CN105169382A - 一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法，属于动物疫苗制备技术领域，其采用副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌液抗原，经蜂胶原液制备、生产用菌株制备、抗原液制备、活菌计数、浓缩、灭活、疫苗检验，从而完成四价蜂胶灭活疫苗的制备。本发明的四价蜂胶灭活疫苗抗体效价高，特别解决目前由于副猪嗜血杆菌新发病而导致的现有疫苗预防效果不佳的问题，同时有效的简化免疫程序、节省劳动力，降低免疫成本。

Description

一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体的说，是关于一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病又称革拉泽病是由副猪嗜血杆菌(HaemophilusParasuis，Hps)引起的猪多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎的传染病，主要感染断奶前后仔猪。近年来，由该菌直接感染或混合感染给养猪业带来一定的经济损失已成为猪的主要病原之一。研究表明，Hps血清型复杂，已确定的有15个血清型，还有15.2～41％的分离株不能确定血清型，根据日本、德国、美国和西班牙等国的血清流行病学调查，以血清型4、5和13最为流行。Hps在我国也普遍流行，以4、5、13和12型为主。针对该病在国内的流行现状，学者对流行菌株和相应的防控措施作了很多研究。目前市场上Hps的二价、三价灭活疫苗起到了一定的预防效果，而该病的病原流行株和多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果，一针能够防治Hps新病原引起的副猪嗜血杆菌病为养殖业迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的提供一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法，该疫苗抗体效价高，特别解决目前由于副猪嗜血杆菌新病原菌而导致的现有疫苗效果不佳的问题，同时有效的简化免疫程序、节省劳动力，降低免疫成本。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的抗原浓缩灭活，配苗时每毫升疫苗中各菌株的菌数≥2.0×10⁹CFU，所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8mg。

进一步地，所述副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株四种菌株抗原液灭活前活菌数≥5.0×10⁹CFU/mL。

进一步地，所述佐剂为优质蜂胶，经乙醇浸提获得。

一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蜂胶乙醇浸出液制备：蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95％乙醇，在37℃浸提48-72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量≥32g/mL；

(2)制备生产用菌种：将副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌种进行繁殖制备生产用菌种，并对该生产用菌种进行纯粹检验；

(3)制备抗原液：将步骤(2)的生产用菌种分别接种到相应的制苗用培养基培养，制备抗原液；并进行纯粹检验；

(4)活菌计数：分别从步骤(3)所获得的四种抗原液中取样，对副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌株进行活菌计数，以确定培养的菌数；

(5)浓缩：将上述四种抗原液分别用中空纤维滤器浓缩，制得抗原浓缩液；

(6)灭活：两种抗原液经0.3％加入甲醛溶液灭活制得灭活抗原液，并进行灭活检验；

(7)疫苗成品完成：根据各菌株菌液活菌计数结果,每毫升疫苗中各菌株菌数含量2.0×10⁹CFU的配苗标准，量取所需量的副猪嗜血杆菌血清4型SD02株浓缩液、血清5型HN02株浓缩液、血清12型GZ01株浓缩液、血清13型JX03株浓缩液置于配苗罐中，按照每毫升疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须≥32g/mL，用注射用水补充至10万毫升；2000rpm搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，继续2000rpm搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化，制得所述副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗。

进一步地，所述步骤(5)中制得抗原浓缩液含菌数应≥1.0×10¹⁰CFU/mL。

进一步地，所述步骤(5)中抗原浓缩液为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌种抗原液的2-4倍浓缩。

进一步地，所述的步骤(7)的佐剂为蜂胶乙醇浸出液，所选蜂胶经乙醇浸提，制备蜂胶乙醇浸出液干物质含量≥50％。

本发明的有益效果是：四价蜂胶灭活疫苗能更好的解决目前由于副猪嗜血杆菌新病原菌而导致的现有疫苗效果不佳的问题，同时减少免疫注射产生的应激性，省时省力，且能获得优良的免疫保护率，结合实际生产带来很大的便利。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗及其制备方法作进一步详细说明

菌种：副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株菌种，由山东华宏生物工程有限公司实验室王晓丽、王永明分离提供。

培养基：TSA培养基、TSB培养基，由实验室自制。

试验动物：3～5周龄健康易感猪由实验动物房提供。

主要试剂：氯化钠(分析纯)、甲醛溶液、蜂胶乙醇提取液由山东华宏生物工程有限公司提供。

一、蜂胶乙醇浸出液制备

蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95％乙醇，在37℃浸提48-72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液(透明栗色溶液)，浸出液的蜂胶干物质含量≥32g/mL。

二、制备生产用菌种

①一级种子繁殖

取副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株冻干菌种分别用含NAD和新生牛血清的TSB培养基溶解后，划线接种于含NAD和新生牛血清的TSA平皿上，置37℃培养24小时，然后按标准挑选5个以上的典型菌落，接种含NAD和新生牛血清的TSA固体培养基，37℃培养24小时，作为一级种子。在2～8℃保存，应不超过5日。在培养基上继代不超过5代。

②二级种子的繁殖

用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子菌落，接种于含10％新生牛血清和16μg/mLNAD的TSB培养基，置37℃振荡培养8～10小时，取样经纯检合格后作为二级种子，在2～8℃保存，应不超过2日。

三、制备抗原液

采用发酵罐分别培养各菌株的菌液。按发酵罐容积总量的70％加入TSB培养基，同时加入0.01～0.02％的消泡剂。蒸汽高压116℃灭菌20min，待其温度降至37～38℃时，加入终浓度为10％的新生牛血清和16μg/mL的NAD，按培养基总量2％～4％加入二级种子菌液，混匀，搅拌转速100～150rpm，37℃发酵培养8～10h。

四、纯粹检查和活菌计数

菌液培养完成后，取样用适宜培养基按现行《中国兽药典》附录进行纯粹检验，应纯粹；同时取样用含NAD和新生牛血清的TSA平板，按现行《中国兽药典》附录进行活菌计数。各菌株培养菌液活菌数应≥5.0×10⁹CFU/mL。

五、浓缩

采用0.22μm中空纤维滤器进行过滤浓缩至每种菌株菌液所含活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/mL。

六、灭活

按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，37℃灭活24小时。灭活后取样分别进行灭活检验，并将灭活菌液置2～8℃保存。灭活结束，取灭活菌液1.0mL接种于含NAD和新生牛血清的100mL的TSB培养基和TSA平板培养基，37℃培养24小时，均应无菌生长。

七、疫苗成品完成

实施例1

(1)量取11120mL所需的副猪嗜血杆菌血清4型SD02株浓缩液，浓缩后菌数为1.8×10¹⁰CFU/mL，量取9530mL副猪嗜血杆菌血清5型HN02株浓缩液，浓缩后菌数为2.1×10¹⁰CFU/mL，量取10000mL所需的副猪嗜血杆菌血清12型GZ01株浓缩液，浓缩后菌数为2.0×10¹⁰CFU/mL量取10530mL所需的副猪嗜血杆菌血清13型JX03株浓缩液，浓缩后菌数为1.9×10¹⁰CFU/mL；

(2)按照每毫升疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须≥32g/mL，缓慢加入乳化罐中，2000rpm搅拌5min；

(3)用注射用水补充至100000mL，置于配苗乳化罐中，2000rpm搅拌15-20min，充分乳化，获得所述的副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗。

八、四价蜂胶灭活疫苗的无菌检验

实施例2

分别在分装前、中、后随机取各批四价蜂胶灭活疫苗5瓶样品，按照《中华人民共和国兽用生物制品规程》附录448页进行无菌检验，结果均无菌生长。

九、四价蜂胶灭活疫苗的安全检验

实施例3

随机抽取各批次疫苗5瓶样品，各批次样品混匀后取样分别肌肉注射3-5周龄的健康易感猪8头，每头注射4.0mL，观察14d，全部健活。

十、四价蜂胶灭活疫苗的抗体效价检验

实施例4

以201204001批疫苗进行试验。

取3～5周龄健康易感猪5头，各肌肉注射疫苗2.0mL，21日后再用同等剂量进行二免，同时设不免疫的5头猪作对照。二免后14日，采血分离血清，用间接血凝试验测定副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型及13型抗体效价，对照猪抗副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型及13型抗体效价均应≤1:4，免疫猪至少4头抗副猪嗜血杆菌血清4型、5型、12型及13型抗体效价均应≥1:32。

表1四价蜂胶灭活疫苗免疫后抗体效价测定

十一、四价蜂胶灭活疫苗的免疫攻毒效力检验

实施例5

取3～5周龄健康易感猪20头，各颈部肌肉注射疫苗2.0mL，21日后再用同等剂量进行二免，同时设未免疫20头猪作对照。二免后14日进行攻毒。取免疫猪5头和对照猪5头，各腹腔内注射一个最小发病量的血清4型SD02株或血清5型HN02或血清12型GZ01株或血清13型JX03株强毒菌液2.0mL，观察14日，各对照组应至少4/5发病，免疫组应至少4/5保护。(见表2～表5)

表2四价蜂胶灭活疫苗对SD02株攻毒保护结果

表3四价蜂胶灭活疫苗对HN02株攻毒保护结果

表4四价蜂胶灭活疫苗对GZ01株攻毒保护结果

表5四价蜂胶灭活疫苗对JX03株攻毒保护结果

Claims (7)

1.一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗，包括抗原和佐剂，其特征在于，所述抗原为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的抗原浓缩灭活，配苗时每毫升疫苗中各菌株的菌数≥2.0×10⁹CFU，所述佐剂为蜂胶乙醇浸出液，配苗时每毫升疫苗中蜂胶干物质含量为8mg。

2.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗，其特征在于，所述副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株四种菌株抗原液灭活前活菌数≥5.0×10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求1所述的副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗，其特征在于，所用佐剂为优质蜂胶，经乙醇浸提获得。

4.一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)蜂胶乙醇浸出液制备：蜂胶在低温下贮存，使用时先将蜂胶置-15℃冷冻24-48h，再用冷冻粉碎机磨碎过筛，按1:4的比例加入95％乙醇，在37℃浸提48-72h，冷却、过滤，即得纯净蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量≥32g/mL；

(2)制备生产用菌种：将副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌株进行繁殖制备生产用菌种，并对该生产用菌种进行纯粹检验；

(3)制备抗原液：将步骤(2)的生产用菌种分别接种到相应的制苗用培养基培养，制备抗原液；并进行纯粹检验；

(4)活菌计数：分别从步骤(3)所获得的四种抗原液中取样，对副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌液进行活菌计数，以确定培养的菌数；

(5)浓缩：将上述四种抗原液分别用中空纤维滤器浓缩，制得抗原浓缩液；

(6)灭活：将四种抗原液经0.3％加入甲醛溶液灭活制得灭活抗原液，并进行灭活检验；

(7)疫苗成品完成：根据各菌株菌液活菌计数结果,每毫升疫苗中各菌株菌数含量2.0×10⁹CFU的配苗标准，量取所需量的副猪嗜血杆菌血清4型SD02株浓缩液、血清5型HN02株浓缩液、血清12型GZ01株浓缩液、血清13型JX03株浓缩液置于配苗罐中，按照每毫升疫苗中含蜂胶干物质8mg的标准量取蜂胶乙醇浸出液，浸出液的蜂胶干物质含量须≥32g/mL，用注射用水补充至10万毫升；2000rpm搅拌5分钟，然后缓慢加入蜂胶乙醇浸出液，继续2000rpm搅拌15～20分钟，使其充分混合乳化，制得所述副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗。

5.根据权利要求4所述的一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中制得抗原浓缩液含菌数应≥1.0×10¹⁰CFU/mL。

6.根据权利要求4所述的一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中抗原浓缩液为副猪嗜血杆菌血清4型SD02株、血清5型HN02株、血清12型GZ01株和血清13型JX03株的菌种抗原液的2-4倍浓缩。

7.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌病四价蜂胶灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(7)的佐剂为蜂胶乙醇浸出液，所选蜂胶经乙醇浸提，制备蜂胶乙醇浸出液干物质含量≥50％。