CN113930356B - 一种发酵生产白喉毒素无毒形式crm197蛋白菌种的冻干方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法，包括以下步骤：S1、将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上；S2、升华干燥；S2.1、一阶升华，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上；S2.2、二阶升华，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上；S3、解析干燥，冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，制得CRM197菌种冻干粉；本申请具有提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度的效果。
Description
技术领域
本申请涉及生物工程领域，更具体地说，涉及一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法。
背景技术
CRM197是一种将52位的甘氨酸替换为谷氨酸的单一突变的无毒性的白喉毒素突变体(文献1，2)，致使白喉毒素酶活性位点发生改变，从而不能对细胞产生毒性作用，但在抗原性和免疫原性上仍和天然白喉毒素保持一致。CRM197是一种研究明确的蛋白质，作为多糖和半抗原的载体使其具有免疫原性。它被用作一种载体蛋白，用于许多已经被批准的疫苗，比如脑膜炎球菌、乙型流感嗜血杆菌和肺炎球菌感染的结合疫苗。
基于CRM197蛋白的多种优点，越来越多的企业利用发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种冻干粉为原料生产生物制品。
但是，目前CRM197蛋白菌种冻干粉的冻干后细菌浓度较低。因此，提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度是目前亟需解决的问题。
发明内容
为了提高CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度，本申请提供一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法。
本申请提供的一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白菌种的冻干方法，采用如下的技术方案：
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，维持2～20h；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-20℃～-50℃，并维持2～20h；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-10～-20℃，并维持1～3h；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～100pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至10～35℃，并维持2～20h，制得CRM197菌种冻干粉；
所述菌液细菌浓度为1×106cfu/mL～5×109cfu/mL。
通过采用上述技术方案，本申请的冻干工艺设计合理，冻干曲线简便、耗时短，冻干后的菌种经复苏活性较高。冻干储存方法同时适用于主种子库和工作种子库。另外，控制菌液细菌浓度为1×106cfu/mL-5×109cfu/mL，可大大提升CRM197菌种冻干粉的冻干后细菌浓度以及冻干存活率。
优选的，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，预冻温度-70℃，真空度0pa，维持4h。
优选的，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度20pa，升温速率0.15℃/min，升温至-40℃，并维持12h。
优选的，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持2h。
优选的，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度1pa，升温速率0.5℃/min，升温至28℃，并维持8h。
优选的，所述菌液的细菌浓度为5.0×107cfu/mL。
通过采用上述方案，可获得冻干后细菌浓度以及冻干存活率较高的CRM197菌种冻干粉。
优选的，每100ml所述冻干保护剂中包括有5～50g海藻糖。
通过采用上述方案，冻干配方相关试剂结为国产，成本低廉，且仅需海藻糖，可大大降低生产成本。
优选的，所述冻干保护剂的制备方法为：将海藻糖使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml。
通过采用上述方案，注射用水为经过灭菌后的双蒸水，有效减少培养基被杂菌感染的风险。
优选的，所述注射用水的温度为50℃-60℃。
通过采用上述方案，50℃-60℃的注射用水一方面能够有效促进各组分的快速溶解，另一方面保证了各组分的有效性，以此使其处于一个平衡状态，因此将其作为优选。
优选的，定容后经0.22um滤膜除菌过滤，得到菌种冻干保护剂。
通过采用上述方案，采用滤膜除菌过滤，可大大降低杂菌感染的概率。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、冻干配方相关试剂结为国产，成本低廉。
2、冻干曲线简便、耗时短，冻干后细菌浓度以及冻干存活率较高。
3、冻干储存方法同时适用于主种子库和工作种子库。
具体实施方式
菌种来源：菌种来自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC39255或ATCC39526或ATCC11049或ATCC51926或ATCC51280。
试剂配方及来源：
每1000mL溶液A由包括以下原料制成，具体见表1。
表1溶液A配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 配方 |
| 酵母提取物 | OXOID | 20g |
| 酪蛋白氨基酸 | OXOID | 10g |
| L-色氨酸 | 国药 | 50mg |
| 磷酸二氢钾 | 国药 | 5g |
| 氯化钙 | 国药 | 1g |
每100mL溶液B由包括以下原料制成,具体见表2。
表2溶液B配方表
| 试剂 | 厂家 | 配方 |
| 七水硫酸镁 | 国药 | 22.5g |
| β-丙氨酸 | 国药 | 115mg |
| 烟酸 | 国药 | 115mg |
| 庚二酸 | 国药 | 7.5mg |
| 五水硫酸铜 | 国药 | 0.5g |
| 五水硫酸锌 | 国药 | 0.2g |
| 四水硫酸锰 | 国药 | 75mg |
| 盐酸 | 国药 | 3mL |
每100mL溶液C由包括以下原料制成,具体见表3。
表3溶液C配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 配方 |
| L-胱氨酸 | 国药 | 20g |
| 盐酸 | 国药 | 20ml |
每100mL溶液D由包括以下原料制成,具体见表4。
表4溶液D配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 配方 |
| 麦芽糖 | 国药 | 50g |
| 氯化钙 | 国药 | 0.5g |
每100mL溶液E由包括以下原料制成,具体见表5。
表5溶液E配方表
| 试剂名称 | 厂家 | 配方 |
| 酵母提取物 | OXOID | 10g |
每100mL菌种冻干保护剂由包括以下原料制成,具体见表6。
表6菌种冻干保护剂配方表
发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种培养，包括以下步骤：
1、配制溶液
1.1、配制溶液A
按配方将酵母提取物、酪蛋白氨基酸、L-色氨酸、磷酸二氢钾、氯化钙使用55℃注射用水进行充分混合溶解，再定容至1000ml，得到溶液A。
1.2、配制溶液B
按配方将七水硫酸镁、β-丙氨酸、烟酸、庚二酸、五水硫酸铜、五水硫酸锌、四水硫酸锰、盐酸使用55℃注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液B；
1.3、配制溶液C
按配方将L-胱氨酸、盐酸使用55℃注射水用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液C；
1.4、配制溶液D
按配方将麦芽糖、氯化钙使用60℃注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，得到溶液D；
1.5、配制溶液E
按配方将酵母提取物使用50℃注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml；
1.6、配制菌种冻干保护剂
按配方将海藻糖使用55℃注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml，后经0.22um滤膜除菌过滤，得到菌种冻干保护剂。
2、溶液混合
向1000ml溶液A中加入2ml溶液B和1ml溶液C，灭菌；冷却后，加入30ml溶液D，然后按1wt％的比例加入琼脂粉，采用115℃灭菌10min，待冷却至温度50-60℃时，以100ml/瓶分装入无菌克氏瓶中，平铺待彻底凝固后，储存于2-8℃冰箱中待用。
3、复溶菌种
开启一支发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种，加入1ml溶液E，反复吹打直至完全溶解，得到复溶菌液。
4、一代固体培养
将复溶菌液接种于上述培养基，作为一代固体培养基，置于培养箱中36.5℃±0.5，培养8-12h。
5、二代固体培养
用菌种杆刮去一代固体培养基表面的菌落，涂布于上述培养基，作为二代固体培养，置于培养箱中36.5℃，培养8-12h；
6、菌液收集
采用20ml冻干保护剂刮洗二代固体培养基表面菌落，得到菌液然后吸取菌液转移至无菌瓶中待用。
实施例
实施例1
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液稀释至菌液浓度为1.0×106，按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，常压下维持10h。
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度20pa，升温速率2℃/min，升温至-30℃，并维持10h。
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度10pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持5h。
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度10pa，升温速率2℃/min，升温至28℃，并维持8h，制得CRM197菌种冻干粉。
实施例2-8
与实施例1的区别在于，菌液细菌浓度不同，具体见表7。
表7细菌浓度表
| 实施例 | 菌液浓度 |
| 实施例1 | 1.0×10<sup>6</sup> |
| 实施例2 | 5.0×10<sup>6</sup> |
| 实施例3 | 1.0×107 |
| 实施例4 | 5.0×10<sup>7</sup> |
| 实施例5 | 1.0×10<sup>8</sup> |
| 实施例6 | 5.0×10<sup>8</sup> |
| 实施例7 | 1.0×10<sup>9</sup> |
| 实施例8 | 5.0×10<sup>9</sup> |
实施例9
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液按照0.1mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，并维持2h，具体地，菌液浓度为1×106cfu/mL。
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0pa，升温速率0.01℃/min，升温至-20℃，并维持10h。
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0pa，升温速率0.01℃/min，升温至0℃，并维持1h。
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0pa，升温速率0.01℃/min，升温至10℃，并维持2h，制得CRM197菌种冻干粉。
实施例10
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液按照0.5mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-80℃，预冻温度-80，常压下维持20h，具体地，菌液浓度为1×106cfu/mL。
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度1000pa，升温速率5℃/min，升温至-50℃，并维持20h。
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度1000pa，升温速率5℃/min，升温至10℃，并维持10h。
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度100pa，升温速率5℃/min，升温至35℃，并维持20h，制得CRM197菌种冻干粉。
实施例11
一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液按照3mL/cm2平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-70℃，真空度0pa，并维持5h，具体地，菌液的细菌浓度为1×106cfu/mL。
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度20pa，升温速率0.1℃/min，升温至-40℃，并维持12h。
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度8pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持2h。
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-80℃，真空度1pa，升温速率0.2℃/min，升温至28℃，并维持8h，制得CRM197菌种冻干粉。
实施例12
与实施例1的区别在于，每100ml所述冻干保护剂中包括有5g海藻糖。
实施例13
与实施例1的区别在于，每100ml所述冻干保护剂中包括有50g海藻糖。
实施例14
与实施例1的区别在于，每100ml所述冻干保护剂中包括有15g蔗糖。
对比例
对比例1
与实施例1的区别在于，细菌浓度为1×105cfu/mL。
对比例2
与实施例1的区别在于，细菌浓度为5×105cfu/mL。
检测试验
检验冻干后细菌浓度(cfu/ml)；冻干存活率(％)；种子库复苏1h浓度(cfu/ml)；种子库复苏2h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h比生长速率，上述细菌浓度测试均参照2015版《中国药典》中记载的活菌计数法。
表8性能检测表
结合实施例1-8和对比例1-2可得，菌液的细菌浓度对冻干后细菌浓度(cfu/ml)；冻干存活率(％)；种子库复苏1h浓度(cfu/ml)；种子库复苏2h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h浓度(cfu/ml)；种子库复苏4h比生长速率均具有较大影响。
从冻干后菌种存活率来看，本申请控制细菌浓度1×106cfu/ml-5×109cfu/ml之间进行冻干，细菌存活率水平皆大于52％，是较适宜的冻干前菌液浓度范围。
从种子库复苏4h的生长水平来看，若以比生长速率增长大于0.5来评价，细菌浓度1×106cfu/ml-1×109cfu/ml之间进行冻干，冻干后的种子库复苏水平较理想。
若以比生长速率增长大于1.0来评价的话，细菌浓度5×106cfu/ml-1×108cfu/ml之间进行冻干，冻干后的种子库复苏水平最为理想。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预冻
将含有冻干保护剂的菌液平铺于冻干不锈钢盘中，将所述冻干不锈钢盘置于真空冷冻干燥机隔板上，预冻条件为：冷阱温度≤-40℃，预冻温度-40℃，维持2～20h；
S2、升华干燥
S2.1、一阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，一阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至-20℃～-50℃，并维持2～20h；
S2.2、二阶升华
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，二阶升华条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～1000pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至0或10℃，并维持1～3h；
S3、解析干燥
所述冻干不锈钢盘仍置于真空冷冻干燥机隔板上，解析干燥条件为：冷阱温度≤-40℃，真空度0～100pa，升温速率0.01～5℃/min，升温至10～35℃，并维持2～20h，制得CRM197菌种冻干粉；
所述菌液细菌浓度为1×106cfu/mL～5×109cfu/mL，
菌种来自美国典型培养物保藏中心，菌株编号为ATCC39255或ATCC39526或ATCC11049或ATCC51926或ATCC51280。
2.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，预冻条件为：冷阱温度≤ -80℃，预冻温度-70℃，真空度0pa，维持4h。
3.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，一阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度20pa，升温速率0.15℃/min，升温至-40℃，并维持12h。
4.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，二阶升华条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度10pa，升温速率0.2℃/min，升温至0℃，并维持2h。
5.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，解析干燥条件为：冷阱温度≤ -80℃，真空度1pa，升温速率0.5℃/min，升温至28℃，并维持8h。
6.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，所述菌液细菌浓度为5.0×107cfu/mL。
7.根据权利要求1所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，每100ml所述冻干保护剂中包括有5～50g海藻糖。
8.根据权利要求7所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，所述冻干保护剂的制备方法为：将海藻糖使用注射用水进行充分混合溶解，再定容至100ml。
9.根据权利要求8所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，所述注射用水的温度为50℃～60℃。
10.根据权利要求7所述的发酵生产白喉毒素无毒形式CRM197蛋白的菌种冻干方法，其特征在于，定容后经0.22μm滤膜除菌过滤，得到菌种冻干保护剂。
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