCV2/M.hyo液体组合物可以被用于使冻干的PRRS病毒抗原再水化,从而形成三价疫苗。
在一个实施方案中,本发明的免疫原性PCV2/M.hyo/PRRS组合物包含至少一种其它抗原。在一个实施方案中,至少一种其它抗原针对能在猪中引起疾病的微生物提供保护。
在一些实施方案中,至少一种其它抗原组分针对已知感染猪的细菌,病毒或原生动物提供保护。这种微生物的实例包括,但不限于下述种类:猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、猪链球菌(Streptococcum suis)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilllus pleuropneumoniae)、支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、猪鼻支原体(Mycoplama hyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasma hyosynoviae)、钩端螺旋体细菌、胞内劳森氏菌(Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspira hyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒、细环病毒(TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠病毒、脑心肌炎病毒、奥杰士基氏病、典型性猪瘟(CSF)的致病原和猪传染性肠胃炎的致病原,或其组合。
在一个实施方案中,根据本发明的三价疫苗的PCV2/M.hyo组分以即用型单瓶液体组合物的形式提供。这种即用型组合疫苗不需要混合单独PCV2和M.hyo单价疫苗,因此没有污染的风险,没有混合工作所伴随的额外劳动,并且没有在几小时之内使用混合物的要求。而且,单瓶PCV2/M.hyo组分使废料和冰箱储存空间减半。
在一些实施方案中,PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗的PCV2抗原组分是嵌合1型-2型圆环病毒的形式。嵌合病毒包括灭活的表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。嵌合猪圆环病毒及其制备方法在WO 03/049703 A2还有美国专利Nos.7,279,166和7,575,752中描述,通过引用的方式将其全文合并入本文。
在一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒的基因组的全长DNA序列相应于SEQ ID NO:5或其变体,如下所述。在另一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒的免疫原性ORF2衣壳基因相应于SEQ ID NO:6。在另一个实施方案中,由嵌合PCV1-2病毒表达的免疫原性ORF2蛋白的氨基酸序列相应于SEQ ID NO:7。
在又一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒的基因组的全长DNA序列相应于SEQ ID NO:8。在一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒的免疫原性ORF2衣壳基因相应于SEQ ID NO:9。在另一个实施方案中,由嵌合PCV1-2病毒表达的免疫原性ORF2蛋白的氨基酸序列相应于SEQ ID NO:10。
但是,嵌合PCV1-2病毒的PCV2 ORF2 DNA和蛋白不限于上述序列,因为在PCV2分离物中,PCV2 ORF2 DNA和蛋白是高度保守的区域。
在一些实施方案中,M.hyo/PCV2/PRRS组合疫苗的PCV2抗原组分是重组ORF2蛋白的形式。在一个实施方案中,重组ORF2蛋白从杆状病毒载体中表达。或者,可以使用其它已知的表达载体,例如包括,但不限于副痘病毒载体。
在一个实施方案中,重组PCV2 ORF2蛋白的序列为SEQ ID NO:11,其由SEQ ID NO:12(GenBank Accession No.AF086834)编码。在另一个实施方案中,重组ORF2蛋白的序列为SEQ ID NO:13,其由SEQ ID NO:14编码。在又一个实施方案中,重组ORF2蛋白相应于SEQ ID NO:15。在再一个实施方案中,重组PCV2 ORF2蛋白相应于SEQ ID NO:7。在再一个实施方案中,重组PCV2 ORF2蛋白相应于SEQ ID NO:10。
但是,本发明不限于上述的特定的ORF2 DNA和蛋白。因为在PCV2分离物中,PCV2 ORF2 DNA和蛋白是高度保守的区域,任何PCV2 ORF2作为PCV2 ORF2 DNA和/或多肽的来源用在嵌合PCV1-2病毒中或重组PCV2蛋白中都极有可能是有效的。
用于产生PCV2 ORF2 DNA和蛋白序列的合适的PCV2分离物的实例是PCV2分离物编号40895(2001年12月7日保藏于ATCC,指定的ATCC专利保藏命名为PTA-3914)。PCV2分离物编号40895的基因组(核苷酸)序列可以从GenBank序列号AF264042获得。用于产生PCV2 ORF2 DNA和蛋白序列的其它合适的PCV2分离物包括,但不限于下列种类:Imp.999,Imp.1010-Stoon,Imp.1011-48121和Imp.1011-48285。相应于这些PCV2分离物的基因组序列的GenBank序列号分别是AF055391,AF055392,AF055393和AF055394。
PCV2 ORF2蛋白的免疫原性部分以某些形式被用做组合物中的抗原组分。例如,PCV2 ORF2蛋白的截短和/或取代形式可以用在本发明的组合物中。
本领域技术人员应当理解PCV2序列的变体可以用在本发明的组合物中。这种变体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化,且仍然保留使其能够用于免疫组合物中的抗原特性。优选地,PCV2变体与野生型PCV2分离物的全长基因组序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%的序列同一性。免疫组合物的抗原特性可以,例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且,当修饰的抗原提供与野生型PCV2 ORF2蛋白相比至少70%、优选80%、更优选90%的保护性免疫时,则修饰的PCV2抗原的抗原特性仍然保留。
免疫原性组合物中提供的PCV2抗原组分以有效诱导所希望的免疫反应,即减少由PCV2感染导致的临床症状的发病率或减轻其严重性的抗原包含水平存在。
在一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒以至少1.0≤RP≤5.0的水平被包含在本发明的组合物中,其中RP是由相对于参考疫苗进行的ELISA抗原定量测定(体外功效检测)确定的相对功效(RelativePotency)单位。在另一个实施方案中,嵌合PCV1-2病毒以大约0.5%至大约5%的20-倍(20X)浓缩体积的大量PCV1-2抗原的终浓度被包含在本发明的组合物中。
在另一个实施方案中,PCV2 ORF2重组蛋白以至少0.2μg抗原/ml最终免疫原性组合物的水平(μg/ml)被包含在本发明的组合物中。在另一个实施方案中,PCV2 ORF2重组蛋白包含水平为大约0.2至大约400μg/ml。在又一个实施方案中,PCV2 ORF2重组蛋白包含水平为大约0.3至大约200μg/ml。在再一个实施方案中,PCV2 ORF2重组蛋白包含水平为大约0.35至大约100μg/ml。在再一个实施方案中,PCV2 ORF2重组蛋白包含水平为大约0.4至大约50μg/ml。
在一个实施方案中,本发明的三价免疫原性组合物包含至少一种M.hyo可溶性抗原(例如两种或更多种)、猪圆环病毒2型(PCV2)抗原、和PRRS病毒抗原的创造性的组合。在另一个实施方案中,组合物在猪中引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。
在一个实施方案中,PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗以单次剂量、2瓶疫苗的形式提供。例如,在一些实施方案中,PCV2/M.hyo组合以第一瓶中的稳定液体组合物的形式提供,PRRS病毒以第二瓶中的冻干状态提供。在一些实施方案中,其它的猪抗原可以被加入到第一瓶或第二瓶中。
在一个实施方案中,PRRS病毒组分以冻干的、基因修饰的活病毒的形式提供。在给药之前,第一瓶中的PCV2/M.hyo液体形式可以被用来使第二瓶中的PRRS病毒再水化,以使所有三种抗原可以以单次剂量给药给动物。应当注意,虽然PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗目前已有,它们是以需要同时进行三个单独疫苗的给药的单次剂量、3-瓶疫苗的形式提供(例如IngelvacIngelvac和PRRS MLV)。
PRRS病原体首次在荷兰被分离出来,并被命名为莱利斯塔德病毒。这种病毒在WO 92/21375(Stichting Centraal DiegeneeskundigInstituut)中描述,欧洲PRRS病毒的分离物保藏在巴黎巴斯德研究院,保藏号为I-1102。北美类型几乎是在欧洲类型病毒分离的同时被分离出来,并在WO-93/03760(Collins et al.)中描述,北美类型病毒的分离物包藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号为VR-2332。
从欧洲和北美病毒类型中均分离出不同的毒株。WO 93/07898(Akzo)描述了欧洲毒株以及源自于它的疫苗,保藏在CNCM(巴斯德研究院),保藏号为I-1140。而且,WO 93/14196(Rhone-Merieux)描述了在法国分离出的一种新毒株,保藏在CNCM(巴斯德研究院),保藏号为I-1153。而且,EP0595436 B1(Solvay)描述了一种新的北美类型的毒株,比最初描述的那种毒性更强,以及它的疫苗。该毒株已保藏于ATCC,但是在专利申请中没有说明保藏编号。此外,ES2074950BA(Cyanamid Iberica)以及它的同族GB2282811 B2描述了一种所谓的“西班牙毒株”,其不同于其它的欧洲和北美毒株。这种“西班牙毒株”已被保藏于欧洲动物细胞培养物保藏中心(EACCC),保藏号为V93070108。
用于本发明的PCV2/M.hyo/PRRS组合物中的合适的PRRS病毒抗原包括北美PRRS病毒分离物、中国PRRS病毒株和欧洲PRRS病毒株,以及这些分离物/毒株的基因修饰版本。在一个实施方案中,用于根据本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是北美PRRS病毒。
在一些实施方案中,用于本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是被称为P129的北美PRRS病毒分离物或者它的活的,基因修饰的版本。优选地,基因修饰的PRRS病毒不能产生致病感染,但是能够引发有效的针对野生型PRRS病毒感染的免疫保护反应。
用于本发明组合物的基因修饰的PRRS病毒可以从感染性克隆产生。被称为P129的北美PRRS病毒分离物的感染性cDNA克隆的制备在美国专利No.6,500,662中描述,通过引用将其完全合并入本文。P129 cDNA的序列在Genbank序列号AF494042和美国专利No.6,500,662中公开。
在一个实施方案中,用于本发明组合物的P129的非-毒性形式的核苷酸序列由SEQ ID NO:16表示。但是本发明不限于该序列。该序列和P129的其它非-毒性形式的序列在2011年11月9日提交的国际申请No.PCT/IB2011/055003中描述,通过引用将其全文内容(包括基于该国际申请提交的任何美国国家阶段申请)合并入本文。优选地,PRRS病毒被改造以防止干扰素-介导功能的下游调控。
在其它实施方案中,用于本发明组合物中的PRRS病毒抗原组分是被称为ISU-55的PRRS病毒分离物。ISU-55分离物保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号为VR2430。ISU-55分离物的ORF2至ORF5基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:17表示。ISU-55分离物的ORF 6和ORF7基因的核苷酸序列由SEQ ID NO:18表示。
可以用在组合物中的另一种适合的北美PRRS病毒是ISU-12,其被保藏在ATCC,保藏号为VR2385[3x空斑纯化]和VR2386[无空斑纯化]。还有其它可用在本发明组合物中的适合的北美PRRS病毒分离物是下列的那些:ISU-51、ISU-3927、ISU-1894、ISU-22和ISU-79,它们被保藏在ATCC,保藏号分别为VR2498、VR2431、VR2475、VR2429和VR2474。这些ISU分离物任一种的基因修饰版本可以用在本发明的组合物中。这些ISU分离物和ISU-55分离物在下述Paul,et al的美国专利中进行了详细描述:US 5,695,766、6,110,467、6,251,397、6,251,404、6,380,376、6,592,873、6,773,908、6,977,078、7,223,854、7,264,802、7,264,957和7,517,976,通过引用的方式将所有这些专利的全文合并入本文。
在再一个实施方案中,用在根据本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC),保藏号为VR-2332的北美类型或其基因修饰版本。例如,PRRS病毒可以是基于被确定为ATCC VR2332的分离物的修饰的活病毒,其被用在Boehringer Ingelheim Vetmedica,Inc的PRRS ATP和PRRS MLV中。
在再一个实施方案中,用在本发明组合物中的PRRS病毒抗原是欧洲PRRS病毒分离物或莱利斯塔德病毒或其基因修饰版本。适合的PRRS病毒株的实例被确定为上述的保藏号I-1102。相应于I-1102保藏物的核苷酸和氨基酸序列在Wensvoort et al的美国专利no.5,620,691中描述,通过引用将其完全合并入本文。欧洲PRRS病毒分离物或莱利斯塔德病毒的感染性克隆的制备在美国专利No.6,268,199中描述,通过引用将其完全合并入本文。
适合的PRRS病毒分离物的其它实例包括,但不限于上述的那些。而且,PRRS病毒分离物的活的,基因修饰的版本可以用在本发明组合物中。感染性克隆可以被用于再生产这种活的基因修饰的生物体。
本领域技术人员应当理解,PRRS病毒序列的变体可以被用在本发明的组合物中。这种变体在序列同一性上可以有多达10-20%的变化,且仍然保留使其能够用于免疫组合物中的抗原特性。优选地,PRRS病毒变体与野生型PRRS病毒分离物的全长基因组序列具有至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、更优选至少95%的序列统一性。免疫组合物的抗原特性可以,例如通过实施例中提供的攻毒试验进行估计。而且,当修饰的抗原提供与野生型PRRS病毒抗原相比至少70%、优选80%、更优选90%的保护性免疫时,则修饰的PRRS病毒抗原的抗原特性仍然保留。
在一个实施方案中,PRRS病毒抗原组分是基因修饰的活病毒,其以至少2.1≤TCID50≤5.2的水平被包含在本发明的组合物中,其中TCID50是通过抗原定量测定(体外功效检测)确定的50%组织培养物感染剂量。
本发明的PCV2/M.hyo/PRRS组合物的PCV2抗原组分可以是嵌合1型-2型圆环病毒的形式,嵌合病毒包括灭活的表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。在另一个实施方案中,本发明的PCV2/M.hyo/PRRS组合物的PCV2抗原组分是重组ORF2蛋白的形式。
用于PCV2/M.hyo/PRRS组合物的适合的PCV2抗原可以是来自于任何上述的PCV2分离物,以及其它PCV2分离物。用在本发明组合物中的适合的PCV2抗原包括,但不限于上述的PCV2序列及其变体。
本发明的疫苗可以遵循公认的惯例进行配制,以包含可接受的用于动物,包括人(如果适用的话)的载体,例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂,并且可以配制成利于缓释的形式。稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇、乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合适的疫苗媒介物和添加剂,包括那些特别用于配制修饰的活疫苗的,对于本领域技术人员来说是公知的或是显而易见的。参见,例如,Remington's Pharmaceutical Science,18th ed.,1990,MackPublishing,其通过引用被合并入本文。
本发明的疫苗可以进一步包含尤其是一种或多种其它的免疫调节组分,例如佐剂或细胞因子。用在本发明组合物中的合适的佐剂包括下述种类:水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。佐剂的一些特定的实例包括,但不限于,完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、短小棒杆菌、卡介苗、氢氧化铝凝胶、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化铁、海藻酸钠、Bacto-佐剂、特定的合成聚合物例如聚氨基酸和氨基酸共聚物、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta,Ga.),QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge Mass.)、SAF-M(Chiron,Emeryville Calif.)、佐剂、皂苷、QuilA或其它皂苷级分、单磷酰脂质A和阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂(N,N-双十八烷基-N',N'--二(2-羟甲基)-丙二酰胺)、"REGRESSIN"(Vetrepharm,Athens,Ga.)、石蜡油、RIBI佐剂系统(Ribi Inc.,Hamilton,Mont.)、胞壁酰二肽等等。
可用于本发明疫苗的水包油乳液包括改良的SEAM62和SEAM1/2制剂。改良的SEAM62是含有5%(v/v)角鲨烯(Sigma)、1%(v/v)85去垢剂(ICI Surfactants)、0.7%(v/v)80去垢剂(ICI Surfactants)、2.5%(v/v)乙醇、200μg/ml Quil A、100μg/ml胆固醇和0.5%(v/v)卵磷脂的水包油乳液。改良的SEAM 1/2是含有5%(v/v)角鲨烯、1%(v/v)85去垢剂、0.7%(v/v)Tween 80去垢剂、2.5%(v/v)乙醇、100μg/ml Quil A和50μg/ml胆固醇的水包油乳液。
可用于本发明组合物的佐剂的另一个实例是SP-油。如说明书和权利要求中所使用的,术语“SP油”是指包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烯、聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯和缓冲盐溶液的油状乳液。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是表面活性剂,帮助悬浮固体和液体组分。这些表面活性剂作为商品名为的聚合物是商业可获得的。优选的表面活性剂是泊洛沙姆401,其是商业可获得的,商品名为L-121。通常SP油乳液是免疫刺激佐剂混合物,其包含大约1-3%vol/vol的嵌段共聚物,大约2-6%vol/vol的角鲨烯,更特别是大约3-6%的角鲨烯和大约0.1-0.5%vol/vol的聚氧乙烯山梨醇酐单油酸酯,其余为缓冲盐溶液。在一个实施方案中,SP-油乳液在最终组合物中以大约1%至25%、优选大约2%至15%、更优选大约5%至12%v/v的量(v/v)存在。
用在本发明组合物中的合适佐剂的又一个实例是AMPHIGENTM佐剂,其由溶解在油(通常是轻质液体石蜡)中的脱脂卵磷脂组成。
可用在本发明组合物中的其它佐剂的实例是下述的专有佐剂:Microsol Diluvac双乳液佐剂系统,Emunade佐剂和Xsolve佐剂。Emunade和Xsolve佐剂都是水包轻矿物油的乳液,但是Emunade还包含铝胶,而d,l-α-生育酚乙酸酯是XSolve佐剂的一部分。用在本发明组合物中的合适佐剂的又一个实例是ImpranFLEXTM佐剂(油包水佐剂)。合适佐剂的又一个实例是基于Carbomer的佐剂。优选的佐剂包括934聚合物和941聚合物。
在一个实施方案中,佐剂或佐剂混合物以每剂量大约100μg至大约10mg的量被加入。在另一个实施方案中,佐剂/佐剂混合物以每剂量大约200μg至大约5mg的量被加入。在又一个实施方案中,佐剂/佐剂混合物以每剂量大约300μg至大约1mg的量被加入。
本发明疫苗组合物中典型存在的佐剂或佐剂混合物的量(v/v)为大约1%至25%、优选大约2%至15%、更优选大约5%至12%v/v。
疫苗中可以包含的其它“免疫调节剂”包括,例如一种或多种白介素,干扰素或其它已知的细胞因子。在一个实施方案中,佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物,例如美国专利No.6,165,995和6,610,310中分别描述的。
另一个方面涉及制备根据本发明的免疫原性组合物的方法。该方法包括i)在合适的培养基中培养M.hyo 18-144小时的时间;ii)随后灭活M.hyo培养物;iii)收获灭活的培养液,其中灭活的培养液包含M.hyo全细胞制备物,所述全细胞制备物包含可溶性液体级分和不可溶细胞物质;iv)从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分;v)从分离的可溶性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物,以形成M.hyo全细胞制备物的可溶性级分;以及vi)随后将M.hyo全细胞制备物的可溶性部分与PCV2抗原和PRRS病毒抗原组合。在一个实施方案中,步骤vi)包括将包含PCV2抗原和M.hyo可溶性部分的即用型液体组合物与冻干的PRRS病毒抗原组合。
用于培养M.hyo的合适的培养基的实例是PPLO肉汤(支原体肉汤基础),当其添加了营养强化物质时,可以用于分离和培养支原体。
在一些实施方案中,M.hyo培养物生长直至对数生长后期,然后培养物被灭活。在一些其它的实施方案中,通过提高pH(例如达到大约7.8)灭活培养物。通过将产生的培养物暴露于灭活试剂,如二乙烯亚胺(BEI)使灭活发生。在生产培养物中L-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)的温育过程中原位生成BEI。随后,灭活培养物的pH被中和,例如通过加入等量的中和溶液中灭活试剂的试剂。在一些实施方案中,灭活试剂是BEI,中和试剂是硫代硫酸钠。在一个实施方案中,灭活培养物的pH通过加入硫代硫酸钠被调节至大约7.4。
在一些实施方案中,使用传统方法从不可溶细胞物质分离M.hyo全细胞制备物的可溶性液体级分。在一个实施方案中,这种分离是通过过滤步骤。在另一个实施方案中,这种分离是通过离心步骤。在又一个实施方案中,这种分离是通过沉淀步骤。
在一个实施方案中,灭活的、中和的M.hyo全细胞制备物用蛋白A树脂进行处理以基本上除去其中的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。在其它实施方案中,蛋白G树脂可被用于基本上除去可溶性液体级分中含有的IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物。用蛋白A或蛋白G树脂除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物的方法是本领域公知的。
根据另一个方面,制备根据本发明的三价免疫原性组合物的方法包括制备上述的可溶性M.hyo抗原,并将其与PCV2抗原,PRRS病毒抗原,合适的佐剂和一种或多种药学可接受的载体混合。该方法任选地包括将PCV2抗原与可溶性M.hyo抗原组合以形成二价组合物,并随后将这种二价组合物加入到单价PRRS病毒抗原组合物中以形成三价组合物。
本发明的另一个方面涉及试剂盒。“试剂盒”指组合在一起的多个组分。在一个实施方案中,根据本发明的试剂盒包括第一瓶(或其它合适的容器),其包含组合物,所述组合物包含PCV2抗原和猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分,其中M.hyo全细胞制备物的可溶性部分基本不含(i)IgG和(ii)抗原/免疫球蛋白免疫复合物;和第二瓶,其包含PRRS病毒抗原。在一个实施方案中,试剂盒进一步包括使用说明书。
在一些实施方案中,试剂盒的第一瓶中的PCV2/M.hyo组合以即用型液体组合物的形式提供。在其它实施方案中,PRRS病毒抗原是基因修饰的活病毒的形式,其以冻干的状态被提供。在这种例子中,使用说明书将会包含用含有PCV2/M.hyo组合的第一瓶中的液体内容物使第二瓶中的PRRS病毒组分再水化的说明。使用说明书还优选包括将组合的第一和第二瓶的内容物给药给猪的说明。
在一些实施方案中,根据本发明的免疫原性组合物被给药给具有源自母体的针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的至少一种的抗体的猪。在其它实施方案中,本发明的免疫原性组合物被给药给具有源自母体的针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的抗体的猪。
在一些实施方案中,根据本发明的三价免疫原性组合物被给药给3周龄或更大的小猪。但是,所考虑的是,根据本发明的三价疫苗组合物还可以用于给配种前的小母猪进行再接种。如本领域所知道的,小母猪是从未怀孕过的雌性猪。接种的小母猪会通过初乳将母体的抗体传给哺乳期的新生幼崽。
进一步考虑的是,本发明的三价疫苗可以用于每年给种猪群进行再接种。优选地,根据本发明的三价疫苗以单次剂量被给药给猪(例如小猪或小母猪)。在一个实施方案中,根据本发明的多价疫苗不需要在给药前混合单独PCV2和M.hyo单价疫苗,即PCV2/M.hyo组分以单瓶中的即用型制剂的形式被提供。在另一个实施方案中,多价制剂需要将第一瓶中包含的二价PCV2/M.hyo疫苗与第二瓶中包含的单价PRRS疫苗混合。任选地,其它的抗原可以被加入到这些瓶中的任一个中。
在一些实施方案中,免疫力的开始是在用根据本发明的三价疫苗组合物接种后2-3周。在其它实施方案中,免疫力的持续时间为用根据本发明的三价疫苗组合物接种后大约17-23周。
下述实施例描述了根据本发明的优选材料和程序。但是,应当理解这些实施例仅以举例说明的方式被提供,其中任何内容都不应视为是对发明整个范围的限制。
实施例
实施例1:PCV2组合M.hyo抗原的猪肺炎支原体产生方法
M.hyo发酵和灭活
种子规模和抗原生产的培养基按下述制备。按照制造商的说明(即21g/L)制备猪心衍生的胸膜肺炎样生物体(PPLO)肉汤(BD Biosciences目录No.21498),并将酵母提取物制备成21g/L,在USP中。然后将酵母提取物溶液以6.25%的浓度加入到PPLO中,加热至121℃并>30分钟使混合物灭菌。将盐酸半胱氨酸制备成90g/L并过滤灭菌。在每升USP水中加入450g右旋糖,然后加热灭菌,制备右旋糖溶液。为了制备最终的培养基,向基础培养基中加入10%的猪血清,然后加入0.01%的半胱氨酸和1.0%的右旋糖。培养基用10%v:v的猪肺炎支原体(P-5722-3株)对数生长期培养物接种。将培养物置于37℃,并将pH和dO分别保持在7.0和25%。在对数生长晚期,通过二乙烯亚胺(BEI),一种由2-溴乙胺氢溴酸盐产生的氮杂环丙烷化合物灭活使培养物灭活。具体地,通过加入2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)至终浓度为4mM并温育24小时,将pH提高至7.8来使灭活发生。通过以1:1的摩尔比加入硫代硫酸钠并再温育24小时来中和BEI。灭活的培养液置于2-8℃直至进一步处理。
实施例2:嵌合猪圆环病毒(cPCV)1-2产生方法
通过将致病性猪圆环病毒2型(PCV2)的免疫原性衣壳基因克隆到非致病性猪圆环病毒1型(PCV1)的基因组骨架中构建cPCV1-2。嵌合DNA克隆的构建过程例如在美国专利No.7,279,166中描述,通过引用将其全文合并入本文。嵌合病毒的感染性贮存物从Dr.X.J.Meng,Virginia Polytechnic Institute and State University,Blacksburg,VA处获得,并用于感染在添加了0.05%乳白蛋白水解物(LAH),30μg/mL硫酸庆大霉素和5%胎牛血清的最小必需培养基(MEM)中生长的猪肾(PK)-15细胞。得到的cPCV1-2感染的PK-15细胞使用相同的生长培养基通过连续传代4次进行扩增,除了培养基中含有2-3%胎牛血清。第五次传代被冷冻、融化和过滤,得到的裂解物被用于制备前主种子(pre-master seed)和后续的主种子。
用于生产病毒种子的培养基与生产病毒贮存物中使用的一样。对于生长培养基,MEM、OptiMEM或等同物是可用于培养PK-15细胞系进行生长的基础培养基。生长培养基可以添加最多10%的牛血清,最多0.5%的乳白蛋白水解物,最多0.5%的牛血清白蛋白和最多30μg/mL的庆大霉素。对于病毒繁殖培养基,使用MEM、OptiMEM或等同物。病毒繁殖培养基可以添加最多0.5%的乳白蛋白水解物、最多2%的牛血清、最多0.5%的牛血清白蛋白和最多30μg/mL的庆大霉素。最多5g/L的葡萄糖和最多5mmol/L的L-谷氨酰胺可以根据需要被加入到生长培养基和/或病毒繁殖培养基中以维持细胞。
cPCV1-2主种子病毒被加入到PK-15细胞的细胞悬液中并吸附最多3小时。种子病毒在生长基础培养基中被稀释以提供0.1-0.0001的感染复数(MOI)。
PK-15细胞培养物在细胞种植时,或在细胞达到大约20%至50%汇合时用工作种子病毒进行最初的接种。这种最初的传代可以被称为“一步感染法”,用于产生抗原贮存物,或者可以被进一步用于连续传代。对于连续传代,cPCV1-2感染的PK-15细胞通过以1:5-20的比例连续分裂被进一步扩增到第7代以进行病毒繁殖。含有来自于上一代的感染细胞悬液的培养物培养基作为下一代的种子物。每一代的cPCV1-2感染的细胞在36±2℃温育3-14天直至细胞达到≥90%汇合。在病毒复制过程中,cPCV1-2病毒引起可观察到的细胞病性改变。收获时,观察到细胞变圆以及相当多的漂浮的碎片。还观察到培养物被细菌或真菌污染的可见证据。cPCV抗原的收获之间的温育时间在下述的表1中提供:
表1 收获cPCV抗原的最短和最长时间
将cPCV1-2培养液收获到无菌容器中,并取样用已知方法进行支原体检测。多次收获可以用滚瓶、生物反应器和灌注容器进行。
在对收获的cPCV1-2病毒进行灭活之前,可以通过超滤来浓缩(例如最多60X)一个或多个抗原批次。浓缩液可以用平衡的盐溶液洗涤以减少血清蛋白。
现在描述cPCV1-2病毒灭活、减毒或脱毒的方法。cPCV抗原浓缩之后,向合并的cPCV1-2病毒材料中加入β-丙内酯(BPL),达到大约0.2%v/v的浓度。然后将合并的病毒液体搅拌最少15分钟,然后将灭活的大量抗原液体转至第二个无菌容器中。被转移的抗原液体被保持在2-7℃,连续搅拌,持续最少24小时。最少24小时后,向合并的悬液中第二次加入0.2%v/v的BPL。随后搅拌内容物,并转至第三个容器中,保持在2-7℃,连续搅拌,另外持续不少于84小时。通常,完全灭活的时间不少于108小时并且不超过120小时。灭活方法总结在下述表2中。
表2 灭活方法
通过加入终浓度不超过0.1M的硫代硫酸钠溶液终止灭活。灭活抗原贮存物的pH用NaOH或HCl调节到约6.8。灭活之后,从合并物中取出代表性样品对灭活的完全性进行检测。灭活的cPCV1-2抗原产物被标准化以符合功效ELISA测定大于1.0RP的目标。
实施例3:M.hyo抗原的下游处理和这些被处理抗原的分析检测
M.hyo抗原的下游处理:
对于每一个所指出的组,如下所述处理灭活发酵液体(如上述实施例1制备)。这些被处理的M.hyo抗原被用于下述实施例4中。
T02:(整体)未处理。
T03:(10X UF浓缩)通过100KDa截留分子量膜(中空纤维)经切向流过滤浓缩。最终的体积减少等于10X。
T04 & T05:(10X UF浓缩并离心)收集浓缩的支原体细胞(来自T03)并用PBS通过在~20,000xg离心(Sorvall model RC5B)洗涤一次。
T06 & T07:(10X离心)灭活发酵流体在~20,000xg离心(Sorvall RC5B)并通过将细胞重悬于PBS中并随后再次离心来洗涤一次。最终的体积减少等于10X。
T08:(10X离心并加热)按照T06浓缩并洗涤支原体细胞,并加热至65℃保持10分钟。
T09:(无细胞上清)如T06所述第一次离心收集的上清通过0.2微米的滤器(Nalgene)进行无菌过滤。
T10:(无细胞上清-蛋白-A处理)无菌上清(按照T09制备)与蛋白A树脂(蛋白A Sepharose,Pharmacia Inc)以10:1的体积比混合4小时。无菌过滤除去树脂,并将过滤的液体储存于2-8℃。这种处理使用了发酵后的“下游”蛋白A处理以除去抗体和免疫复合物。虽然本发明不排除上游蛋白A处理,本发明人发现在M.hyo的情况中,生长培养基的上游蛋白A处理导致p46的结果与未处理的培养基相比较低且不一致(数据未显示)。
M.hyo下游处理抗原的分析检测
对下游处理的M.hyo抗原制备物(如上所述制备)进行M.hyo特异性p46抗原的回收,PCV2抗体的存在的检测。此外,对这些M.hyo抗原制备物进行细环病毒(TTV)存在的检测,包括基因型1(g1TTV)和基因型2(g2TTV)。结果显示在下述表3中。
表3 M.hyo下游处理抗原的表征
关于上述表3,对于每个M.hyo下游处理抗原制备物都证明M.hyo特异性p46抗原被回收。此外,下述处理成功地除去PCV2抗体:10X UF浓缩并离心,10x离心,10X离心并加热和无细胞上清(蛋白-A处理)。关于TTV,下述处理成功地除去g1TTV:10X UF浓缩并离心,10x离心并加热以及无细胞上清(蛋白-A处理)。只有被称为10X UF浓缩并离心的处理除去g2TTV。细环病毒分离物(包括基因型1和2)在US20110150913中描述,通过引用将其全文合并入本文。
由于本领域已知蛋白A结合IgG,本领域普通技术人员应当理解不仅仅是PCV2抗体,还有其它猪抗体,包括PRRS抗体,HPS抗体和SIV抗体将会被蛋白-A处理有效除去。这使得本发明的无细胞蛋白-A处理的M.hyo上清不仅与PCV2抗原相容,还和其它猪抗原相容,其原因在于在抗原之间没有免疫干扰。此外,非保护性细胞碎片的去除和免疫球蛋白和抗原/免疫球蛋白复合物的去除被合理预期可以制备更安全的疫苗。
实施例4:M.hyo试验性疫苗制剂的制备
所有试验性M.hyo疫苗用终浓度为5%的爱菲金(Amphigen)佐剂配制。此外,所有疫苗用p46ELISA标准化并用硫柳汞防腐。用根据上述处理T02-T10处理的M.hyo抗原制备试验性疫苗制剂。此外,处理T01相应于安慰剂(无M.hyo抗原,只有5%爱菲金佐剂),但是处理T11是阳性对照,相应于到期的基于菌苗的M.hyo疫苗(Pfizer Animal Health)。这些制剂在下述表4中描述。
表4 M.hyo试验性疫苗制剂
*试验兽药(IVP)系列
实施例5:具有不同下游处理的M.hyo抗原的M.hyo疫苗的体内效力的评估
进行该研究以评价具有不同下游处理(DSP)的M.hyo抗原的猪肺炎支原体(M hyo)疫苗的体内效力。3周龄的猪肌内被接种单次剂量的上述表4中所述的不同疫苗制剂。每个处理组中包括十六只动物。接种后21天用毒性M.hyo田间分离物进行攻毒。攻毒后28天对动物进行尸体解剖,取出肺并对与M.hyo感染一致的实变进行评分。针对M.hyo攻毒提供保护的主要标准是肺部实变的评分。通常可接受的是由地方性动物病肺炎引起的肺损伤的尺寸与生长率上的不利影响有关系。下述表5包含各个处理组的肺损伤评分。通过对每组的肺部评分进行混合模型分析确定统计学显著性。
表5 肺损伤结果
关于上述表5,不同下游处理的M.hyo抗原的结果表明除了T04之外的所有试验性疫苗都与安慰剂显著不同。这些M.hyo损伤的结果以图的方式表示在图1中。如图1所示,T04给出了不可接受的结果。所有其它处理都与安慰剂(T01)显著不同。肺实变评分表明T02,T03和T09-T11针对M.hyo攻毒提供最有效的保护。
使用双抗体夹心酶联免疫吸附检测(DAS ELISA)评价试验性疫苗的p46相对功效。上述表5中显示的p46DAS ELISA的结果表明所有试验性疫苗都超过了目标功效。此外,p46的相对功效在超过一个月的疫苗储存期间被保持或有所增加(数据未显示)。在离心的抗原中观察到随着时间经过,功效具有可被察觉的增加,除了那些经过加热的疫苗。然而不希望受到任何理论的束缚,在离心抗原的情况下,很可能细胞“尸体”随着时间的经过而破裂,从而释放出更多的膜结合p46抗原。
实施例6:试验性M.hyo疫苗与PCV2抗原相容性的评价
进行该研究以评价具有不同下游处理的M.hyo抗原的M.hyo试验性疫苗与PCV2抗原的相容性。M.hyo试验性疫苗制剂如上述表4和5所述。所观察到的这些疫苗的p46相对功效如上述表5中所述。这些M.hyo试验性疫苗每个与PCV2抗原组合。在该实施例中,PCV2抗原是灭活的如上述实施例2所述制备的PCV 1型-2型嵌合病毒(Fostera PCV)。嵌合病毒被包含在组合物中,初始水平为大约1.6≤RP,其中RP是由PCV2ELISA抗原定量测定(体外功效检测)所确定的相对于有效的参考疫苗的相对功效单位。
试验性M.hyo/PCV2组合制剂通过PCV2ELISA被评价。结果显示在图2中。如图2所示,只有下述下游处理的M.hyo抗原制备物与PCV2抗原相容:超滤并离心(T04&T05),离心(T06&T07),离心加上加热(T08)和蛋白A处理的上清(T10)。在它们之中,与包含嵌合病毒和爱菲金佐剂,但不含M.hyo抗原的安慰剂对照比较,M.hyo蛋白A处理的上清与PCV2抗原最相容。与安慰剂的1.69RP相比,蛋白A处理的上清中的嵌合PCV病毒水平是1.5RP。因此推断在蛋白A处理的M.hyo可溶性抗原制备物和嵌合病毒的PCV2抗原之间没有或者仅有最小的免疫干扰。
在上述实施例5中证明的蛋白-A处理的M.hyo上清的体内效力以及本实施例描述的结果表明蛋白-A处理的上清是潜在的M.hyo-PCV2组合的有效平台。
实施例7:不同佐剂配方的单瓶PCV2/M.hyo组合疫苗的PCV2效力的评价
设计该研究是为了评价不同佐剂配方的单瓶PCV2/M.hyo组合疫苗的PCV2效力。在本实施例中,PCV2抗原是灭活的PCV 1型-2型嵌合病毒(Fostera PCV)。嵌合病毒与基本不含IgG的M.hyo可溶性抗原制备物(即蛋白A处理的上清)组合。
液体的处理:
对于每一个所指出的组,灭活的M.hyo发酵液(上述实施例1中所描述的)如下所述进行处理。
T02-T04:含有活的猪肺炎支原体细胞的完整发酵液(上述的)在~20,000xg离心(Sorvall RC5B),收集上清并通过0.2μM滤器灭菌。rProtein A Sepharose(部件号17-5199-03,GE Healthcare)被装填到1L的色谱柱中。除去储存缓冲液并用2倍柱体积的1M的醋酸处理后,用5倍体积的50mM NaPO4/1M NaCl缓冲液,pH 7.04平衡树脂。使大约2升澄清的/过滤的含有猪肺炎支原体抗原的液体以100cm/hr的流速流过蛋白A树脂。收集流出液并通过0.2μM滤器灭菌。
T05:这是相应于Fostera PCV-样制剂(不含M.hyo抗原)的阳性对照。这种Fostera PCV-样制剂中嵌合病毒的水平近似为最小免疫剂量(MID)制剂水平。嵌合病毒以类似的制剂水平被包含在PCV2/M.hyo试验性疫苗中。
所有的试验性PCV2/M.hyo疫苗用不同的佐剂配方配制。用根据上述处理T02-T04进行处理的M.hyo抗原制备试验性疫苗制剂。此外,处理T01相应于安慰剂(无菌盐水)。
所有疫苗用p46ELISA标准化并用硫柳汞防腐。
这些试验性制剂在下述表6中描述,其中符号*表示来自完整M.hyo种子,蛋白A处理上清的M.hyo抗原,符号**表示试验兽药(IVP)系列。
表6 用于PCV2效力研究的PCV2/M.hyo试验性疫苗制剂
3周龄的猪被肌内接种单次剂量的上述表6中描述的不同疫苗制剂。每个处理组中包括十六只动物。接种后21天用毒性PCV2田间分离物对动物进行攻毒。
图3是显示用不同佐剂平台观察到的PCV2病毒血症结果(PCV2定量PCR)的图。应当注意,PCV2病毒血症被用作主要的效力变量。PCV2病毒血症结果显示为DNA拷贝数/ml。如图3所示,在第28、35和42天(攻毒是第21天),所有的处理与安慰剂相比都显著减少了病毒血症。在第28和35天,10%SP-油佐剂与5%爱菲金相比显著减少病毒血症。在第28和35天,5%爱菲金加上5%SLCD佐剂与5%爱菲金相比显著减少病毒血症。在第28,35和42天,20%SLCD佐剂平台与5%爱菲金相比显著减少病毒血症。
还监测PCV2血清学、PCV2粪便脱落、PCV2鼻脱落、细胞介导免疫(CMI)反应、淋巴损耗和免疫组化(IHC)作为第二效力变量。这些结果将会在下面描述。
图4是显示在研究的第1、20和42天(攻毒是在第21天)的PCV2ELISA结果的图。每个样品的状态表示为样品对阳性的比值(S/P)。如图4所示,20%SLCD是唯一在第20天和第42天均与安慰剂(T01)显著不同的处理。而且,在第20天,5%爱菲金是唯一与安慰剂没有显著不同的处理。
图5是显示T02-T04处理相对于安慰剂(T01)获得的PCV2粪便脱落的图。这些结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。图5中的结果表明在第42天,所有处理与安慰剂相比都显著减少粪便脱落。此外,在第42天,5%爱菲金&5%SLCD(T04)与5%爱菲金(T03)相比显著减少粪便脱落。没有发现有其它的处理差异。
图6是显示T02-T04处理相对于安慰剂(T01)获得的PCV2鼻脱落的图。这些结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。图6中的结果表明在第42天,所有处理与安慰剂相比都显著减少鼻脱落。此外,在第42天,20%SLCD(T05)与5%爱菲金(T03)相比显著减少鼻脱落。没有发现有其它的处理差异。
图7(A&B)是显示测定PCV2-特异性细胞介导免疫(CMI)应答的干扰素-γ(IFN-γ)检测结果的图。显示接种后/攻毒前(图7A)和接种后/攻毒后(图7B)的CMI结果。在这些图中,5x 106个细胞的刺激被认为是显著的(…)。所有PCV2/M.hyo试验性疫苗给出可检测到的接种后IFN-γ应答。10%SP-油(T02)驱动了最强的接种后IFN-γ应答。20%SLCD(T05)诱导较早的应答,但是在第20天的应答最低。有大量的攻毒后应答,特别是在安慰剂组观察到的。此外,在接种的猪处理组中的攻毒后应答与安慰剂组相比较低。
下述表7显示了与安慰剂相比,用试验性处理获得的淋巴耗损。
表7 PCV2组织病理学(淋巴耗损)
上述表7中显示的结果表明所有疫苗对淋巴耗损都提供强的保护作用。而且,没有观察到统计学显著的疫苗处理对比。
下述表8显示了与安慰剂相比,用试验性处理获得的免疫组化。
表8 PCV2组织病理学(免疫组化)
表8中的结果表明所有疫苗对由免疫组化证明的PCV2建群都提供强的保护作用。而且,没有观察到统计学显著的疫苗处理对比。
总之,本实施例的结果证明M.hyo可溶性抗原制备物不干扰PCV2的效力。结果还表明所有PCV/M.hyo试验性疫苗制剂提供针对PCV2攻毒的效力。此外,结果表明用不同佐剂配方获得了一些统计学的和数值的差异,10%SP-油产生最强的效力。
实施例8:不同佐剂配方的单瓶PCV2/M.hyo组合疫苗的M.hyo效力的评价
设计该研究是为了评价不同佐剂配方的单瓶PCV2/M.hyo组合疫苗的M.hyo效力。在单瓶中M.hyo抗原与猪圆环病毒(1型-2型嵌合体,或PCV1-2,灭活病毒)相组合。
液体的处理:
对于每一个所指出的组,灭活的M.hyo发酵液(上述实施例1中所描述的)如下所述进行处理。
T02-T04:其处理与上述实施例7中处理组T02-T04所描述的相同。
T05:用上述实施例1标题“发酵和灭活”中描述的灭活的M.hyo细胞(M.hyo菌苗)配制。
所有的试验性PCV2/M.hyo疫苗用不同的佐剂配方配制。用根据上述处理T02-T04进行处理的M.hyo抗原制备试验性疫苗制剂。此外,处理T01相应于安慰剂(无菌盐水)。处理T05是相应于到期的疫苗,基于M.hyo菌苗的疫苗(Pfizer Animal Health)的阳性对照。
这些试验性制剂在下述表9中描述,其中符号*表示来自完整M.hyo种子,蛋白A处理上清的M.hyo抗原,符号**表示试验兽药(IVP)系列。
表9 不同佐剂配方的用于M.hyo效力研究的PCV2/M.hyo试验
性疫苗制剂
3周龄的猪被肌内接种单次剂量的上述表9中描述的不同疫苗制剂。安慰剂和10%SP-油组中均包括十四只动物,阳性对照组中包括十三只动物,5%爱菲金和5%爱菲金+5%SLCD组中均包括十六只动物。
接种后21天用毒性M.hyo田间分离物对动物进行攻毒。攻毒后28天进行尸体解剖,取出肺并对与M.hyo感染一致的实变进行评分。下述表10包含各个处理组的肺损伤评分。通过对每组的肺部评分进行混合模型分析确定统计学显著性。
表10 M.hyo肺损伤
处理 | #动物 | LS平均肺损伤 | 肺损伤范围% |
安慰剂(T01) | 14 | 13.1% | 0.1-50.5 |
10%SP-油(T02) | 14 | 4.3% | 0.0-50.8 |
5%爱菲金(T03) | 16 | 4.7% | 0.0-38.5 |
5%爱菲金+5%SLCD(T04) | 16 | 12.0% | 0.1-55.8 |
到期的RSO(T05) | 13 | 2.28% | 0.0-34.5 |
如上述表10所示,与分别具有4.3%和4.7%的平均肺部评分的10%SP-油和5%爱菲金处理组相比,安慰剂组具有13.1%的平均肺损伤评分。10%SP-油和5%爱菲金制剂均减少和/或防止肺损伤。因此,用10%SP-油或5%爱菲金配制的试验性PCV/M.hyo疫苗被认为是有效的。PCV2抗原似乎不会干扰这些制剂的M.hyo效力。
相反,5%爱菲金+5%SLCD组具有12.0%的平均肺损伤评分,这是不可接受的结果,因为与安慰剂相比没有差异。因此,用5%爱菲金+5%SLCD配制的PCV/M.hyo疫苗制剂不被认为是有效的。
应当注意,由于减少的动物数量和肺损伤评分中高度的可变性,在本研究中没有统计学的处理效果被确定地证明。由于这个原因,决定设计另一项研究以检测10%SP-油中的PCV/M.hyo试验性制剂的M.hyo效力。该项重复研究在下述实施例9中描述。
实施例9:10%SP-油中的单瓶PCV2/M.hyo组合疫苗的M.hyo效力的评价
本研究是概念验证,其被设计以评价由不同的使用蛋白A进行IgG的去除的M.hyo制造方法制备的四种试验性PCV2/M.hyo疫苗(下述表11中的序号L0711RK11,L0711RK12,L0711RK13和L0711RK14)与用标准M.hyo制造方法制备的对照疫苗相比的M.hyo级分效力。四种试验性PCV2/M.hyo疫苗每种都包含10%SP-油作为佐剂。
液体的处理:
T02:如上述实施例1“发酵和灭活”中描述的灭活的猪肺炎支原体抗原。
T03和T04:用上述实施例1“发酵和灭活”中描述的灭活的猪肺炎支原体细胞配制。
T05:用于生长猪肺炎支原体的培养基的蛋白A处理。按照制造商的说明(即21g/L)制备PPLO(猪心衍生的),并将酵母提取物制备成21g/L,在USP中。然后将酵母提取物溶液以6.25%的浓度加入到PPLO中,加热至121℃并≥30分钟使混合物灭菌。将盐酸半胱氨酸制备成90g/L并过滤灭菌。在每升USP水中加入450g右旋糖,然后加热灭菌,制备右旋糖溶液。为了制备最终的培养基,向基础培养基中加入10%的猪血清,然后加入0.01%的半胱氨酸和1.0%的右旋糖。通过用蛋白A处理除去完整PPLO培养基中的抗体。简单来说,将1升rProtein A Sepharose(部件号17-5199-03GE Healthcare)装填到玻璃柱(10X 11.5cm)中。除去储存缓冲液后,用2倍柱体积的1M的醋酸处理柱。用5倍体积的50mM NaPO4,1M NaCl缓冲液(pH 7.0)平衡树脂。将15升完整的PPLO培养基以140cm/小时的线性流速装载到树脂上。收集柱流出液并通过0.2微米滤器(Sartorius)灭菌。被处理的培养基被用于繁殖如上述“发酵和灭活”所述的猪肺炎支原体细胞。将全部灭活培养物(包括细胞)配制成最终的疫苗。
T06:如上述实施例1“发酵和灭活”所述制备灭活的猪肺炎支原体细胞。灭活的发酵液在~20,000xg离心(Sorvall RC5B)30分钟,上清通过0.2uM过滤灭菌。115ml的rProtein A树脂(部件号12-1279-04,MAbSelect,GE Healthcare)被装填到色谱柱(5x6cm)中。除去储存缓冲液并用2倍柱体积的1M的醋酸处理后,用5倍体积的50mMNaPO4/1M NaCl缓冲液,pH 7.01平衡树脂。使大约1.2升澄清的/过滤的含有猪肺炎支原体抗原的液体以120cm/hr的流速流过蛋白A树脂。收集流出液并通过0.2μM滤器灭菌。
T07:如上述实施例1“发酵和灭活”所述制备灭活的猪肺炎支原体细胞。通过切向流过滤使灭活的发酵液澄清。简单来说,具有0.2μM标称孔径的聚醚砜滤器(GE HealthCare,部件号56-4102-71)用0.5N氢氧化钠溶液消毒,然后用无菌USP水大量冲洗。将灭活的支原体培养液以目标为14.6L/分钟的再循环速度引入该装置,跨膜压力为2-3.4PSI。在室温进行澄清。收集过滤透过液并储存于2-8C直至进一步处理。115ml的rProtein A树脂(部件号12-1279-04,MAbSelect,GEHealthcare)被装填到色谱柱(5x6cm)中。除去储存缓冲液并用2倍柱体积的1M的醋酸处理后,用5倍体积的50mM NaPO4/1M NaCl缓冲液,pH 7.01平衡树脂。使大约2.3升澄清的/过滤的含有猪肺炎支原体抗原的液体以120cm/hr的流速流过树脂。收集流出液并通过0.2μM滤器灭菌。
T08:如上述“发酵和灭活”所述制备灭活的猪肺炎支原体细胞。灭活的发酵液在~20,000xg离心(Sorvall RC5B)30分钟,上清通过0.2uM过滤灭菌。115ml的rProtein A树脂(部件号17-5199-03,GEHealthcare)被装填到色谱柱(5x6cm)中。除去储存缓冲液并用2倍柱体积的1M的醋酸处理后,用5倍体积的50mM NaPO4/1M NaCl缓冲液,pH 7.01平衡树脂。使大约1.2升澄清的/过滤的含有猪肺炎支原体抗原的液体以120cm/hr的流速流过蛋白A树脂。收集流出液并通过0.2μM滤器灭菌。
用根据上述处理T02-T08处理的M.hyo抗原配制试验性疫苗。T02,T03和T04相应于阳性对照。此外,处理T01相应于安慰剂(无菌盐水)。
这些试验性制剂在下述表11中描述。M.hyo抗原相应于来自完整M.hyo种子,蛋白A处理的上清的M.hyo抗原。“蛋白A处理”一列中的信息表示M.hyo上清在灭菌前或灭菌后是否用蛋白A处理。
表11 SP-油佐剂中的用于M.hyo效力研究的PCV2/M.hyo试验性
疫苗制剂
3周龄的猪被肌内接种单次剂量的上述表11中描述的不同疫苗制剂。每个处理组中包括18只动物。接种后21天用毒性M.hyo田间分离物对动物进行攻毒。攻毒后28天进行尸体解剖,取出肺并对与M.hyo感染一致的实变进行评分。图8(A&B)显示各个处理组的肺损伤评分。通过对每组的肺部评分进行混合模型分析确定统计学显著性。
图8A和8B中的肺损伤结果表明在所有处理中,只有两组(T07和T08)的100%的猪都属于<5%肺损伤的分类。应当注意在本研究中观察到强烈的统计学差异。
本实施例中的结果证明使用蛋白A处理的M.hyo上清并使用SP-油作为佐剂的单瓶PCV2/M.hyo试验性制剂具有显著的M.hyo效力。此外,上述实施例7证明使用蛋白A处理的M.hyo上清并使用SP-油作为佐剂的单瓶PCV2/M.hyo试验性制剂的PCV2效力。综合来看,M.hyo和PCV2二者的效力在使用蛋白A处理的M.hyo上清的单瓶PCV2/M.hyo组合中得到证明。
实施例10:试验性PCV2/M.hyo试验疫苗的体内安全性
行本研究以评价给予最小年龄(3周龄)的动物时,不同佐剂配方的以最大抗原剂量配制的试验性PCV2-M.hyo疫苗在宿主动物中的体内安全性。基于温度,注射部位反应和临床观察评价不同的佐剂平台以确定哪个平台提供可接受的安全性。20%SLCD/10%SP-油制剂被用作阳性(“不安全的”)对照,这是因为曾有过被本研究小组和其它人曾观察到的注射部位反应的历史事件。
液体的处理:
所有疫苗用实施例1中“发酵和灭活”中描述的灭活猪肺炎支原体抗原制备。M.hyo整体抗原被使用,因为已知其除了包含将会通过蛋白A处理被除去的免疫球蛋白和免疫复合物之外,还包含可溶性和不可溶M.hyo抗原。合理地推断不可溶细胞碎片和免疫球蛋白和免疫复合物的除去只会进一步增强疫苗制剂的安全性。本研究的目的是要严谨地检测包含PCV2抗原和M.hyo抗原的不同佐剂制剂的安全性。PCV2和M.hyo抗原以最大释放水平配制以进一步评估安全性。这些试验性制剂在下述表12中描述。IVP表示试验兽药(IVP)。
表12 用于安全性研究的PCV2/M.hyo试验性疫苗制剂
*M hyo抗原=来自完整M hyo种子(整体抗原)。
本研究中使用的安全性参数是直肠温度分布和注射部位反应。本研究的结果表明根据直肠温度分布和临床观察(结果未显示)所有候选佐剂平台都提供可接受的安全性。只有20%SLCD+10%SP-油(即阳性对照)显著不同于安慰剂疫苗并具有许多严重的注射部位反应(结果未显示)。
实施例11:用于重要研究的蛋白A处理的M.hyo抗原的制备
图9是流程图,显示用于制备PCV2相容的蛋白A处理的M.hyo抗原的一个实施方案。灭活的M.hyo全培养物通过切向流过滤进行细胞澄清。简单来说,具有0.45μM标称孔径的聚醚砜滤器(GEHealthCare,部件号56-4102-49)用0.5N氢氧化钠溶液消毒,然后用无菌USP水大量冲洗。将灭活的支原体培养液以目标为11.0L/分钟的再循环速度引入该装置,跨膜压力为~5PSI。在室温进行澄清。收集过滤透过液并储存于2-8℃直至进一步处理。
澄清之后,含抗原的液体用蛋白A树脂进行处理以减少抗体水平。简单来说,MAbSelect蛋白A树脂(GE Healthcare)被装填到高度为12cm的玻璃柱中。用5倍柱体积的50mM磷酸钠,250mM NaCl缓冲液(pH 7.0)平衡树脂。将等同于10倍柱体积的抗原以100cm/小时的线性流速装载到树脂上。收集流出液并通过0.2微米滤器灭菌。通过流过3倍柱体积的25mM pH3.7的乙酸盐溶液,然后流过4倍柱体积的1M的乙酸溶液使柱再生。分别通过PCV2特异性抗体ELISA和p46抗原定量ELISA测定最终抗原液中的抗-PCV2抗体和猪肺炎支原体抗原水平。
实施例12:针对PRRS病毒的杀病毒活性的评价
本实施例中的研究被设计用来评价不同佐剂平台针对PRRS病毒的杀病毒活性。最初的试验集中在单独的佐剂上(即制剂不包含PCV或M.hyo抗原)。PRRS杀病毒活性的佐剂评价显示在图10中。初步的杀病毒评估表明10%SP-油、0.2%卡波姆和2.5%爱菲金对PRRS病毒没有杀病毒作用。相反20%SLCD佐剂对PRRS病毒表现出杀病毒作用。
进行进一步的研究以评价用不同佐剂平台作为佐剂配制的PCV/M.hyo制剂是否对PRRS病毒没有杀病毒作用。这些结果显示在表13中,其中符号*表示那些疫苗系列对PRRSV具有杀病毒作用。
表13 用不同制剂进行的PRRS杀病毒检测的结果
*表示是杀病毒的(>0.7对数损失)
A-杀病毒检测对照GMT~5.53log/mL
B-杀病毒检测对照GMT~6.42log/mL
上述表13中的结果表明10%SP-油对PRRS病毒没有杀病毒作用。用10%SP-油作为佐剂制备其它PCV/M.hyo疫苗系列(表14)。下述表14中显示的结果进一步表明10%SP-油对于PRRS病毒没有杀病毒作用。表14中的检测样品值每个都比杀病毒检测对照高(+符号),对照的几何平均滴度(GMT)为大约5.9±0.5log/ml。
表14 用10%SP-油作为佐剂配制的不同PCV/M.hyo制剂的杀
病毒检测的结果
杀病毒检测对照GMT~5.9±0.5log/ml
本实施例的结果表明10%SP-油对PRRS病毒没有杀病毒作用。本实施例的结果进一步证明用10%SP-油作为佐剂配制的PCV/M.hyo制剂属于那些被认为对PRRS病毒没有杀病毒作用的疫苗系列(表13和表14)。因此,用10%SP-油作为佐剂配制的PCV/M.hyo制剂被认为是有效的平台,该平台可以作为包括PCV、M.hyo和PRRS病毒的三价组合的基础。
实施例13:PCV/M.hyo/PRRS组合疫苗的制备
用对PRRS病毒没有杀病毒作用的佐剂平台(见上述表13和14)作为佐剂配制的PCV/M.hyo制剂,在单瓶液体组合物中以即用型的方式被提供。这种单瓶PCV/M.hyo制剂使用蛋白A-处理的M.hyo上清。在这种使用M.hyo蛋白A-处理的上清的PCV2/M.hyo制剂中,M.hyo和PCV2的效力已得到证明(见实施例7-9)。在本实施例中,这种二价PCV2/M.hyo制剂与单价PRRS病毒抗原组合。
在一个实施方案中,10%SP-油中的并相应于上述表11中的疫苗系列L0711RK11、L0711RK12、L0711RK13和L0711RK14之一的PCV/M.hyo组合在单瓶液体组合物中以即用型的方式被提供。上述实施例12中的结果证明10%SP-油对PRRS病毒没有杀病毒作用。实施例12还证明用10%SP-油作为佐剂配制的PCV2/M.hyo制剂属于那些被认为对PRRS病毒没有杀病毒作用的疫苗系列。在本实施例中,这种单瓶PCV2/M.hyo液体组合物被用于使第二瓶中含有的冻干的基因修饰的活PRRS病毒组合物再水化,从而使得所有抗原在给适合年龄的猪(例如3周龄或更大)给药之前被包含在单个瓶中。
在一个实施方案中,PRRS病毒具有相应于SEQ ID NO:16的基因组序列或其变体。在另一个实施方案中,三价组合物中使用的PRRS病毒是被称为ISU-55的PRRS病毒分离物,其被保藏在ATCC,保藏号为VR 2430。各个抗原的合适的量在本文中被描述。符合期望的是,所有抗原以单次剂量被给药给猪。
实施例14:用PCV2攻毒的PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗的PCV2效力评价
本研究被设计以评价试验性PCV2/M.hyo/PPRS组合疫苗的PCV1-2嵌合体、灭活病毒级分的效力,其被肌内给药给3周龄的猪一次,并在接种后三周用毒性PCV2分离物攻毒。这些三价疫苗包括猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒、呼吸和繁殖综合征疫苗、呼吸形式、修饰的活病毒以及猪肺炎支原体细菌提取物。
该三价组合通过用包含猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒和M.hyo细菌提取物(PCV2/M.hyo)的组合的单瓶液体制剂使冻干的基因修饰的活PRRS病毒(PRRS-MLV)再水化来制备,所述单瓶液体制剂用10%SP-油作为佐剂配制(参见上述实施例13)。在本研究的过程中给药的试验性制剂如下述表15所述。
表15 用于PCV2效力研究的PCV2/M.hyo/PRRS试验性疫苗制剂
IVP=试验兽药
CP=对照产品
IM=肌内
IN=鼻内
1%=PCV2抗原,RU/mL=M hyo抗原,log10 TCID50=PRRSV抗原
3周龄的猪被肌内接种单次剂量的上述表15中描述的不同疫苗制剂。每个处理组包括24只动物。接种后21天用毒性PCV2a分离物对动物进行攻毒。
本研究中观察到的PCV2病毒血症结果(PCV2定量PCR)显示于图11中。应当注意,PCV2病毒血症被用作主要的效力变量。PCV2病毒血症结果显示为DNA拷贝数/ml。如图11所示,在第28、35和42天(攻毒是第21天),所有的处理与安慰剂相比都具有显著减少的病毒血症(P<0.001)。
还监测PCV2血清学、PCV2粪便脱落、淋巴损耗和免疫组化(IHC)作为第二效力变量。这些结果将会在下面描述。
PCV2血清学结果显示在图12中,其显示了本研究的第1、7、13、20、28、35和42天(攻毒是在第21天)的PCV2ELISA结果。每个样品的状态表示为样品对阳性的比值(S/P)。这些结果显示,相对于安慰剂组,两个处理组均具有显著较高的攻毒后PCV2抗体滴度(P<0.0345)。
T02和T03处理相对于安慰剂(T01)获得的PCV2粪便脱落显示在图13中。这些结果表示为PCV2DNA拷贝数/ml。图13中的结果表明在第35和42天,当与安慰剂相比时,T02和T03处理都具有显著较少的粪便脱落(P<.0001)。
下述表16显示,与安慰剂相比,用试验性处理(T02)获得对于淋巴损耗的显著保护。
表16 PCV2组织病理学(淋巴耗损)
下述表17中的结果显示,与安慰剂相比,用试验性处理(T02)获得的对于组织细胞替换的显著保护。
表17 PCV2组织病理学(组织细胞替换)
下述表18显示,与安慰剂相比,用试验性处理获得的免疫组化。两个疫苗(T02和T03)都显示对于PCV2抗原在淋巴组织中的建群的显著保护(P<0.0059)。
表18 PCV2组织病理学(免疫组化)
总之,本实施例的结果证明,本研究中的试验性疫苗提供对于PCV2攻毒的保护。两种疫苗的功效水平均对主要变量和PCV2建群提供显著保护。但是,T02组还针对PCV2损伤(淋巴损耗和组织细胞替换)提供显著保护。
实施例15:用M.hyo攻毒的PCV2/M.hyo/PRRS组合疫苗的M.hyo效力评价
本研究被设计以评价试验性PCV2/M.hyo/PPRS组合疫苗的M.hyo级分的效力,其被肌内给药给3周龄的易感猪一次,并在接种后三周用毒性猪肺炎支原体分离物攻毒。这些三价疫苗包括猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒、呼吸和繁殖综合征疫苗、呼吸形式、修饰的活病毒以及猪肺炎支原体细菌提取物。
液体的处理:
对于每个如下所述的处理组,使用灭活的、澄清的M.hyo发酵液(如上述实施例11所述)。
T01:由不含猪肺炎支原体抗原的PCV1-2疫苗组成的阴性对照处理,其在冻干的PRRSV修饰的活疫苗中被用作稀释剂。
T02:灭活的猪肺炎支原体抗原与猪圆环病毒(1型-2型嵌合体,或PCV1-2,灭活病毒)组合成单瓶形式。PCV1-2/M.hyo组合在冻干的PRRSV修饰的活疫苗中被用作稀释剂。
T03:如上述实施例11所述并在额外步骤中通过分子过滤将抗原浓缩20X的灭活的猪肺炎支原体抗原,与猪圆环病毒(1型-2型嵌合体,或PCV1-2,灭活病毒)组合成单瓶形式。PCV1-2/M.hyo组合在冻干的PRRSV修饰的活疫苗中被用作稀释剂。
这些试验性制剂在下述表19中描述。在表19中,CP是对照产品,IVP是试验兽药。M.hyo抗原相应于来自完整M.hyo种子、蛋白A处理的上清的M.hyo抗原。
表19 用于M.hyo效力研究的PCV2/M.hyo/PRRS试验性疫苗制剂
3周龄的猪被肌内接种单次剂量的上述表19中描述的不同疫苗制剂。接种后20天用毒性M.hyo田间分离物对动物进行攻毒。在T01和T03组中用二十五只动物完成研究,在T02组中用24只动物完成研究。攻毒后28天进行尸体剖检,取出肺并对与M.hyo感染一致的实变进行评分。下述表20包含各个处理组的肺损伤评分。通过对每组的肺部评分进行混合模型分析确定统计学显著性。
表20 M.hyo肺损伤
与阴性对照组(T01)相比,处理组T03证明与T01相比在具有损伤的肺的百分比上有显著减少(P≤0.05)。T02的肺损伤百分比与T01或T03没有显著不同。
本实施例的结果证明,本研究中使用的试验性三价疫苗制剂(T03处理)提供针对M.hyo攻毒的显著效力。
实施例16:PCV/M.hyo/PRRS组合疫苗的PRRSV效力的评价
本研究被设计用于评价试验性PCV2/M.hyo/PPRS组合疫苗的PRRSV级分的效力。
研究概述:
在第0天,选择大约102头临床健康的、三周龄的、对PRRSV、SIV和猪肺炎支原体为血清阴性的并且通过PCR检查没有PCV病毒血症的猪,并分到(阻断产仔)四个处理组(每组24头)之一中或标记(NTX)组(6)中。猪被进行单次的2mL肌内(IM)剂量的试验性猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒疫苗-猪肺炎支原体细菌提取物(T01)、或试验性猪圆环病毒1-2型嵌合体-呼吸与繁殖综合征疫苗、呼吸形式、修饰的活的和灭活的病毒-猪肺炎支原体细菌提取物(T02、T03和T04)的给药。在本研究的疫苗接种阶段,NTX组动物与处理组圈养在不同的围栏中。接种后四周,在再圈养处理组之前,对NTX猪实施安乐死并进行尸体剖检,以确认没有PRRSV肺损伤。所有处理的猪用毒性PRRSV攻毒株(NADC20)进行攻毒。在攻毒后10天对所有剩下的猪实施安乐死并进行尸体剖检。尸体剖检时,对肺的每个肺叶(左侧头部,左侧中部,左侧尾部,右侧头部,右侧中部,右侧尾部,和附件)的实变百分比进行评分并记录为观察到的具有损伤的肺叶的百分比。在攻毒之前检测T01猪的PRRSV阴性状态(IDEXX ELISA)。在研究持续过程中每天记录临床观察一次,在攻毒前和尸体剖检时称体重。
试验性试剂在下述表21中描述。M.hyo抗原对照批次如上述实施例11所述制备。PCV2抗原是如上述实施例2所述制备的灭活的cPCV1-2抗原。在嵌合病毒灭活之前,PCV2抗原批次被浓缩20X并且用平衡盐溶液洗涤浓缩物。PCV/M.hyo单瓶制剂(用10%SP油作为佐剂配制)被用于使冻干的修饰的或PRRSV再水化。
T01:高代猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒(1.65%的20X浓缩抗原批次)和猪肺炎支原体细菌提取物(剂量-9.0RP;153RU/mL)的试验性制备物。T01制备物相应于系列号L0912RK12(PCV/M.hyo)并且是阴性对照(无PRRSV抗原)。
T02:高代猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒(1.65%的20X浓缩抗原批次)和猪肺炎支原体细菌提取物(剂量-9.0RP;153RU/mL)的试验性制备物和高代猪繁殖与呼吸综合征疫苗呼吸形式、修饰的活病毒(MID(≤2.5logs)的试验性制备物。T02制备物相应于系列号L0912RK12(PCV/M.hyo)+(PPRS MLV,以MID≤2.5log)。
T03:高代猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒(1.65%的20X浓缩抗原批次)和猪肺炎支原体细菌提取物(剂量-9.0RP;153RU/mL)的试验性制备物和高代猪繁殖与呼吸综合征疫苗呼吸形式、修饰的活病毒(MID(≤3.0logs)的试验性制备物。T03制备物相应于系列号L0912RK12(PCV/M.hyo)+(PPRS MLV,以MID≤3.0log)。
T04:高代猪圆环病毒1型-2型嵌合体、灭活病毒(1.65%的20X浓缩抗原批次)和猪肺炎支原体细菌提取物(剂量-9.0RP;153RU/mL)的试验性制备物和高代猪繁殖与呼吸综合征疫苗呼吸形式、修饰的活病毒(MID(≤3.5logs)的试验性制备物。T04制备物相应于系列号L0912RK12(PCV/M.hyo)+(PPRS MLV,以MID≤3.5log)。
这些试验性制剂在下述表21中描述,M.hyo抗原相应于来自完整M.hyo种子、蛋白A处理上清的M.hyo抗原。PRRSV制备物的系列编号有待确定(TBD)。
表21 研究设计
1试验兽药(IVP)=用10%SP油作为佐剂配制的猪圆环病毒1-2型嵌合体(PCV2),灭活病毒疫苗-猪肺炎支原体(M hyo)细菌提取物(稀释的)-猪繁殖与呼吸综合征疫苗,呼吸形式,修饰的活病毒(PRRSV)
对照产品(CP)=猪圆环病毒1-2型嵌合体(PCV2),灭活病毒疫苗-猪肺炎支原体(M hyo)细菌提取物-无猪繁殖与呼吸综合征疫苗级分;用10%SP油作为佐剂配制
IM=肌内
NA=不适用
Claims (27)
1.一种三价免疫原性组合物,其包含猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分;猪圆环病毒2型(PCV2)抗原;和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒抗原,其中M.hyo制备物的可溶性部分基本上不含(i)IgG和(ii)由抗原与免疫球蛋白结合形成的免疫复合物。
2.权利要求1的组合物,其中所述M.hyo全细胞制备物的可溶性部分在被加入到免疫原性组合物之前已用蛋白-A或蛋白-G进行处理。
3.权利要求1或权利要求2的组合物,其中所述M.hyo制备物的可溶性部分和所述PCV2抗原是即用型液体组合物的形式。
4.权利要求1至3任一项的组合物,其中所述PRRS病毒抗原是基因修饰的活病毒。
5.权利要求4的组合物,其中所述基因修饰的活PRRS病毒是冻干组合物的形式。
6.权利要求1至5任一项的组合物,其中所述M.hyo制备物的可溶性部分包含至少一种M.hyo蛋白抗原。
7.权利要求6的组合物,其中所述M.hyo制备物的可溶性部分包含两种或更多种M.hyo蛋白抗原。
8.权利要求1至7任一项的组合物,其中所述组合物在猪中引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。
9.权利要求1至8任一项的组合物,其中所述PCV2抗原是嵌合1型-2型圆环病毒的形式,所述嵌合病毒包含灭活的表达猪圆环病毒2型ORF2蛋白的重组猪圆环病毒1型。
10.权利要求1至8任一项的组合物,其中所述PCV2抗原是重组ORF2蛋白的形式。
11.权利要求10的组合物,其中所述重组ORF2蛋白从杆状病毒载体表达。
12.权利要求1至11任一项的组合物,其中所述组合物进一步包含佐剂。
13.权利要求12的组合物,其中所述佐剂选自水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂及其组合。
14.权利要求1至13任一项的组合物,其中所述组合物进一步包含药学可接受的载体。
15.权利要求1至14任一项的组合物,其中所述组合物当以单次剂量给药的形式进行给药时,引发针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的保护性免疫反应。
16.一种免疫猪以抵抗M.hyo、PCV2和PRRS病毒的方法,其包括给猪施用权利要求1的组合物。
17.权利要求16的方法,其中所述组合物被肌内、皮内、经皮或皮下给药。
18.权利要求16或17的方法,其中所述组合物以单次剂量的形式给药。
19.权利要求16-18任一项的方法,其中所述组合物被给药给具有来自母体的针对M.hyo、PCV2和PRRS病毒的至少一种的抗体的猪。
20.权利要求16-19任一项的方法,其中所述组合物被给药给3周龄或更大的猪。
21.一种试剂盒,其包含:第一瓶,所述第一瓶包含组合物,所述组合物包含PCV2抗原和猪肺炎支原体(M.hyo)全细胞制备物的可溶性部分,其中M.hyo全细胞制备物的可溶性部分基本不含(i)IgG和(ii)抗原/免疫球蛋白免疫复合物;和第二瓶,所述第二瓶包含PRRS病毒抗原。
22.权利要求21的试剂盒,其中所述试剂盒的所述第一瓶中的所述组合物以即用型液体组合物的形式提供。
23.权利要求21或权利要求22的试剂盒,其中所述第二瓶中的所述PRRS病毒抗原是冻干组合物的形式。
24.权利要求21至23任一项的试剂盒,其中所述试剂盒进一步包括提供关于将第一瓶的内容物与第二瓶的内容物组合的说明的使用说明书。
25.权利要求24的试剂盒,其中所述使用说明书进一步包括将组合的第一和第二瓶的内容物给药给猪的说明。
26.一种制备免疫原性组合物的方法,所述方法包括:
i)在合适的培养基中培养M.hyo 18-144小时的时间;
ii)随后灭活M.hyo培养物;
iii)收获灭活的培养液,其中所述灭活的培养液包含M.hyo全细胞制备物,所述全细胞制备物包含可溶性液体级分和不可溶细胞物质;
iv)从不可溶细胞物质分离可溶性液体级分;
v)从分离的可溶性液体级分基本上除去IgG和抗原/免疫球蛋白免疫复合物,以形成M.hyo全细胞制备物的可溶性级分;以及
vi)随后将所述M.hyo全细胞制备物的可溶性部分与PCV2抗原和PRRS病毒抗原组合。
27.权利要求26的方法,其中vi)包括将包含PCV2抗原和M.hyo可溶性部分的即用型液体组合物与冻干的PRRS病毒抗原组合。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261620189P | 2012-04-04 | 2012-04-04 | |
US61/620,189 | 2012-04-04 | ||
PCT/US2013/035091 WO2013152086A1 (en) | 2012-04-04 | 2013-04-03 | Pcv/mycoplasma hyopneumoniae/prrs combination vaccine |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN104271153A true CN104271153A (zh) | 2015-01-07 |
CN104271153B CN104271153B (zh) | 2018-08-31 |
Family
ID=
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107349424A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-11-17 | 南京大爻网络科技有限公司 | 一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法 |
CN108697782A (zh) * | 2016-03-23 | 2018-10-23 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对pcv2病毒和猪肺炎支原体感染的组合疫苗 |
CN108883169A (zh) * | 2016-03-23 | 2018-11-23 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对pcv2和prrs病毒感染的皮内应用疫苗 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1181761A (zh) * | 1995-03-16 | 1998-05-13 | 墨尔本大学 | 抗支原体的抗原组合物 |
CN101980720A (zh) * | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
WO2011141443A1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Intervet International B.V. | Vaccine against mycoplasma hyopneumoniae, suitable for administration in the presence of maternally derived antibodies |
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1181761A (zh) * | 1995-03-16 | 1998-05-13 | 墨尔本大学 | 抗支原体的抗原组合物 |
CN101980720A (zh) * | 2008-01-23 | 2011-02-23 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | Pcv2猪肺炎支原体致免疫组合物及其制备方法 |
WO2011141443A1 (en) * | 2010-05-11 | 2011-11-17 | Intervet International B.V. | Vaccine against mycoplasma hyopneumoniae, suitable for administration in the presence of maternally derived antibodies |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108697782A (zh) * | 2016-03-23 | 2018-10-23 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对pcv2病毒和猪肺炎支原体感染的组合疫苗 |
CN108883169A (zh) * | 2016-03-23 | 2018-11-23 | 英特维特国际股份有限公司 | 针对pcv2和prrs病毒感染的皮内应用疫苗 |
US11654191B2 (en) | 2016-03-23 | 2023-05-23 | Intervet Inc. | Vaccine for intradermal application against PCV2 and PRRS virus infection |
CN107349424A (zh) * | 2017-06-05 | 2017-11-17 | 南京大爻网络科技有限公司 | 一种猪繁殖与呼吸综合征、猪支原体肺炎二联活疫苗及其制备方法 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104271154B (zh) | 猪肺炎支原体疫苗 | |
CN104334186B (zh) | Pcv/猪肺炎支原体组合疫苗 | |
US9650601B2 (en) | PCV/mycoplasma hyopneumoniae/PRRS combination vaccine | |
CN105579060A (zh) | Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法 | |
CN104271153B (zh) | Pcv/猪肺炎支原体/prrs组合疫苗 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20151014 Address after: American New Jersey Applicant after: ZOETIS LLC Address before: American New Jersey Applicant before: Shuoteng Co., Ltd. |
|
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |