CN108434105B - 基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂，揭示了一种新型的制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，该方法包括培养活细胞使得活细胞内积累甜菜碱、之后再进行冻干的步骤。本发明的方法可以极为显著地提高活细胞在冻干后的存活率以及细胞活力，弥补了以往疫苗冻干制剂配体系统无法有效保护疫苗株胞内生理代谢功能不受损伤的不足，有效发挥了疫苗株胞内外不同保护剂的协同效应。

Description

基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂
技术领域
本发明属于生物制品冷冻干燥领域；更具体地，涉及基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂。
背景技术
制备具有稳定生物活性生物制品的一个可行途径就是将其制备成干燥的固体剂型。目前在生物医药领域尤其是疫苗产品制备中最为广泛采用的干燥技术是冷冻干燥法(freeze-drying)，此干燥制备技术具有成本低、加工过程易于控制和制备可接受性符合产品技术要求等优势(Anamur C.et al.,2015,Int J Pharm,483(1):131-141)。成功的冷冻干燥制剂取决于两个方面：1)冻干加工过程；2)冻干物料系统及配制。对于活细胞疫苗制品来说，除了疫苗产品制剂稳定性挑战外，还面临加工过程中低温冷冻及干燥胁迫对细胞存活力(Cell Viability)的损伤，进而影响疫苗产品中活细胞的存活率(Survival Rate)和免疫剂量。
冻干制剂的物料系统主要由各种赋形剂构成(如糖类、氨基酸、聚合物、表面活性剂、盐类等)，在冷冻干燥加工制备过程中发挥对冻干制剂中的生物活性蛋白或细胞等组份的保护与稳定功能，并在冻干产品的储藏阶段中维护这些活性组份的结构完整性，从而确保冻干制剂具有符合商业应用需求的货架期。对于活细胞生物制品而言，冷冻干燥过程中的低温(-40～-50℃)和干燥脱水及干燥导致的高浓度溶剂渗透压对细胞膜的结构完整性及细胞生理功能将造成极大胁迫压力。为应对这些胁迫损伤，许多冷冻保护稳定剂被添加进冻干制剂物料系统中，常见的有糖类(如蔗糖、海藻糖、葡聚糖等)及氨基酸类(如甘氨酸、谷氨酸盐等)。
接种疫苗已经成为国际上防治病害、感染的有效防治措施(Brudeseth B.E.etal.,2013,Fish Shellfish Immunol,35:1759-1768；Gould C.,2003,Skretting Outlook,20:10-11)。在冻干过程中较低的细胞存活率一直是包括鱼用疫苗在内的冻干活疫苗产品制备开发中的制约性瓶颈之一(Lal M.et al.,2013,Vaccine,31:4759-4764；PowellD.B.et al.,2009,Cryobiology,59:158-163)，它直接降低了单位接种量中的有效剂量(疫苗活细胞数)，导致接种量增大，接种成本增加。
例如，目前国内外市场上已商品化的鱼用鳗弧菌疫苗均为灭活液体制剂，基本采用腹腔注射方式免疫接种。而减毒活疫苗(live attenuated vaccine)因可在鱼宿主体内增殖而同时激发体液和细胞免疫应答反应，相比灭活疫苗具有更好的免疫效力，并可通过浸泡方式免疫接种，无疑对于水产养殖业具有接种便利和给药成本低廉的独特给药操作优势，成为鱼类疫苗的一个热点开发策略(Ellis R.W.,2001,Vaccine,19:2681-2687)。
上述提及的一些冷冻保护稳定剂在许多冻干制剂制备中发挥了较好的冷冻保护作用，但在一些活细胞疫苗例如鳗弧菌疫苗的制备中却没有呈现出商业开发可接受的细胞存活率。虽然配合冷冻干燥加工过程优化，鳗弧菌活细胞存活率有了一定改善，然而仍不能达到其它细菌性活细胞的冻干存活率(至少70％以上)。
发明内容
本发明的目的在于提供基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂。
在本发明的第一方面，提供一种制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，所述方法包括：
(1)培养活细胞，所述的活细胞是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞；培养时添加甜菜碱或添加诱导该细胞胞内合成甜菜碱的前体物质，使得活细胞的胞内合成或转运积累甜菜碱；
(2)收集经过步骤(1)培养的活细胞，进行冻干，获得活细胞疫苗冻干制剂。
在一个优选例中，步骤(1)中，培养时还添加氯化钠；较佳地，氯化钠的浓度是1.5～4％；更佳地，氯化钠的浓度是2～3.5％。
在另一优选例中，步骤(1)中，添加甜菜碱；较佳地，甜菜碱添加浓度为1～15mM；更佳地，甜菜碱添加浓度为3-10mM。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的诱导该细胞胞内合成甜菜碱的前体物质包括(但不限于)：胆碱；较佳地，添加氯化胆碱；更佳的，氯化胆碱添加浓度为0.5～10mM；更佳地，氯化胆碱添加浓度为0.8～5mM(如1，2，3，4mM)。
在另一优选例中，步骤(2)中，进行冻干时，将将步骤(1)获得的活细胞与基础配体系统混合，冻干；所述的基础配体系统包括：海藻糖，甘氨酸，NaCl；较佳地，所述的基础配体系统包括：
海藻糖 2～5％(w/v)；
甘氨酸 1～5％(w/v)；
NaCl 0.8～1.5％(w/v)。
在另一优选例中，所述的基础配体系统(组合物)包括：
海藻糖 3～4％(w/v)；
甘氨酸 2～4％(w/v)；
NaCl 0.9～1.2％(w/v)。
在另一优选例中，所述的基础配体系统(组合物)的pH为7.2±0.1；较佳地，通过NaH2PO4调节pH至7.2±0.1。例如，NaH2PO4为20mM。
在另一优选例中，所述的配体系统中还包括：甜菜碱；较佳地，该甜菜碱的浓度为1～10mM；较佳地为3～8mM；更佳地为4～5mM。
在另一优选例中，步骤(2)中，进行冻干时，步骤(1)获得的活细胞与基础配体系统混合时，活细胞密度不低于5×109CFU/ml；较佳地，活细胞密度不低于1010CFU/ml。
在另一优选例中，所述的活细胞疫苗包括：海洋弧菌，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)和创伤弧菌(V.vulnificus)；较佳地，所述的海洋弧菌包括：鳗弧菌，哈氏弧菌和溶藻弧菌。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备活细胞疫苗冻干制剂的组合物，该组合物包括：
海藻糖 2～5％(w/v)；
甘氨酸 1～5％(w/v)；
NaCl 0.8～1.5％(w/v)。
在本发明的另一方面，提供一种活细胞疫苗冻干制剂，该冻干制剂包括：
活细胞，所述的活细胞是胞内积累有甜菜碱的；较佳地，通过生物合成和转运摄取方式在活细胞内积累甜菜碱；和
基础配体系统(组合物)；所述的基础配体系统包括：
海藻糖 3～4％(w/v)；
甘氨酸 2～4％(w/v)；
NaCl 0.9～1.2％(w/v)。
在本发明的另一方面，提供一种活细胞疫苗冻干制剂，该冻干制剂通过前面任一所述的制备活细胞疫苗冻干制剂的方法制备获得；所述的活细胞是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、不同盐浓度(2％浓度NaCl，4％浓度NaCl)下鳗弧菌疫苗株胞内合成积累甜菜碱的1H-NMR图谱。
图2、不同盐浓度(2％浓度NaCl，4％浓度NaCl)下鳗弧菌疫苗株胞内转运积累甜菜碱的1H-NMR图谱。
图3、不同组别的鳗弧菌活疫苗冻干制剂存活率对比结果。其中，对细胞进行处理的分组情况如表2所示。
图4、不同组别的鳗弧菌活疫苗冻干制剂稳定性对比结果。其中，对细胞进行处理的分组情况如表2所示。
具体实施方式
冷冻干燥过程必需经历极度低温(-40～-50℃)、干燥脱水及干燥导致的高浓度溶剂渗透压对细胞膜的结构完整性及细胞生理功能将造成极大胁迫压力。对于活细胞生物制品而言，在这个过程中极易于发生细胞丧失活力或死亡，使得获得的活细胞制剂活性差或没有活性，严重阻碍了这类生物制品的应用前景。本发明人在研究中发现，一些活细胞在较低温度(例如5～10℃)下，可以藉由自体的抗胁迫响应能力保持存活或保持较高的存活比例，但是面临更低的环境温度，甚至极度低温(如冻干所需达到的低温-40～-50℃)时，则状况并不理想，存活比例低。因此，本发明人致力于寻找提高活细胞在经历冻干后的存活比率的方法，经过深入的研究，揭示了一种新型的制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，该方法包括在冻干前，于培养阶段诱导活细胞胞内积累甜菜碱、之后再进行冻干的步骤。本发明的方法可以显著地提高活细胞在冻干后的存活率以及细胞活力。
本发明所述的新型的制备活细胞疫苗冻干制剂的方法包括：(1)培养活细胞；培养时添加甜菜碱或添加诱导该细胞(疫苗株)胞内合成甜菜碱的前体物质，使得活细胞的胞内合成或转运积累甜菜碱；(2)收集经过步骤(1)培养的活细胞，进行冻干，获得活细胞疫苗冻干制剂。
本发明中，所述的活细胞是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞。一些细菌(例如海洋弧菌)，带有能自体合成或转运甜菜碱的遗传学基础，这类细胞可以被应用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述的活细胞疫苗包括但不限于：海洋弧菌，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、哈氏弧菌(V.harveyi)、灿烂弧菌(V.splendidus)和创伤弧菌(V.vulnificus)；较佳地，所述的海洋弧菌包括：鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，哈氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)。
作为本发明的优选方式，培养时还添加氯化钠，其能够为甜菜碱合成或转运进入细胞内提供适宜的诱导环境。本发明人发现，较低浓度的氯化钠使得进入胞内的甜菜碱量相对较少；而较高浓度的氯化钠则使得细胞本身的生长速度变得缓慢，因此，作为本发明的更优选方式，培养过程中，氯化钠的浓度是1.5～4％；更佳地，氯化钠的浓度是2～3.5％。
使得活细胞的胞内具有足够量的甜菜碱，一种方法是从细胞外部转运摄取以实现在细胞内积累甜菜碱。本发明人在培养系统(培养基)中添加甜菜碱，使得细胞生长过程中摄入甜菜碱、并有效地积累在细胞内。作为本发明的优选方式，在培养系统中甜菜碱的添加浓度为1～15mM；更佳地，甜菜碱的添加浓度为3-10mM。作为本发明的优选方式，培养过程中，在细胞对数生长中期时在培养基中添加甜菜碱。
使得活细胞的胞内具有足够量的甜菜碱，另一种方法是生物合成法，即诱导细胞胞内合成甜菜碱。对于不同的细胞，可以选择合适的诱导物质。作为本发明的优选方式，所述的诱导该细胞胞内合成甜菜碱的前体物质包括：胆碱；较佳地，添加氯化胆碱；更佳的，氯化胆碱添加浓度为0.5～10mM；更佳地，氯化胆碱添加浓度为0.8～5mM。
作为本发明的优选方式，进行冻干时，将步骤(1)获得的活细胞与基础配体系统混合，冻干。因此，本发明还提供了一种用于制备活细胞疫苗冻干制剂的基础配体系统(组合物)，其包括：海藻糖，甘氨酸，NaCl。较佳地，所述的基础配体系统(组合物)的pH为7.2±0.1。较佳地，所述的基础配体系统的个组分的用量如表1所示。
表1
Figure BDA0001226795440000061
作为本发明的优选方式，所述的基础配体系统(组合物)的pH为7.2±0.1；较佳地，通过NaH2PO4调节pH至7.2±0.1。例如，NaH2PO4为20mM。此外应理解，选择其它类似的可以调节pH至7.2±0.1的其它pH调节剂活缓冲试剂也是可用的。
本发明人发现，在冻干前，在活细胞的胞内积累甜菜碱能够极为显著地减少细胞在冻干过程中的损伤以及提高细胞在冻干后的存活率及细胞活力，在冻干过程中，进一步添加甜菜碱将进一步地提高细胞在冻干后的存活率及细胞活力。因此，作为本发明的进一步的优选方式，所述的配体系统中还包括：甜菜碱。较佳地，该甜菜碱的浓度为1～15mM；更佳地为3～10mM；进一步更佳地为4～6mM。
为了获得适合的制剂，优选地，在进行冻干时，细胞内积累了甜菜碱的活细胞与基础配体系统混合时，活细胞密度不低于1×109；较佳地，活细胞密度不低于5×109CFU/ml；更佳的，活细胞密度不低于1010CFU/ml。
在本发明的具体实施例中，主要以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)作为制备疫苗的对象。鳗弧菌是水生动物弧菌病(Vibriosis)的重要细菌性致病菌，可引发海水养殖鱼类出血性败血症(hemorrhagic septicemia)，给世界范围内的鱼类养殖业造成严重经济损失(Frans I.et al.,2011,J Fish Dis,34:643-661；Plumb J.A.et al.,2011,Healthmaintenance and principal microbial diseases of cultured fishes.3rd ed.Wiley-Blackwell)。其最适生长温度为25～30℃，但鳗弧菌也可在寒冷的海水环境中存活分布(5～18℃)并保持对鱼类的致病性(Arkoosh M.R.et al.,2015,J Aquat Anim Health,27:96-103；Mikkelsen H.et al.,2007,Aquaculture,266:16-25)。经实施例验证，本发明的方法能够极为显著地提高鳗弧菌活细胞疫苗在冻干后的存活率以及细胞活力。
本发明的活疫苗冻干制剂弥补了原有仅仅依靠细胞外部制剂配体系统中保护剂对细胞的冷冻保护作用，而无法有效实现对疫苗株细胞内部生理功能及结构保护的不足。在本发明的冻干制剂配体系统中，通过诱导疫苗株胞内大量积累冷冻保护剂，实现胞内外保护剂协同作用并最终有效改善和提高疫苗株存活率，是冷冻保护剂在活疫苗冻干制剂配体系统优化及制备技术上的创新性应用。
本发明的技术方案与现有技术相比，优点还在于：
1)本发明的鳗弧菌活疫苗冻干制剂在不改变细胞内部代谢功能的基础上实现了保护剂在胞内的积累和保护作用，最大限度发挥了细胞内外不同保护剂配体的协同冻干效能。
2)本发明的鱼用鳗弧菌减毒活疫苗冻干制剂具有更高的细胞存活率和稳定性，显著提高了疫苗的单位有效剂量，可有效降低给药成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、疫苗株胞内甜菜碱的合成积累
1、鳗弧菌减毒活疫苗培养与甜菜碱诱导合成
(1)TSA平板培养基(g/L)：大豆蛋白胨10，酵母浸出物3，NaCl 25，琼脂18，pH7.2；
(2)种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出物5，葡萄糖2.5，氯化钠20，pH 7.2～7.5；
(3)发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出物5，葡萄糖5，氯化钠20～40(即2％～4％，w/v)，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、对羟基苯甲酸和对氨基苯甲酸均为20mg/L，pH 7.2～7.5；
(4)生理盐水(g/L)：氯化钠9，氯化钾0.7，pH 7.2，121℃灭菌15分钟。
(5)1M氯化胆碱浓缩液：将13.962g氯化胆碱溶于100ml去离子水中，0.22μm过滤除菌备用。
本实施例所用的鳗弧菌减毒疫苗株是Vibrio anguillarum MVAV6203，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC-M204066。
用接种环挑取划线于TSA琼脂平板上鳗弧菌减毒疫苗株，接种于装有20ml液体种子培养基的100ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200r/min)，12小时后，取5ml生长旺盛的种子菌液接种(OD600＝4.0左右)于100ml新鲜发酵培养基，28℃恒温振荡培养至对数生长中后期(约8～10h)，补加氯化胆碱至终浓度1mM，继续培养5～6h至平衡期，离心收获菌体(3000×g，15min，25℃)，用无菌生理盐水洗涤3次后再离心收获菌体备用。
2、疫苗株胞内合成积累甜菜碱核磁共振分析
将这些菌体反复冻融三次加速细胞裂解，重新重悬于750ul无水乙醇中萃取胞内可溶性溶质，离心除去细胞碎片，细胞萃取物再真空蒸发去除乙醇，将所得到的细胞萃取固形物重悬于500ul氘水(D2O)中，去除不可溶物质后转入核磁管中进行核磁共振(1H-NMR)测试验证甜菜碱的胞内积累。
不同NaCl浓度下鳗弧菌疫苗株胞内合成积累甜菜碱的1H-NMR图谱如图1所示。
由结果可见，在上述诱导培养条件下，在细胞内能够形成甜菜碱的有效积累。并且也可见，2％浓度下的甜菜碱的特征峰的峰值高于4％NaCl浓度下的峰值，可见2％浓度下的甜菜碱积累相对更多。
实施例2、疫苗株胞内甜菜碱的转运积累
1、鳗弧菌减毒活疫苗培养与甜菜碱胞外诱导摄取
(1)TSA平板培养基(g/L)：大豆蛋白胨10，酵母浸出物3，NaCl 25，琼脂18，pH7.2；
(2)种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出物5，葡萄糖2.5，氯化钠20，pH 7.2～7.5；
(3)发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出物5，葡萄糖5，氯化钠20～40(即2％～4％，w/v)，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、对羟基苯甲酸和对氨基苯甲酸均为20mg/L，pH 7.2～7.5；
(4)生理盐水(g/L)：氯化钠9，氯化钾0.7，pH 7.2，121℃灭菌15分钟。
(5)1M甜菜碱浓缩液：将11.715g甜菜碱溶于100ml去离子水中，0.22um过滤除菌备用。
本实施例所用的鳗弧菌减毒疫苗株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉大学，保藏日期为2004年9月15日，保藏号为CCTCC-M204066。
用接种环挑取划线于TSA琼脂平板上鳗弧菌减毒疫苗株，接种于装有20ml液体种子培养基的100ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速200r/min)，12小时后，取5ml生长旺盛的种子菌液接种(OD600＝4.0左右)接种于100ml新鲜发酵培养基，28℃恒温振荡培养至对数生长中后期(约8～10h)，补加甜菜碱至终浓度1mM，继续培养5～6h至平衡期，离心收获菌体(3000×g，15min，25℃)，用无菌生理盐水洗涤3次后再离心收获菌体备用。
2.疫苗株胞内转运积累甜菜碱核磁共振分析
将这些菌体反复冻融三次加速细胞裂解，重新重悬于750μl无水乙醇中萃取胞内可溶性溶质，离心除去细胞碎片，细胞萃取物再真空蒸发去除乙醇，将所得到的细胞萃取固形物重悬于500μl氘水(D2O)中，去除不可溶物质后转入核磁管中进行核磁共振(1H-NMR)测试验证甜菜碱的胞内积累。
不同NaCl浓度下鳗弧菌疫苗株胞内转运积累甜菜碱的1H-NMR图谱如图2所示。
由结果可见，在上述诱导条件下，在细胞内能够形成甜菜碱的有效积累。并且也可见，2％浓度下的甜菜碱的特征峰的峰值高于4％NaCl浓度下的峰值，可见2％浓度下的甜菜碱积累相对更多。
实施例3、鳗弧菌减毒活疫苗冻干制剂配制及冷冻干燥制备
1、细胞分组
本实施例中，细胞分组情况如表2。
表2
Figure BDA0001226795440000101
注：1冻干前在制剂基础配体中直接加入5mM甜菜碱
2疫苗株发酵培养过程中在培养基中添加1mM氯化胆碱诱导胞内合成积累甜菜碱
具体为：
组别1：胞外未添加甜菜碱、胞内未积累甜菜碱组；
组别2：冻干前胞外添加甜菜碱(5mM)、胞内未积累甜菜碱组；
组别3：胞外未添加甜菜碱、胞内积累甜菜碱组(实施例12的方法获得的细胞)；
组别4：胞外添加甜菜碱(5mM)、胞内积累甜菜碱组(实施例1的方法获得的细胞)。
各组细胞分别进行冻干，分析冻干后的细胞存活情况及稳定性。
2、冻干制剂配制
按照上述实施例1和实施例2中离心收获的鳗弧菌减毒疫苗株按照不低于～1010CFU/ml的细胞密度重悬于如下冻干制剂基础配体系统(％w/v)：海藻糖3.5；甘氨酸3；NaCl 0.9；NaH2PO4 20mM，配体系统pH为7.2。在上述制剂中补加甜菜碱浓缩液至终浓度为0～10mM。在室温和无菌条件下充分搅拌混合均匀后，按照2ml/瓶的容量将配制好的疫苗制剂灌装于灭菌冻干瓶内(7ml)，摆放于冻干托盘上，瓶口半插入丁基硅胶塞(保留冻干过程水汽升华通道)。
3、冻干制备
将上述疫苗冻干制剂托盘放置于冻干机冷冻隔板上(Christ Epsilon 2-6D)，隔板温度设置为4℃，维持30min后将隔板温度将至-45℃，维持3h，升温至-15℃，维持3h，然后再降温至-45℃(3h内)，一次干燥10h(-25℃)，二次干燥8h(30℃)，干燥阶段真空度维持在0.15mba。冷冻干燥结束后，真空压塞后封盖保存于4℃条件下备用。
4、疫苗株细胞存活率测定
在冻干结束后24h内分别采用菌落平板计数(Colony Forming Units，CFU)和细胞活力(Cell Viability)两种方法测试疫苗冻干制剂的细胞存活率。每瓶冻干疫苗在室温下加入2ml无菌蒸馏水进行复水重悬，复水样本用无菌生理盐水(见实施例1)进行系列10倍梯度稀释，然后取10ul涂布TSA琼脂平板，在28℃下培养48h后计数确定可培养细胞数(CFU)。细胞活力测定采用Live/Dead BacLightTM试剂盒(Invitrogen，中国)，按照使用说明书染色后在荧光显微镜下计数，其中完整活性细胞显示绿色荧光，不完整损伤细胞显示红色荧光。
细胞存活率(％)＝(N1/N0)×100％
其中：N1是冻干后所有活性细胞的总数(CFU或绿色荧光细胞数)，N0是冻干前所有活性细胞总数(CFU或绿色荧光细胞数)。
不同组别的鳗弧菌活疫苗冻干制剂存活率对比结果如图3所示。由该结果可见：
分别采用胞外添加甜菜碱或胞内积累甜菜碱，均能够显著地增加可培养细胞数(CFU)以及细胞活力；
经历胞内积累甜菜碱过程的细胞，显著地比仅在胞外添加甜菜碱的细胞在冻干后的状态好；
同时采用胞外添加甜菜碱和胞内积累甜菜碱，则可培养细胞数(CFU)以及细胞活力又有非常显著的提高。
5、疫苗冻干制剂稳定性测定
冻干疫苗样品按照上述测定方法于4周后进行细胞存活率测定，以此评价冻干疫苗的储藏稳定性。
不同组别的鳗弧菌活疫苗冻干制剂稳定性对比结果如图4所示。由该结果可见：
分别采用胞外添加甜菜碱或胞内积累甜菜碱，均能够显著地增加冻干4周后的样品的可培养细胞数(CFU)以及细胞存活率；
经历胞内积累甜菜碱过程的细胞，4周后显著地比仅在胞外添加甜菜碱的细胞在冻干后的存活率和细胞活力高；
同时采用胞外添加甜菜碱和胞内积累甜菜碱，则冻干4周后的样品的可培养细胞数(CFU)以及细胞存活率又有有显著的提高。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
此外应理解，对于经充分说明的本发明来说，根据本发明的所阐述的内容进行简单实验所作出的变换及改型的方案，仍然属于本发明的保护范围。在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。

Claims (7)

1.一种制备活细胞疫苗冻干制剂的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1) 培养海洋弧菌活细胞，其是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞；培养时添加3～10mM甜菜碱，使得活细胞的胞内合成或转运积累甜菜碱；培养时还添加1.5～4%氯化钠；
(2) 收集经过步骤(1)培养的海洋弧菌活细胞，与基础配体系统混合，进行冻干，获得活细胞疫苗冻干制剂；所述的基础配体系统包括：海藻糖2～5%w/v；甘氨酸1～5%w/v；NaCl0.8～1.5%w/v；且包含甜菜碱3～8mM；
所述的海洋弧菌选自：鳗弧菌，哈氏弧菌，溶藻弧菌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，氯化钠的浓度是2～3.5%。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行冻干时，将步骤(1)获得的活细胞与基础配体系统混合，冻干；所述的基础配体系统包括：
海藻糖 3～4%w/v；
甘氨酸 2～4%w/v；
NaCl 0.9～1.2%w/v。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行冻干时，步骤(1)获得的活细胞与基础配体系统混合时，活细胞密度不低于5×109 CFU/ml。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，活细胞密度不低于1010 CFU/ml。
6. 一种活细胞疫苗冻干制剂，其特征在于，该冻干制剂包括：
海洋弧菌活细胞，所述的活细胞是胞内积累有甜菜碱的，其通过以下方法获得：培养海洋弧菌活细胞，其是具有免疫原性且能自体合成或转运甜菜碱的原核细胞；培养时添加3～10mM甜菜碱，使得活细胞的胞内合成或转运积累甜菜碱；培养时还添加1.5～4%氯化钠；和
基础配体系统；所述的基础配体系统包括：海藻糖2～5%w/v；甘氨酸1～5%w/v；NaCl0.8～1.5%w/v；
所述的海洋弧菌选自：鳗弧菌，哈氏弧菌，溶藻弧菌。
7.如权利要求6所述的活细胞疫苗冻干制剂，其特征在于，所述的基础配体系统包括：
海藻糖 3～4%w/v；
甘氨酸 2～4%w/v；
NaCl 0.9～1.2%w/v。
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