CN104906568A

CN104906568A - 一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗

Info

Publication number: CN104906568A
Application number: CN201510163751.XA
Authority: CN
Inventors: 陈明; 李莉萍; 王瑞; 甘西; 梁万文; 唐佳有; 黄婷; 雷爱莹; 罗永巨; 李健; 陈福艳
Original assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Guangxi Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2015-04-09
Publication date: 2015-09-16

Abstract

本发明公开了一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗及其制备方法，将罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001通过扩大培养、菌体收集和冻干制备成口服弱毒疫苗。通过试验确定了疫苗的免疫剂量、免疫程序和疫苗的使用方法。田间试验检测和确认了疫苗在生产上的免疫效力、安全性和可操作性，结果表明研发的疫苗具有保护效力高、安全性好，使用方便，成本低廉等优点，可用于养殖中罗非鱼无乳链球菌病预防，具有很高的商业价值。

Description

一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗

技术领域

本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌病的预防用疫苗，具体涉及该疫苗所用菌株，疫苗的制备，免疫剂量，免疫程序和免疫方法。

背景技术

无乳链球菌是水产养殖中常见的一种病原菌，可危害不同品种的鱼类，如罗非鱼、鲈鱼、鲳鱼、鲷、石斑鱼等，其中以罗非鱼无乳链球菌病最为严重(Duremdez et al，2004；Jafar et al，2008；Amal et al， 2012)。该病造成极高死亡率，每年给水产业造成巨额经济损失(Wang et al，2014)。中国是世界罗非鱼第一大国，产量约占世界总产量的45％。2009-2014连续6年，链球菌病在中国罗非鱼养殖大面积暴发流行，发病区域逐年扩大、发病率和死亡率逐年递增，易感罗非鱼规格范围逐年扩大，累计死亡率高达30％-90％，同时研究发现90％以上临床菌株为无乳链球菌(Chen et al，2012)。

目前该病的控制主要依靠抗生素等化学药物，但该方法有诸多负面作用，大量抗生素的使用及其在鱼体内的积累，可对环境、潜在的食品安全危害和人类公众健康均有危害（Baquero et al，2008；Sun et al，2014）。同时调查研究显示，随着抗药和耐药性的产生，近3年中国罗非鱼养殖很难找到可以控制无乳链球菌病的有效药物。而免疫接种是用于控制无乳链球菌病最理想的方法之一（Darwish et al，2007）。目前，无乳链球菌较成功疫苗有两类：第一类是利用无乳链球菌菌体和胞外产物制备的灭活疫苗，该疫苗已被证实效果很好（Evans et al，2004；Pasnik et al，2005）；另一类是亚单位疫苗，也有效好的免疫保护力（Cheng et al，2010；Nur-Nazifah et al，2014）。然而，这两类疫苗均是通过注射方法进行免疫，注射操作劳力强度大，成本高，对鱼应激也大，不利于在养殖中大面积推广应用。高效口服疫苗由于可将疫苗拌于饲料中投喂免疫，非常适合鱼类（Johnson et al，1983）。其中口服弱毒疫苗比口服灭活疫苗免疫效果更好，主要是口服弱毒疫苗以活细菌作为抗原，能最大程度避免肠道酶的降解，并且能到达脾、肾等免疫器官，产生持续性免疫反应（Chen et al，2015）；另外，有研究显示口服弱毒疫苗可同时刺激机体产生局部粘膜免疫反应和机体系统性免疫反应（Makesh et al，2015）。目前已报道两种方法制备无乳链球菌弱毒疫苗：1）Pridgeon通过不断提高sparfloxain浓度筛选出无乳链球菌弱毒菌株，这种方法获得弱毒菌株本身对罗非鱼还存在一定的毒力，在无抗生素胁迫下毒力更易返强，并且采用注射进行免疫（Pridgeon et al，2013）； 2）Huang以减毒沙门氏菌（live attenuated Salmonella typhimurium）为载体表达无乳链球菌表面抗原（Sip）的DNA弱毒疫苗,该方法制备的弱毒株稳定性差，免疫反应强度不高，免疫保护期才7天（Huang et al，2014）。体外连续传代是经典的细菌毒力致弱方法，获得的弱毒菌株稳定性和免疫原性均显著好于通过基因敲除或抗生素胁迫筛选获得的弱毒菌株，其缺点是因为传代次数往往很大，所以费时费力。1978年通过该方法获得的猪链球菌弱毒菌株ST171目前还在中国广泛应用，其稳定性、安全性和免疫效力均很好（缪家荣等，1983）。目前还未见鱼类或其它宿主无乳链球菌自然传代弱毒株疫苗相关报道。

发明内容

本发明针对当前我国罗非鱼无乳链球菌病预防难问题，将前期获得的无乳链球菌自然传代弱毒株开发成口服型弱毒疫苗，为该病提供一种高效、安全、使用方便和成本低廉的预防用疫苗。

本发明技术方案：

该疫苗发明主要包括：（1）所用菌株；（2）疫苗的制备；（3）疫苗的免疫剂量；（4）疫苗的免疫程序；（5）疫苗的免疫方法。

（一）本发明疫苗所用弱毒株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001，保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2014045。本申请人已于2014年3月11日将该菌株申请国家发明专利，申请号为201410087045.7。

（二）疫苗的制备：

将-80℃保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏，接种于优化的改良马丁培养基进行扩大培养，通过离心收集菌体，PBS调整细菌浓度后分装于10 ml西林瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干，封瓶后于-20℃保存。

培养基配方（1000ml）：改良马丁培养基干粉28.5 g，葡萄糖2 g，新生牛血清20 ml，加三蒸水1000 ml；

冻干保护剂配方(100 ml)：蔗糖40 g，脱脂奶粉12 g，PVP 0.8 g，加三蒸水至100 ml；

疫苗冻干曲线：4℃进箱，全速制冷到-40℃（1.5 小时）维持约2.5 h，-5℃恒温 32 h，60 min到 0℃，0℃恒温1 h，60 min到10 ℃，10℃恒温 1 h，1 h到 25 ℃，25℃恒温 5 h，全程约36 h。

（三）疫苗的免疫剂量：

用PBS对冻干的疫苗进行10倍连续稀释，按1.0 × 10⁵, 1.0 × 10⁶, 1.0 × 10⁷, 1.0 × 10⁸和 1.0 × 10⁹CFU/尾5个免疫剂量分别口服免疫罗非鱼（单次免疫），分别于免疫后第15天和第30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029（保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 209278）测定各剂量免疫组的相对免疫保护率，进而确定疫苗免疫剂量。

（四）疫苗的免疫程序：

疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第7天免疫3次。

（五）疫苗的免疫方法：

冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积饮用水进行稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3.0％称量浮水性饲料并测量其体积为V，按饲料重量0.2％加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明，室温放置15分钟后投喂免疫罗非鱼。

（六）免疫试验：

2014年7月-11月，在广西南宁市分别选择了两个罗非鱼养殖场进行了田间免疫试验，养殖模式分别是池塘和网箱养殖，分别于免疫后30天、60天、90天计算疫苗相对免疫保护率，检验疫苗的生产应用效果。

本发明所具有的优点：

1、本发明的无乳链球菌疫苗是通过口服免疫罗非鱼，相对已报道的注射型疫苗，使用非常方便，对鱼体应激非常小，非常适合水中生活鱼类的群体规模免疫。

2、由于疫苗是通过口服免疫，适合的养殖方式、免疫鱼规格和养殖期相对已报道的注射更适合生产实际需求，特别适合我国现在大量存在的池塘和水库罗非鱼养殖，由于节省了注射人工成本，该疫苗的免疫成本显著降低。

3、疫苗实验室30天免疫试验保护率达77.61％，远高于已报道的最好结果63.1％（Shoemaker et al, 2006），该结果是免疫后第23天的保护率；田间池塘和网箱免疫试验第60天保护率分别达86.09％和78.74％，第90天免疫保护率分别达84.71％和72.06%。同时，该疫苗所用弱毒菌株YM001在毒力上安全稳定。相对已报道的该病其它弱毒或口服疫苗（见背景技术），本发明的疫苗更高效、更安全、使用更方便、成本低廉，具有很高的商业价值。

附图说明

图1：免疫剂量筛选试验结果；

图2：免疫程序筛选试验结果；

图3：外周血抗体水平检测结果；

图4：网箱养殖田间试验结果；

图5：池塘养殖田间试验结果。

具体实施方式

（一）疫苗的制备：

将-80℃保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于5％绵羊血琼脂平板，28℃培养36 h，挑单个菌落接种于100 ml优化的改良马丁培养基，28℃，150 rpm培养24 h；将培养获得的100菌液全部接种于5000 ml优化的改良马丁培养基，28℃，150rpm培养12 h；培养的菌液9000g离心5min，加入350 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS）和50 ml冻干保护剂，充分混匀；分装于100个10 ml西林瓶，4 ml/瓶。另外，利用分光光度计和平板计数对培养的菌液进行计数，通过菌液调整使每瓶细菌量为5.0 × 10¹⁰CFU。接着将分装好的西林瓶放于冻干机按优化的冻干曲线进行冻干，真空封瓶后于-20℃保存。

1、改良马丁培养基配方（1000ml）：

改良马丁培养基干粉28.5 g，葡萄糖2 g，新生牛血清20 ml，加三蒸水1000 ml。

2、冻干保护剂配方（100ml）：

蔗糖40 g，脱脂奶粉12 g，PVP 0.8 g，加三蒸水至100 ml。

3、冻干曲线：

4℃进箱，全速制冷到-40℃（1.5 小时）维持约2.5 h，-5℃恒温 32 h，60 min到 0℃，0℃恒温1 h，60 min到10 ℃，10℃恒温 1 h，1 h到 25 ℃，25℃恒温 5 h，全程约44.5 h。

（二）疫苗的免疫剂量：

每瓶冻干疫苗加入4 ml PBS, 静止作用10min，用PBS调整疫苗浓度，分别按1.0 × 10⁵, 1.0 × 10⁶, 1.0 × 10⁷, 1.0 × 10⁸和1.0 × 10⁹CFU/尾5组免疫剂量单次口服免疫罗非鱼，100尾/组，试验鱼体重平均为50g。分别于免疫后第15天和30天取50尾，通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率，感染剂量为1.0 × 10⁶CFU/尾（100× LD₅₀），感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保护率。试验结果见图1，1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸、1.0×10⁹CFU/尾5个剂量组第15天相对免疫保护率分别为6.45％，32.26％，48.39％，62.90％和66.13％，第30天相对免疫保护率分别为1.47％，11.76％，32.35％，52.94％和55.88％。1.0×10⁸和1.0×10⁹CFU/尾两组剂量在15天和30的保护率差异不大（P>0.05）；1.0×10⁶和1.0×10⁷CFU/尾剂量组免疫保护率相对1.0×10⁸和1.0×10⁹CFU/尾剂量组显著下降（P<0.01）；1.0×10⁵CFU/尾剂量组的保护率极低，第30天几乎没免疫保护作用。综合疫苗用量和保护率两个指标确定疫苗最佳免疫剂量为1.0 × 10⁸CFU/尾。

（三）疫苗的免疫程序：

根据罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪结果（表1），共设计了3种免疫程序，即免疫程序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。3种免疫程序均是在1周内完成，免疫程序Ⅰ为免疫1次，免疫程序Ⅱ为免疫2次，免疫程序Ⅲ为免疫3次。为筛选到更好的免疫程序和免疫剂量，每个免疫程序设计了3个免疫剂量，50尾/组，试验鱼体重平均为50g，具体试验设计见表2。免疫后第30天通过腹腔注射感染无乳链球菌强毒株KS029测定各剂量免疫组疫苗相对免疫保护率，感染剂量为1.0 × 10⁶CFU/尾（100× LD₅₀），感染后观察15天，计算各剂量免疫组免疫保护率。试验结果见图2，1.0×10⁷CFU/尾剂量组免疫程序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ保护率分别为25.37％，53.73％和58.21％；1.0×10⁸CFU/尾剂量组免疫程序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ保护率分别为46.27％，71.64％和77.61％；1.0×10⁹CFU/尾剂量组免疫程序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ保护率分别为50.75％，68.66％和73.13％。3个剂量试验组均显示免疫程序Ⅱ和Ⅲ保护率均显著高于免疫程序Ⅰ（P<0.01），但免疫程序Ⅱ和Ⅲ之间保护率差异不显著（P>0.05）。结合疫苗用量和保护率两个指标确定疫苗免疫程序为免疫程序Ⅱ。另外，可根据生产实际需求进行加强免疫，加强免疫程序与基础免疫程序一样，为免疫程序Ⅱ。另外，ELISA方法检测试验鱼外周血抗体水平，1.0×10⁷CFU/尾、1.0×10⁸CFU/尾和1.0×10⁹CFU/尾3个剂量口服免疫组抗体水平显著高于对照组（p<0.01），免疫后14-21天抗体水平最高，28天显著下降（图3）。

表1 罗非鱼口服灌胃弱毒菌株YM001后体内示踪

口服灌胃剂量为1.0×10⁸ CFU/尾；“++++”表示细菌密集生长，较难区分单菌落，“+++”表示细菌较密集生长，可区分单菌落，“++”表示细菌菌落较少，50个菌落以内；“+”表示细菌菌落很少，10个菌落以内，“－”表示无细菌生长。

表2 免疫程序筛选试验设计

（四）疫苗的免疫方法：

结合免疫剂量筛选试验结果和生产实际情况，每瓶疫苗含菌量为5.0 × 10¹⁰CFU，可免疫500尾罗非鱼。免疫时，1瓶疫苗加入PBS 4 ml静止作用10 min，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积的饮用水进行稀释和混匀，根据免疫罗非鱼总体重3.0％称量浮水性饲料并测量其体积为V，按饲料重量0.2％加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表面，室温放置15 min后投喂免疫罗非鱼。

（五）免疫试验：

1、网箱养殖田间试验

2014年7月12日，随机选择广西横县南乡镇合浦力富水产养殖有限公司网箱养殖罗非鱼10箱，进行疫苗田间试验，试验鱼平均大小60 g，1500尾/箱，其中5箱进行口服免疫，免疫剂量为1× 10⁸ CFU/尾，分别于第1和第7天进行两次口服免疫，另设5箱为对照组。小试期间，10箱试验鱼（免疫组和对照组）的生产管理与其它网箱相同，但未投喂抗生素等药物。从7月12日开始，由指定专门人员进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行统计，计算免疫保护率。结果见图3，免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率分别为83.21％、78.74％、72.06％和71.34％。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致畸等现现象，其生长速度与对照组罗非鱼未见有显著差异（P>0.05）。

2、池塘养殖田间试验

2014年7月19日，随机选择广西南宁三塘镇廖兴能池塘养殖场进行疫苗田间试验，分别设免疫组和对照组。免疫组池塘面积为4.5亩，平均水深为1.8 m，养殖罗非鱼5000尾，平均大小为150g；对照组池塘面积为10亩，平均水深为2.0 m，养殖罗非鱼10000尾，平均大小为150g。免疫组分别于第1和第7天进行两次口服免疫，免疫剂量为1× 10⁸ CFU/尾。小试期间，免疫组未投喂抗生素等药物，对照组在发病高峰期8月20日～9月20日期间进行了抗生素的投喂，但未产生效果。免疫组的其它生产管理与对照组相同。从7月19日开始，由养殖场负责人廖兴能进行试验鱼死亡情况记录，试验结束对数据进行统计，计算免疫保护率。结果见图4，免疫后第30天、60天、90天和107天疫苗免疫保护率分别为75.30％、86.9％和84.71％。另外，免疫罗非鱼未出现致死、致残和致畸等现象，其生长速度与对照组罗非鱼未见有差异。

Claims

1.一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于：

疫苗所用弱毒菌株为罗非鱼源无乳链球菌弱毒菌株YM001；疫苗制备方法包括疫苗制备步骤、培养基配方、冻干保护剂配方和冻干曲线；疫苗口服免疫剂量范围为1.0×10⁶ ~1.0×10⁹CFU/尾；疫苗免疫程序及疫苗使用方法。

2.根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于疫苗的制备方法包括以下步骤：

（1）疫苗制备：将-80℃保存的弱毒菌株YM001生产种子接种于绵羊血平板进行复苏，接种于优化的改良马丁培养基进行扩大培养，通过离心收集菌体，磷酸缓冲盐溶液调整细菌浓度后分装于10 ml西林瓶，加入筛选获得的冻干保护剂，按优化的冻干曲线对其冻干，封瓶后于-20℃保存；

（2）培养基配方（1000ml）：改良马丁培养基干粉28.5 g，葡萄糖2 g，新生牛血清20 ml，加三蒸水1000 ml；

（3）冻干保护剂配方(100 ml)：蔗糖40 g，脱脂奶粉12 g，PVP 0.8 g，加三蒸水至100 ml；

（4）疫苗冻干曲线：4℃进箱，全速制冷到-40℃（1.5 小时）维持约2.5 h，-5℃恒温 32 h，60 min到 0℃，0℃恒温1 h，60 min到10 ℃，10℃恒温 1 h，1 h到 25 ℃，25℃恒温 5 h，全程约44.5h。

3.根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的疫苗免疫程序为：疫苗分别于第1天和第7天分别免疫2次，或分别于第1天、第4天和第7天免疫3次。

4.根据权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗，其特征在于所述的疫苗免疫方法为：冻干疫苗中加入PBS进行细菌复苏，再将复苏的弱毒疫苗倒入1/7V体积饮用水进行稀释和混匀；根据免疫罗非鱼总体重3.0％称量浮水性饲料并测量其体积为V，按饲料重量0.2％加入水产用粘合剂并与饲料充分混匀，将稀释好的疫苗喷洒到饲料表明，室温放置15分钟后投喂免疫罗非鱼。