CN111700865A - 一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于活疫苗保护剂技术领域，具体涉及一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种活疫苗保护剂，包括水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、抗坏血酸钠、L‑谷氨酸钠、199培养基和注射用水。本发明提供的活疫苗保护剂能够增加细菌存活率和保存期，提高活疫苗保护剂在高温条件下对细菌的保护功能；还能避免因活疫苗保存不当，引起动物过敏和免疫失败的情况。

Description

一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于活疫苗保护剂技术领域，具体涉及一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
细菌等活性生物及其相关制品的热敏感性一直是活疫苗长期保存的技术瓶颈。我国幅员辽阔，气候差异大，经济水平层次不齐，疫苗运输、使用过程中短期暴露高温环境(甚至40℃以上)的现象依然存在，所以对活疫苗的耐热性能提出了较高的要求。
现阶段，在疫苗制备过程中，在细菌性活疫苗中传统的冻干保护剂主要是蔗糖、明胶保护剂，组方简单，冻干存活率低，保护功能较差(尤其在较高温度下)，保存期短。应用此类保护剂所制得疫苗，在使用过程中存在保存条件严格，不耐热。若保存方法不当，可导致疫苗的细菌存活率下降、甚至大多数菌体死亡或崩解产生的内毒素，是产生过敏反应的因素之一；另外低温保存给边远地方储运和使用带来困难。因疫苗保存不当，引起动物过敏而致死，造成免疫失败，达不到保护动物的效果。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种活疫苗、活疫苗冻干粉、活疫苗保护剂及其制备方法和应用，本发明提供的活疫苗保护剂能够增加细菌存活率和保存期，提高活疫苗保护剂在高温条件下对细菌的保护功能；还能避免因活疫苗保存不当，引起动物过敏和免疫失败的情况。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种活疫苗保护剂，包括水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、抗坏血酸钠、L-谷氨酸钠、199培养基和注射用水；每100mL活疫苗保护剂含水溶性明胶1.5～9g、低聚糖5～30g、山梨醇1～24g、聚乙烯吡咯酮0.1～6g、抗坏血酸钠0.5～12g、L-谷氨酸钠0.5～18g和199培养基0.5～3g。
优选的，所述低聚糖为蔗糖。
本发明提供了上述技术方案所述的活疫苗保护剂的制备方法，包括以下步骤：
将水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮和第一剩余注射用水混合高温灭菌，得第一原料；
将L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、199培养基和第二剩余注射用水混合过滤后，得第二原料；
将第一原料与第二原料混合后，不足部分由第三注射用水补足，得活疫苗保护剂。
优选的，所述高温灭菌的温度为116～118℃，时间为15min～25min。
本发明提供了上述技术方案所述活疫苗保护剂或上述技术方案所述制备方法得的活疫苗保护剂在提高牦牛副伤寒活疫苗耐热性中的应用。
本发明提供一种活疫苗，所述活疫苗包括菌种和上述技术方案所述活疫苗保护剂或上述技术方案所述制备方法得的活疫苗保护剂；所述菌种为都柏林沙门氏菌STM8002-550株(张晓明，兀征，李惠菊，李光喜，程艳书.牦牛副伤寒弱毒菌株培育及其免疫的研究,中国兽医科技，1991)。在本发明中，所述都柏林沙门氏菌STM8002-550株由甘肃省畜牧兽医研究所保藏和提供。
本发明提供了上述技术方案所述的活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液接种于培养基培养，得发酵菌液；
将所述发酵菌液离心后，得菌泥；
将菌泥与生理盐水混合，得制苗用菌液；
将活疫苗保护剂与制苗用菌液按比例混合均匀，得活疫苗。
优选的，所述培养基包括营养肉汤培养基；所述接种的接种量为培养基体积的1％～3％；所述活疫苗保护剂与制苗用菌液的体积比为1～1：1～5。
本发明还提供了一种活疫苗冻干粉，所述活疫苗冻干粉的制备方法包括将上述技术方案所述活疫苗进行干燥，得活疫苗冻干粉。
优选的，所述干燥包括真空冷冻干燥；所述真空冷冻干燥的程序为：所述真空冷冻干燥包括第一冷冻干燥、第二冷冻干燥和第三冷冻干燥；所述第一冷冻干燥的温度为-40℃以下，真空度为0mpa，时间为1.5～3.5h；所述第二冷冻干燥的温度为-15～-4℃，真空度为10～25mpa，时间为12h～18h；所述第三冷冻干燥的温度为20～28℃，真空度为10～25mpa，时间为7h～10h。
本发明提供了一种活疫苗保护剂，包括水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、抗坏血酸钠、L-谷氨酸钠、199培养基和注射用水；每100mL活疫苗保护剂含水溶性明胶1.5～9g、低聚糖5～30g、山梨醇1～24g、聚乙烯吡咯酮0.1～6g、抗坏血酸钠0.5～12g、L-谷氨酸钠0.5～18g和199培养基0.5～3g。本发明提供的活疫苗保护剂，其成分及含量的合理搭配，使得活疫苗耐热、耐储存。耐热物质中的聚乙烯吡咯酮k30在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，起到支撑填充作用；低聚糖能渗入细胞内，降低因冷冻而增加的渗透压，而且能保护细菌细胞膜，让细菌处于休眠状态，降低细菌干燥和保存期的生命活动，进而大大加强其耐热性能，可以提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，还能起到低温保护功能和脱水保护作用；水溶性明胶是高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架，阻断热传导和热辐射；不耐热物质L-谷氨酸钠是蛋白质的基本构成单位，也是最好的填充剂；抗坏血酸钠阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质；山梨醇可提高冻干过程中水分子的升华速率，提高冻干制品的稳定性；199培养基中小分子氨基酸能够减缓溶液pH值的变化，保护活性组分不受破坏；199培养基中磷酸二氢钾、磷酸氢二钠在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品pH值调整到活性物质最稳定区域；本发明提供的活疫苗保护剂在上述组分共同作用下，能够增加细菌存活率和保存期，提高了活疫苗保护剂在高温条件下对细菌的保护功能；还能避免因活疫苗保存不当，引起动物过敏和免疫失败的情况。试验结果表明，采用本发明提供的活疫苗保护剂具有良好的耐热保护效果。
具体实施方式
本发明提供了一种活疫苗保护剂，包括水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、抗坏血酸钠、L-谷氨酸钠、199培养基和注射用水；每100mL活疫苗保护剂含水溶性明胶1.5～9g、低聚糖5～30g、山梨醇1～24g、聚乙烯吡咯酮0.1～6g、抗坏血酸钠0.5～12g、L-谷氨酸钠0.5～18g和199培养基0.5～3g。
本发明对上述原料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售产品即可，如在本发明中，聚乙烯吡咯酮、山梨醇、甘露醇、L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、蔗糖、水溶性明胶、海藻糖优选购自Solarbio公司；199培养基优选购自GIBCO公司。
本发明提供了一种活疫苗保护剂，包括耐热物质、不耐热物质和注射用水。
以100mL活疫苗保护剂计，本发明提供的活疫苗保护剂中耐热物质的原料包括1.5～9g水溶性明胶，优选为3～9g，更优选为9g。在本发明中，水溶性明胶是高分子化合物对微生物有保护作用，可促进其升华形成耐热骨架，阻断热传导和热辐射。
以所述水溶性明胶的质量为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中耐热物质的原料包括5～30g低聚糖，优选为10～30g，更优选为30g。在本发明中，所述低聚糖优选为蔗糖。在本发明中，低聚糖-蔗糖能渗入细胞内，降低因冷冻而增加的渗透压，而且能保护细菌细胞膜，让细菌处于休眠状态，降低细菌干燥和保存期的生命活动，进而大大加强其耐热性能，还可提高微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，其中蔗糖还能起到低温保护功能和脱水保护作用。
以所述水溶性明胶的质量为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中耐热物质的原料包括1～24g山梨醇，优选为8～24g，更优选为24g。在本发明中，山梨醇可提高冻干过程中水分子的升华速率，提高冻干制品的稳定性。
以所述水溶性明胶的质量为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中耐热物质的原料包括0.1～6g聚乙烯吡咯酮，优选为0.2～0.6g，更优选为0.6g；所述聚乙烯吡咯酮优选为聚乙烯吡咯酮k30(PVP-k30)。在本发明中，耐热保护剂中的聚乙烯吡咯酮(PVP)在冻结和干燥过程中，可防止活性组分变性，起到支撑填充作用。
以所述水溶性明胶的质量为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中不耐热物质的原料包括0.5～12g抗坏血酸钠，优选为4～12g，更优选为12g。在本发明中，抗坏血酸钠阻断冻干样品中氧化链式反应，抑制氧化酶活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过程中氧化变质。
以所述水溶性明胶的质量为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中不耐热物质的原料包括0.5～18g L-谷氨酸钠，优选为6～18g，更优选为18g。在本发明中，L-谷氨酸钠是蛋白质的基本构成单位，也是最好的填充剂。
以所述水溶性明胶的质量体积浓度为基准，本发明提供的活疫苗保护剂中不耐热物质的原料包括0.5～3g 199培养基，优选为1～3g，更优选为3g。在本发明中，199培养基中缓冲盐能够缓冲溶液pH值变化，小分子氨基酸保护活性组分不受破坏；199培养基中磷酸二氢钾、磷酸氢二钠在冷冻干燥、储藏过程中，将生物制品pH值调整到活性物质最稳定区域。
余量由注射用水补足。
本发明提供了上述技术方案所述的活疫苗保护剂的制备方法，包括以下步骤：
将水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮和第一剩余注射用水混合高温灭菌，得第一原料；
将L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、199培养基和第二剩余注射用水混合过滤后，得第二原料；
将第一原料与第二原料混合后，不足部分由第三注射用水补足，得活疫苗保护剂。
本发明将水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮k30和第一剩余注射用水混合高温灭菌，得第一原料。在本发明中，所述第一剩余注射用水的用量优选为30ml；所述高温灭菌的温度优选为112℃～118℃，更优选为114℃～118℃，最优选为116℃～118℃；所述高温灭菌的时间优选为15min～30min，更优选为20～30min，最优选为25min。在本发明中特定的高温灭菌温度能够避免温度过高引起上述物质中糖的变质。
本发明将L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、199培养基和第二剩余注射用水混合过滤后，得第二原料。在本发明中，所述剩余注射用水的用量优选为30ml；所述过滤优选为滤膜过滤；所述滤膜过滤的滤膜孔径优选为0.22μm。在本发明中，此类物质成份经高温灭菌易破坏，选用过滤除菌的方式避免物质成份破坏的问题。
本发明将第一原料与第二原料混合后，不足部分由第三注射用水补足，得活疫苗保护剂。在本发明中，对所述混合的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，将第一原料与第二原料进行混合，使溶液内的成份一致。
本发明提供了上述技术方案所述活疫苗保护剂或上述技术方案所述制备方法得的活疫苗保护剂在提高牦牛副伤寒活疫苗耐热性中的应用。
本发明提供一种活疫苗，所述活疫苗包括菌种和上述技术方案所述活疫苗保护剂或上述技术方案所述制备方法得的活疫苗保护剂；所述菌种为都柏林沙门氏菌STM8002-550株(张晓明，兀征，李惠菊，李光喜，程艳书.牦牛副伤寒弱毒菌株培育及其免疫的研究,中国兽医科技，1991)。在本发明中，将菌株和活疫苗保护剂组合后，能够使疫苗具有耐热和耐储存的优势。
本发明提供了上述技术方案所述的活疫苗的制备方法，包括以下步骤：
将都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液接种于培养基培养，得发酵菌液；
将所述发酵菌液离心后，得菌泥；
将菌泥与生理盐水混合，得制苗用菌液；
将活疫苗保护剂与制苗用菌液按比例混合均匀，得活疫苗。
本发明将都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液接种于培养基培养，得发酵菌液。在本发明中，所述培养基优选包括营养肉汤培养基；所述营养肉汤培养基优选按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》中标准制备而成；所述接种的接种量优选为培养基体积的1％～3％，更优选为1～2％，最优选为1％；所述培养的pH值为7.2～7.4，更优选为7.2～7.3，最优选为7.2。在本发明中，所述培养过程中的碳源补充液优选为40％的葡萄糖。在本发明中，在培养过程中加入40％的葡萄糖补充细菌所需的碳源，葡萄糖经细菌利用后产生CO2溶于水形成碳酸，从而调节溶液的PH值，起到降低溶液的PH值作用。在本发明中，所述培养的模式优选包括发酵培养或通气培养；所述通气培养优选包括静置培养和通气培养两个阶段；所述的发酵培养是指接种柏林沙门氏菌STM8002-550株液体培养基在特定的温度下185r/min摇振培养。或所述的通气培养是指接种柏林沙门氏菌STM8002-550株液体培养基在特定的温度下静止培养后再通入一定量的过滤的空气进行培养，所述培养优选包括静置培养和通气培养；所述发酵培养的温度优选为36℃～38℃，更优选为36.5℃～37.5℃，最优选为37℃；所述发酵培养的时间优选为16h～20h，更优选为17h～20h，最优选为18h～20h；所述通气培养的通气量优选为0.5kg/cm2～3.5kg/cm2，更优选为0.5kg/cm2～2.0kg/cm2，最优选为0.5kg/cm2～1.0kg/cm2；所述通气培养的时间优选为16h～20h，更优选为16.5h～20h，最优选为17h～20h；所述静置培养的温度优选为温度优选为38℃～39.5℃，更优选为38.5℃～39℃，最优选为38.5℃；所述静置培养的时间优选为3h～5h，更优选为3.5h～4h，最优选为4h。在本发明中，所述通气培养时优选在通气培养前向培养液中加入灭菌的消泡剂；所述消泡剂优选为蓖麻油和豆油等使用植物油；所述消泡剂的添加量优选为0.1％～0.22％，更优选为0.16％～0.2％，最优选为0.2％。在本发明，在通气培养时加入消泡剂可消除通入培养液中气体产生泡沫，减少培养液的丢失。
得发酵菌液后，本发明将所述发酵菌液离心后，得菌泥。在本发明中，所述离心的转速优选为3000r/min～12000r/min，更优选为3300r/min～12000r/min，最优选为3500r/min～12000r/min；所述离心的时间优选为10min～30min，更优选为15min～30min，最优选为20min～30min。在本发明中，当采用管式高速连续离心机，则转速为12000r/min(此机型只有12000r/min一个转速)。
得菌泥后，本发明将菌泥与生理盐水混合，得制苗用菌液。在本发明中，所述生理盐水优选为灭菌生理盐水；所述生理盐水与菌泥的用量比优选为30:1～150:1，更优选为50:1～120:1，最优选为80:1～100:1。在本发明中，对混合的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
得制苗用菌液后，本发明将活疫苗保护剂与制苗用菌液按比例混合均匀，得活疫苗。在本发明中，所述活疫苗保护剂与制苗用菌液的体积比为1～1：1～5，更优选为1～1：2～5，最优选为1:5。在本发明中，对混合的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
本发明还提供了一种活疫苗冻干粉，所述活疫苗冻干粉的制备方法包括将上述技术方案所述活疫苗进行干燥，得活疫苗冻干粉。
本发明将上述技术方案所述活疫苗进行干燥，得活疫苗冻干粉。所述干燥优选包括真空冷冻干燥；所述真空干燥的程序为：所述真空冷冻干燥优选包括第一冷冻干燥、第二冷冻干燥和第三冷冻干燥。
在本发明中，所述第一冷冻干燥的温度优选为-50～-35℃，更优选为45-～-35℃，最优选为-43～-40℃；所述第一干燥的真空度优选为0mpa；所述第二冷冻干燥的时间优选为1.5～4h，更优选为2～4h，最优选为2～3h；本发明优选以每分钟1℃的速度降至第一冷冻干燥温度。
在本发明中，所述第二冷冻干燥的温度优选为-15～-4℃，更优选为-12～-3℃，最优选为-10～-8℃；所述第二冷冻干燥的真空度优选为10mpa～25mpa，更优选为10～20mpa，最优选为10～15mpa；所述第二冷冻干燥的时间优选为12h～18h，更优选为12～17h，最优选为12～14h；第一冷冻干燥完成后，本发明优选以每小时2℃的速度由第一冷冻干燥温度升温至第二冷冻干燥温度。
在本发明中，所述第三冷冻干燥的温度优选为20～28℃，更优选为22～27℃，最优选为25～26℃；所述第三干燥的真空度优选为10mpa～25mpa，更优选为10～20mpa，最优选为10～15mpa；时间优选为7～10h，更优选为7～9h，最优选为7.5～8.5h；本发明优选以以每2h升温10℃的速度由第二冷冻干燥温度升至第三冷冻干燥温度。在本发明的实施例中，所述真空冷冻干燥的程序优选为：
将盛有菌液的疫苗瓶置于温度为0℃～4℃的冷冻干燥机的箱体，以每分钟1℃的速度降至-40℃以下，在-40℃以下维持2h；启动抽真空至真空度为10mpa时，将制品由-40℃以下温度逐步升至-10℃，维持12h～14h；以每2h升温10℃，在制品温度25℃时维持8h左右出箱；冻干全程耗时为28h～30h。采用本发明耐热保护剂制备的牦牛副伤寒耐热性活疫苗冻干粉，避免了冰晶的形成，减少细菌细胞膜的物理损伤，降低冻干过程的损失率，降低了菌体死亡率及代谢副产物产生的过敏反应，使得活疫苗冻干粉在25℃可保存2个月，2～8℃条件下保存24个月。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种活疫苗、耐热性活疫苗冻干粉、活疫苗耐热性保护剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
原料准备：1.5g水溶性明胶，5g蔗糖，5g山梨醇，0.1g聚乙烯吡咯酮k30，5g L-谷氨酸钠，1.5g抗坏血酸钠，0.5g 199培养基，余量由蒸馏水补至100mL。
将1.5g水溶性明胶、5g蔗糖、5g山梨醇、0.1g聚乙烯吡咯酮k30和30mL注射用水混合在25℃条件下高温灭菌25min，得第一原料；
将5g L-谷氨酸钠、1.5g抗坏血酸钠、0.5g 199培养基和30mL注射用水混合过滤后，得第二原料；
将第一原料与第二原料混合后，不足部分用灭菌注射用水补足，得活疫苗保护剂。
实施例2
牦牛副伤寒活疫苗制苗用菌液制备
种子液按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(二〇〇〇年版，中华人民共和国农业部.-北京：化学工业出版社，2000，以下简称《规程》)要求进行制备。
将种子液按2％接种于经灭菌处理的装有200mL营养肉汤培养基5瓶，置37℃185r/min发酵培养17h，菌液经3500r/min离心20min，收集所有的菌泥，用灭菌生理盐水悬浮，充分混匀后，作为制苗用菌液。
实施例3
原料准备：1.5g水溶性明胶，5g蔗糖，0.1g PVP-K30，0.5g 199培养基，1.5g抗坏血酸钠，3g L-谷氨酸钠，4g山梨醇，余量由蒸馏水补至100mL。制备方法与实施例1相同。
实施例4
原料准备：1.5g水溶性明胶，5g蔗糖，0.1g PVP-K30，0.5g 199培养基，2g抗坏血酸钠，5g L-谷氨酸钠，4g山梨醇，余量由蒸馏水补至100mL。制备方法与实施例1相同。
实施例5
原料准备：1.5g水溶性明胶，5g蔗糖，0.1g PVP-K30，0.5g 199培养基，2g抗坏血酸钠，3g L-谷氨酸钠，4g山梨醇，余量由蒸馏水补至100mL。制备方法与实施例1相同。
实施例6
原料准备：6g水溶性明胶，20g蔗糖，0.4g PVP-K30、2g 199培养基，8g抗坏血酸钠，12g L-谷氨酸钠，16g山梨醇，余量由蒸馏水补至100L。制备方法与实施例1相同。
实施例7
原料准备：9g水溶性明胶，30g蔗糖，0.6g PVP-K30，3g 199培养基，12g抗坏血酸钠，18g L-谷氨酸钠，24g山梨醇，余量由蒸馏水补至100mL。制备方法与实施例1相同。
实施例8
活疫苗冻干粉的制备：
(1)制菌用菌液的制备：都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液按《规程》要求进行制备。
(2)将都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液按培养基总量的3％接种于普通肉汤中，37℃185r/min发酵培养17h；并在培养过程根据pH升高情况加入10～100ml灭菌40％灭菌葡萄糖补充碳源的同时，控制pH值至7.2～7.4。培养结束后，立即离心，弃掉上清液，收集菌泥，加入适量的灭菌生理盐水，搅拌均匀，即可作为制苗用菌液。
(3)将实施例3～5所制备得到的活疫苗保护剂分别与牦牛副伤寒都柏林沙门氏菌液1：1比例混合，得到活疫苗3、4、5。
(4)将实施例6～7所制备得到的保护剂溶液分别与牦牛副伤寒都柏林沙门氏菌液1：3、1：5比例混合，得到活疫苗6、7。
(5)将活疫苗用真空冷冻干燥机在同一冻干曲线下进行冷冻干燥，即得活疫苗冻干粉3、4、5、6、7。
冷冻干燥的方法：将活疫苗在箱体0℃～4℃进箱，以每分钟1℃的速度降至-40℃以下，在-40℃以下维持2h；；启动抽真空，然后将制品由-40℃以下温度逐步升至-10℃，维持12h～14h；以每2h升温10℃，在制品温度在25℃维持8h左右出箱。冻干全程耗时28h～30h。
对比例1
称取水溶性明胶6g用注射用水定容到100mL，配制成6％水溶性明胶贮液，2M氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，116℃灭菌30min，得活疫苗保护剂。
对比例2
称取PVP-K3012g，用注射用水定容到100mL，配制成12％PVP-K30贮液，2M氢氧化钠溶液调整pH值至7.2，116℃灭菌30min，得活疫苗保护剂。
对比例3
称取甘露醇10g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例4
称取山梨醇10g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例5
称取蔗糖15g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例6
称取海藻糖15g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例7
称取L-谷氨酸钠15g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例8
称取抗坏血酸钠15g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
对比例9
称取199培养基2g用注射用水溶解，定容到100mL，0.22μm滤膜过滤除菌，得活疫苗保护剂。
其中，实施例1和对比例1～9中PVP-k30(聚乙烯吡咯酮k30)、山梨醇、甘露醇、L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、蔗糖、水溶性明胶、海藻糖为Solarbio公司生产；199培养基为GIBCO公司生产。
应用例1
冻融试验
分别取实施例2制备的菌液1mL与实施例1、对比例1～9制备得到的活疫苗保护剂等量混合后(保护剂终浓度如表1所示)，先置于2～8℃条件下20min，后置-40℃冷冻保存4h。同时设不含保护剂基质的菌液作对照。将各冻存菌液融化后，连同冻融前及对照样品按《中华人民共和国兽药典》(中华人民共和国兽药典：2010年版.三部/中国兽药典委员会.—北京：中国农业出版社，2011.3，以下简称《中国兽药典》)进行活菌计数，并计算冻干菌存率。结果如表1所示。
表1冻融试验中活菌计数及菌存率结果
Figure BDA0002622817440000121
Figure BDA0002622817440000131
从表1结果可知，9种基质作为保护剂，其中：L-谷氨酸钠、蔗糖菌存率最高，最高可达60％以上；海藻糖、甘露醇、水溶性明胶、199培养基、抗坏血酸钠菌存率次之，菌存率最高达50％以上。采用本发明提供的活疫苗保护剂能够明显提高化冻后活菌计数和冻融菌存率。
应用例2
冻干试验
取实施例2制苗用菌液10mL与实施例1制备得到的活疫苗保护剂等量混合；分别取实施例2制苗用菌液10mL与基础保护剂(质量体积浓度为1.5％水溶性明胶和质量体积浓度为5％蔗糖)+对比例1～9制备得到的活疫苗保护剂(保护剂终浓度如表2所示)等量混合后，定量分装1mL，按《中国兽药典》附录进行冻干。同时设1.5％水溶性明胶和5％蔗糖作对照。分别取冻干前、冻干后样品按《中国兽药典》进行活菌计数和计算冻干菌存率。结果如表2所示.
真空冷冻干燥的方法：将活疫苗在箱体0℃～4℃进箱，以每分钟1℃的速度降至-40℃以下，在-40℃以下维持2h；启动抽真空，然后将制品由-40℃以下温度逐步升至-10℃，维持12h～14h；以每2h升温10℃，在25℃维持8h左右出箱。冻干全程耗时28h～30h。
表2样品冻干前后活菌计数及菌存率结果
Figure BDA0002622817440000132
Figure BDA0002622817440000141
从表2结果显示，1.5％水溶性明胶+5％蔗糖保护剂中分别加入0.5％199培养基、3％L-谷氨酸钠、1.5％抗坏血酸钠可明显提高冻干菌存率；1.5％水溶性明胶5％蔗糖+4％山梨醇可使冻干菌存率达67.5％。因此，1.5％水溶性明胶5％蔗糖保护剂中添加0.1％PVP、0.5％199培养基、3％L-谷氨酸钠、1.5％抗坏血酸钠也一定有提高菌存率作用。采用本发明提供的活疫苗保护剂能够明显提高冻干后的活菌数和冻干菌存率。
应用例3
采用实施例8制备所得活疫苗冻干粉3、4、5、6、7以及空白对照(以传统的保护剂，即将制苗用菌液、水溶性明胶蔗糖溶液(含质量百分含量为12％水溶性明胶和质量百分含量为40％蔗糖的活疫苗保护剂)按1:7的体积比混匀，作为冻干活疫苗作对照)，按照《中国兽药典》(2010年版)中普通琼脂平板培养计活菌数规定的方法进行耐热性能的比较试验，结果见表3和表4。
表3冻干活疫苗与对照疫苗的物理性状与剩余水份测定的结果
Figure BDA0002622817440000151
表4冻干活疫苗在不同的保存环境和保存时间下活菌计数结果
Figure BDA0002622817440000152
Figure BDA0002622817440000161
由上述结果可以看出，按照实施例8生产的冻干活疫苗与常规冻干疫苗相比，二者在物理性状和冻干后水份含量差异不明显；但在疫苗的保存期试验中表现出了耐热冻干疫苗比常规冻干疫苗更稳定的耐热性能。同时，按照实施例8中用实例7保护剂生产的耐热性牛副伤寒活疫苗的耐热效果更加突出，在37℃放置7天活菌数仅减少15个百分点，在25℃存放60天活菌数减少2个百分点，在4℃存放24个月活菌数减少1个百分点。因此，本发明在该疫苗的应用中实例8中应用实例7耐热保护剂配方制备的疫苗7更具有良好的耐热保护效果。
由上述实施例记载的可知，采用本发明提供的活疫苗保护剂具有良好的耐热保护效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种活疫苗保护剂，其特征在于，包括水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮、抗坏血酸钠、L-谷氨酸钠、199培养基和注射用水；每100mL活疫苗保护剂含水溶性明胶1.5～9g、低聚糖5～30g、山梨醇1～24g、聚乙烯吡咯酮0.1～6g、抗坏血酸钠0.5～12g、L-谷氨酸钠0.5～18g和199培养基0.5～3g。
2.根据权利要求1所述的活疫苗保护剂，其特征在于，所述低聚糖为蔗糖。
3.权利要求1或2所述的活疫苗保护剂的制备方法，包括以下步骤：
将水溶性明胶、低聚糖、山梨醇、聚乙烯吡咯酮和第一剩余注射用水混合高温灭菌，得第一原料；
将L-谷氨酸钠、抗坏血酸钠、199培养基和第二剩余注射用水混合过滤后，得第二原料；
将第一原料与第二原料混合后，不足部分由第三注射用水补足，得活疫苗保护剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高温灭菌的温度为116℃～118℃，时间为15min～25min。
5.权利要求1或2所述活疫苗保护剂或权利要求3或4所述制备方法得的活疫苗保护剂在提高牦牛副伤寒活疫苗耐热性中的应用。
6.一种活疫苗，其特征在于，所述活疫苗包括菌种和权利要求1或2所述活疫苗保护剂或权利要求3或4所述制备方法得的活疫苗保护剂；所述菌种为都柏林沙门氏菌STM8002-550株。
7.权利要求6所述的活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将都柏林沙门氏菌STM8002-550株种子液接种于培养基培养，得发酵菌液；
将所述发酵菌液离心后，得菌泥；
将菌泥与生理盐水混合，得制苗用菌液；
将活疫苗保护剂与制苗用菌液按比例混合均匀，得活疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述培养基包括营养肉汤培养基；所述接种的接种量为培养基体积的1％～3％；所述活疫苗保护剂与制苗用菌液的体积比为1～1：1～5。
9.一种活疫苗冻干粉，其特征在于，所述活疫苗冻干粉的制备方法包括将权利要求6所述活疫苗进行干燥，得活疫苗冻干粉。
10.根据权利要求9所述的活疫苗冻干粉，其特征在于，所述干燥包括真空冷冻干燥；所述真空冷冻干燥的程序为：所述真空冷冻干燥包括第一冷冻干燥、第二冷冻干燥和第三冷冻干燥；所述第一冷冻干燥的温度为-40℃以下，真空度为0mpa，时间为1.5～3.5h；所述第二冷冻干燥的温度为-15～-4℃，真空度为10～25mpa，时间为12h～18h；所述第三冷冻干燥的温度为20～28℃，真空度为10～25mpa，时间为7h～10h。
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