CN102793927A - 一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法和应用。该耐热冻干保护剂由海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶、谷氨酸钠、D-山梨醇、多聚蛋白胨、L-精氨酸、维生素C和注射用水组成,经溶解、除菌制得。将该耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:(0.8~1.2)的体积比混合,分装后冷冻干燥即得猪瘟活疫苗。本发明制备的耐热冻干保护剂配方简单,制备容易,适于大规模生产,对疫苗具有良好的保护功效。制备得到的疫苗安全无菌、质量稳定,具有耐热、保存时间长的特点,解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不方便等问题。本发明的耐热冻干保护剂可以使猪瘟活疫苗在2℃~8℃条件下保存30个月以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒活疫苗的保护剂,具体涉及一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法和应用,属动物用病毒活疫苗制造领域。
背景技术
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的一种高度接触性传染病,具有流行广泛、发病率高等特点,对养猪业危害极大。猪瘟病毒是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员,为有囊膜的正链RNA病毒。
预防猪瘟最有效的方法就是接种猪瘟疫苗。目前市场上预防猪瘟的疫苗主要有三种:乳兔苗、细胞苗和淋脾苗。然而,疫苗在运输过程中需要冷藏保存,冷藏条件为-15℃,在我国一些经济不发达地区,运输条件很难要求,由此造成的疫苗失活、免疫失败以致疫病爆发,为我国带来了巨大的经济损失。
冻干保护剂及其制备方法是活疫苗生产工艺中的一项关键技术,对疫苗的保存、运输和使用均产生影响。目前国内常用的保护剂主要由牛奶、蔗糖、明胶等组成,组方简单,保护功能差,而国外对疫苗保护剂的研究技术较为保密,因此,使得我国成品疫苗的长期保存和运输受到了较大的限制。
影响冻干保护剂保护性能的因素主要来自两方面:一是微生物因素,微生物的种类和结构差异(如病毒有无囊膜)、培养方法的选择以及疫苗的种类等;二是保护剂的配方,选用保护剂的原料及其性质、原料配比及与该疫苗适应的冻干曲线等。在选择冻干保护剂的组方时,要考虑上述几种主要因素,选择合适的组方与搭配,并通过反复验证制定冻干曲线。
猪瘟病毒对热、酸敏感,在存放和运输过程中容易受到环境中温度和酸碱度的影响,因此,需要选择一种合适的病毒保护剂,能够在不同保存条件下有效的防止病毒遭受破坏,保持病毒滴度,以延长病毒的存放期。耐热冻干保护与常规冻干保护剂又有不同,它较多得考虑了生物活性制品在高温、长时间保存条件下冻干物质理化性质的改变对活疫苗存活的影响。因此,研制一种配方简单、适于大规模生产、保护功能强的猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂。
本发明的另一个目的是提供一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法。
同时,本发明还提供一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的应用。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖5~10%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2~3%,明胶1~2%,谷氨酸钠1~3%,D-山梨醇2~5%,多聚蛋白胨4~5%,L-精氨酸0.5~1%,维生素C 0.5~1%,余量为灭菌后的注射用水。
一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂的制备方法,具体步骤如下:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,灭菌后备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用,包括:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:(0.8~1.2)的体积比混合,加入抗生素,分装,冷冻干燥。
所述的抗生素为氨苄青霉素、硫酸链霉素中的一种。
所述的氨苄青霉素的加入量为每毫升10000~20000U。
所述的硫酸链霉素的加入量为每毫升10~20mg。
所述冷冻干燥的具体步骤为:将混合液置入0℃~4℃的冻干箱中,以1℃~2℃/min的降温速率降至-30℃~-40℃,在此温度下维持3~4h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,在16~24h范围内升至-8℃~-4℃,再以5℃~8℃/h的升温速率升至20℃~25℃,在此温度下维持3~6h。
本发明的有益效果是:
本发明的耐热冻干保护剂配方简单,制备容易,适于大规模生产,对疫苗具有良好的保护功效。制备得到的疫苗无菌安全、且性状稳定,具有耐热、保存时间长的特点,解决了疫苗在运输过程中需要低温冷冻、贮存不方便等问题。本发明的耐热冻干保护剂可以使猪瘟活疫苗在2℃~8℃条件下保存30个月以上。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明,但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖5%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2%,明胶1%,谷氨酸钠1%,D-山梨醇2%,多聚蛋白胨4%,L-精氨酸0.5%,维生素C 0.5%,余量为灭菌后的注射用水。
耐热冻干保护剂的具体制备步骤为:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,110℃灭菌30min备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:0.8的体积比混合,按照1mL混合液10000U的量加入氨苄青霉素,分装,冷冻干燥。
具体冷冻干燥步骤为:将混合液置入0℃的冻干箱中,以1℃/min的降温速率降至-30℃,在此温度下维持4h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,24h升至-8℃,再以5℃/h的升温速率升至20℃,在此温度下维持6h。
实施例2
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖8%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2.5%,明胶1.5%,谷氨酸钠2%,D-山梨醇3.5%,多聚蛋白胨4.5%,L-精氨酸0.75%,维生素C 0.75%,余量为灭菌后的注射用水。
耐热冻干保护剂的具体制备步骤为:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,116℃灭菌20min备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:1的体积比混合,按照1mL混合液20000U的量加入氨苄青霉素,分装,冷冻干燥。
具体冷冻干燥步骤为:将混合液置入4℃的冻干箱中,以2℃/min的降温速率降至-40℃,在此温度下维持3h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,16h升至-4℃,再以8℃/h的升温速率升至22℃,在此温度下维持4h。
实施例3
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖10%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)3%,明胶2%,谷氨酸钠3%,D-山梨醇5%,多聚蛋白胨5%,L-精氨酸1%,维生素C1%,余量为灭菌后的注射用水。
耐热冻干保护剂的具体制备步骤为:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,120℃灭菌15min备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:1.2的体积比混合,按照1mL混合液10mg的量加入硫酸链霉素,分装,冷冻干燥。
具体冷冻干燥步骤为:将混合液置入2℃的冻干箱中,以1℃/min的降温速率降至-35℃,在此温度下维持3.5h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,20h升至-6℃,再以6℃/h的升温速率升至25℃,在此温度下维持3h。
实施例4
猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖5%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2.5%,明胶1.5%,谷氨酸钠3%,D-山梨醇5%,多聚蛋白胨5%,L-精氨酸1%,维生素C 1%,余量为灭菌后的注射用水。
耐热冻干保护剂的具体制备步骤为:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,120℃灭菌20min备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
耐热冻干保护剂在制备猪瘟活疫苗方面的应用:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:1的体积比混合,按照1mL混合液20mg的量加入硫酸链霉素,分装,冷冻干燥。
具体冷冻干燥步骤为:将混合液置入0℃的冻干箱中,以2℃/min的降温速率降至-40℃,在此温度下维持3h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,16h升至-8℃,再以7℃/h的升温速率升至20℃,在此温度下维持5h。
成品检验
试验材料
试验组:试验组1:按照实施例1制备的猪瘟活疫苗;试验组2:按照实施例2制备的猪瘟活疫苗;试验组3:按照实施例3制备的猪瘟活疫苗;试验组4:按照实施例4制备的猪瘟活疫苗。
对照组:对照组1:常规的由5%的蔗糖脱脂乳配制的普通冻干保护剂配制的猪瘟活疫苗;对照组2:进口猪瘟活疫苗。
空白对照组:为灭菌后的注射用水。
试验动物:21~30日龄的仔猪若干头。
猪瘟病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒:购自南京奥多福尼生物科技有限公司。
1.无菌检验
无菌检验方法:将试验组2、3、4的疫苗和空白对照组分别接种于常规培养基中,每个组平行接种10个,将上述培养基置于37℃恒温箱中培养过夜,培养24~72h后镜检观察。
检验结果:接种试验组2、3、4和空白对照的培养基表面经镜检均无菌落产生,无菌检验为阴性,表明本发明制备得到的疫苗无菌、安全。
2.性状检验
性状检验方法:将试验组1、3、4的疫苗保存在2℃~8℃条件下,于保存期的第6个月、第12个月、第18个月、第24个月、第30个月定期取出观察其性状。
检验结果:上述条件下保存的疫苗在30个月内性状均没有发生变化,表明本发明制备得到的疫苗性状稳定、质量可靠。
3.疫苗保存期试验
试验方法:将试验组1、2、3的疫苗和对照组1、2的疫苗保存在2℃~8℃条件下于保存期的第6个月、第12个月、第18个月、第24个月、第30个月,以及37℃条件下,与保存期的第7天、第15天将试验组和对照组的疫苗分别取出,用注射用水稀释至1头份/mL,肌肉接种仔猪,间隔7~14天同剂量再免疫一次,分别于免疫后的第21天进行耳静脉采用,用猪瘟病毒IgG抗体ELISA试剂盒测定血清抗体效价。
血清抗体效价判定标准如下:
阴性对照:正常情况下,阴性对照孔OD450值≤0.15;阳性对照:正常情况下,阳性对照孔OD450值≥0.5。结果判定:样品OD450值大于0.38,判为阳性;样品OD450值在0.2到0.38之间,判为可疑;样品OD450值小于0.2,判为阴性。
实验结果
在2℃~8℃和37℃保存条件下,血清抗体效价的测定结果见表1、2。
表12℃~8℃保存条件下的血清抗体效价
表237℃保存条件下的血清抗体效价
由表1、2可知,不同温度条件下,相同保存期的试验组疫苗均较对照组疫苗的血清抗体效价高。同时,随着保存期的延长,试验组疫苗的血清抗体效价下降较为缓慢,而对照组疫苗的效价骤降。
在2℃~8℃保存条件下,试验组疫苗在保存30个月时的血清抗体效价判定为阳性,有免疫活性,而对照组1疫苗在保存6个月时的OD450值已下降为0.38,保存18个月后的效价判定为阴性,丧失免疫活性;对照组2疫苗在保存期30个月时的OD450值即降为0.630,保存期30个月的效价判定为阴性,丧失免疫活性。在37℃保存条件下,试验组疫苗在保存15天时的OD450值维持在0.574~0.740范围,血清抗体效价判定为阳性,而对照组1的OD450值为0.380,判定为可疑,对照组2的OD450值为0.413,判定为阳性。
综上可知,不同温度条件下,本发明制备的猪瘟活疫苗较普通疫苗对机体的免疫保护率高,且本发明制备疫苗的保存时间长,对保存环境的要求不苛刻,在2℃~8℃条件下保存30个月以上。同时表明本发明制备的耐热冻干保护剂对疫苗具有良好的保护功效,本发明制备的猪瘟疫苗具有良好的耐热性和稳定性。
Claims (7)
1.一种猪瘟活疫苗耐热冻干保护剂,其特征在于,由以下重量百分含量的组分组成:海藻糖5~10%,聚乙烯吡咯烷酮(PVP)2~3%,明胶1~2%,谷氨酸钠1~3%,D-山梨醇2~5%,多聚蛋白胨4~5%,L-精氨酸0.5~1%,维生素C 0.5~1%,余量为注射用水。
2.一种如权利要求1所述的耐热冻干保护剂的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)按所述重量配比称取聚乙烯吡咯烷酮、明胶、D-山梨醇、多聚蛋白胨溶于少量注射用水中,灭菌后备用;
(2)按所述重量配比称取海藻糖、谷氨酸钠、L-精氨酸、维生素C溶于少量注射用水中,过滤除菌后备用;
(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液混合,加注射用水至全量即得。
3.一种如权利要求1所述的耐热冻干保护剂在制备猪瘟疫苗方面的应用,其特征在于,包括:将本发明耐热冻干保护剂与猪瘟病毒抗原液以1:(0.8~1.2)的体积比混合,加入抗生素,分装,冷冻干燥。
4.根据权利要求3所述的耐热冻干保护剂在制备猪瘟疫苗方面的应用,其特征在于,所述的抗生素为氨苄青霉素、硫酸链霉素中的一种。
5.根据权利要求4所述的耐热冻干保护剂在制备猪瘟疫苗方面的应用,其特征在于,所述的氨苄青霉素的加入量为每毫升10000~20000U。
6.根据权利要求4所述的耐热冻干保护剂在制备猪瘟疫苗方面的应用,其特征在于,所述的硫酸链霉素的加入量为每毫升10~20mg。
7.根据权利要求3所述的耐热冻干保护剂在制备猪瘟疫苗方面的应用,其特征在于,所述的冷冻干燥的具体步骤为:将混合液置入0℃~4℃的冻干箱中,以1℃~2℃/min的降温速率降至-30℃~-40℃,在此温度下维持3~4h,开启真空泵,至箱内真空度达0.01mber时开始升温,在16~24h范围内升至-8℃~-4℃,再以5℃~8℃/h的升温速率升至20℃~25℃,在此温度下维持3~6h。
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