CN109957509A - 一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 - Google Patents
一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109957509A CN109957509A CN201910255501.7A CN201910255501A CN109957509A CN 109957509 A CN109957509 A CN 109957509A CN 201910255501 A CN201910255501 A CN 201910255501A CN 109957509 A CN109957509 A CN 109957509A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virulent strain
- freeze
- low virulent
- drying
- streptococcusagalactiae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 title claims abstract description 35
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 title claims abstract description 35
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 23
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 11
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 10
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 10
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 abstract description 20
- 241000276701 Oreochromis mossambicus Species 0.000 abstract description 15
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 11
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 6
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000011814 protection agent Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 241000194056 Streptococcus iniae Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术，所述方法包括弱毒株冻干保护剂、复苏液制备方法和复苏技术。本发明的罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种及复苏技术能保持无乳链球菌弱毒株免疫活性，且冻干保护剂配方和复苏液成分简单，成本低，易配制，利于长期保存，本发明为今后广泛使用罗非鱼无乳链球菌弱毒疫苗提供前期基础。
Description
技术领域
本发明涉及菌株冻干保存及复苏技术，具体涉及罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术。
背景技术
链球菌病是罗非鱼养殖业最为严重的病害之一，每年造成巨大经济损失。我国是罗非鱼养殖大国，每年因链球菌病给水产养殖造成直接经济损失约10亿美元。自2001年开始，中国罗非鱼养殖陆续出现了链球菌病感染，并在个别养殖场造成30-50%高死亡率，按我国罗非鱼年均产量计算，估计每年链球菌病给我国罗非鱼产业造成直接经济损失超过5亿美元。药物只能在早期起到控制病情的辅助性作用，随着耐药和抗药性的产生和积累，病害暴发与随之带来的产品安全问题已成为制约罗非鱼产业发展的瓶颈。
疫苗是有效控制该病发生方法之一。自1995年以色列学者Eldar A报道通过免疫接种预防罗非鱼链球菌病开始，美国（Klesius等,1999;Pridgeon等,2011）、中国（Sun等,2010）、日本(Dumronghol等,2009)和韩国(Shin等，2007)等国家多个实验室先后开展了罗非鱼链球菌病灭活疫苗研究，并在试验室取得很好免疫效果。但由于研制的灭活疫苗只能激发鱼体的体液反应而无法提供有效免疫应答，并只能通过注射方法达到防治效果，操作不方便，因此灭活疫苗一直未能在生产上推广使用。而弱毒疫苗具有免疫剂量低、免疫效果好、保护期长等特点，且可以在鱼体内短暂停留，诱导体内体液反应和细胞反应，然后在体内自行消失。美国Pridgeon等通过抗生素筛选方法获得了海豚链球菌和无乳链球菌弱毒株；Huang 等利用基因工程技术获得基因重组弱毒疫苗，它们免疫试验都证明了弱毒疫苗具有较高免疫保护率。本实验室前期通过温差传代快速培养方法获得一株无乳链球菌弱毒株YM001，该弱毒株具有良好安全性和免疫原性，注射免疫后第15d相对免疫保护率为96.88%，30d相对免疫保护率为93.61%，对罗非鱼链球菌病的防治具有巨大开发价值。虽然弱毒株具有良好免疫原性，但是其在常温下活力差，不易于长期保存。而冷冻干燥是保存细菌最方便和最成功方法之一，能使保存细菌不易受污染，可长期存放，易于分装和再复苏使用，而目前关于无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于找到一种能保持罗非鱼源无乳链球菌弱毒株具有良好稳定性和免疫原性方法，且便于长期保存，为今后推广应用无乳链球菌病弱毒疫苗提供前期基础研究。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：
罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存方法，其特征在于包括以下内容：
（1）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法所述无乳链球菌弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2014045，保藏日期2014年2月26日，生物材料样品分类命名: 无乳链球菌YM001Streptococus agalactiae。
（2）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001扩大培养；
（3）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种的冻干保护剂包括：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%组成，余量为水，116℃灭菌30 min，获得冻干保护剂；
（4）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株与冻干保护剂按照7:1比例混合，进行冻干，获得冻干无乳链球菌弱毒株。
罗非鱼源无乳链球菌冻干弱毒株复苏技术，其特征在于：复苏液为水，复苏后冻干弱毒株稳定性及免疫原性未发生改变。
具体地：
（1）罗非鱼弱毒株扩大培养
将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001，先划线接种至血平板培养。挑单个菌落接种于改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）培养，获得种子液。将培养种子液按1.0%接种量接入装改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）中培养，离心，弃上清，留沉淀物。
（2）罗非鱼无乳链球菌弱毒株冻干保护剂筛选
对蔗糖、明胶、脱脂奶粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）不同组合及比例与YM001进行冻干。
（3）根据步骤（2）冻干前后细菌数变化最少，筛选获得最佳冻干保护剂，与罗非鱼源无乳链球菌弱毒株以1:7比例混合后，将弱毒株按照合适冻干曲线进行冻干。
（4）冻干后弱毒株物理性状观察
冻干后弱毒株物理性状观察包括弱毒株颜色、冻型、是否易与瓶壁脱离性、溶解性等。
（5）冻干弱毒株复苏液筛选
用水、PBS（磷酸缓冲盐溶液）、1%生理盐水及马丁培养基四种溶液对冻干弱毒株进行复苏，以冻干前后细菌数变化少，作为弱毒株冻干复苏液。
（6）冻干弱毒株安全性测定
将冻干弱毒株注射罗非鱼，进行安全返毒试验，连续盲传5代。观察注射后鱼死亡情况，测定其安全性。
（7）冻干弱毒株免疫原性测定
取保存180d、360d、540d冻干弱毒株注射罗非鱼，在免疫后第15d、30d、60d各用强毒株HN016进行腹腔注射感染，每次注射20尾，设立对照组。攻毒后饲养观察20d，每天记录试验鱼发病及死亡情况，并用血平板对死亡实验鱼脑和肝组织进行细菌分离鉴定，并计算相对免疫保护率。相对免疫保护率（RPS）=（对照组死亡率-免疫组死亡率）/对照组死亡率。
本发明所具有优点：
本发明的菌株冻干保种方法操作简单、实用性强，安全、稳定，能很好保持弱毒菌株免疫原性，复苏液能恢复弱毒株冻干前活性，并且本发明的冻干保护剂配方和复苏液成分简单，成本低，易配制，该方法为今后成功研制罗非鱼无乳链球菌疫苗奠定基础。
具体实施方式
实施例1 无乳链球菌弱毒株复苏、扩大培养
本发明所用弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC M2014045。
将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株YM001，划线接种至5%血平板，28℃培养24 h。挑单个菌落接种于100 mL改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖），28℃振荡培养12h。将培养 12h的种子液按1.0%接种量接入装 2L改良马丁培养基（2%胎牛血清，0.2%葡萄糖）中，35℃培养24h后，离心5min，10000×g。弃上清，留沉淀物。
吸取菌液100µl到50mLPBS中混匀，从混合液中吸取100µl的菌液至另一个50mL的PBS中混匀，最后吸取100µl的菌液到血平板中均匀涂布，设三个平行，取三者平均值，计算出冻干前弱毒株活菌总数CFU。
存活率计算公式：
存活率(％)=冻干后活菌数（每瓶）／冻干前活菌数×100
实施例2 冻干保护剂筛选
先将四种保护剂按照下述比例各配制100ML，116℃灭菌30 min，待用。
保护剂Ⅰ：蔗糖40%、明胶12%；
保护剂Ⅱ：蔗糖40%、明胶12%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%；
保护剂Ⅲ：蔗糖40%、脱脂奶粉10%；
保护剂Ⅳ：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%。
用PBS调整菌液体积至84mL，平均分装至12个10mL的冻干瓶中，计算冻干前活菌数。再按菌液与最佳保护剂7:1比例在冻干瓶中分别加入保护剂Ⅰ-Ⅳ，对照组不添加保护剂，每个试验组均设三个平行，冻干后细菌数计算取三者平均值。按-4℃进箱，-40℃维持约2h，板层由-40℃升至-5℃，维持20h，板层温度提高到28℃，维持8h，全程约32h。结束后压盖，打开真空阀，结束冻干过程。完成后用超纯水溶解，分别检测4种不同保护剂冻干后所含活菌数CFU。采用SPSS17.0 Duncan方法单因素方差进行分析，P<0.05为差异显著。
疫苗冻干前平均活菌数为6.95×109cfu/g，加保护剂冻干后，保护剂Ⅰ平均活菌数为4.78×109 cfu/g，保护剂Ⅱ平均活菌数为4.67×109cfu/g，保护剂Ⅲ平均活菌数为5.35×109cfu/g，保护剂Ⅳ平均活菌数为5.45×109cfu/g，冻干成活率最高，对照组平均活菌数为3.63×109cfu/g，结果见表1。保护剂组和对照组差异显著，P<0.05。保护剂Ⅰ与Ⅱ差异不显著P>0.05，但与保护剂Ⅲ和Ⅳ差异显著，P<0.05；保护剂Ⅲ和Ⅳ差异不显著P>0.05，但是保护剂Ⅲ和Ⅳ与保护剂Ⅰ和Ⅱ差异极显著，P<0.05。
实施例3 冻干弱毒株复苏液筛选
先将四种复苏液按照下述比例各配制100ML，121℃灭菌20 min，备用。
复苏液Ⅰ：水；复苏液Ⅱ：PBS；复苏液Ⅲ：1%生理盐水；
复苏液Ⅳ：马丁培养基，高压灭菌后加2.0％小牛血清。
用PBS调整菌液体积到84mL，加入12 mL冻干保护剂，记录冻干前活菌数CFU。等体积分装菌液至12个10 mL的疫苗冻干瓶，按冻干程序冻干。完成后每瓶分别加入1mL复苏液I-Ⅳ，检测冻干后4种复苏液后分别所含活菌数CFU，比较冻干前后细菌数变化，获得冻干后弱毒株复苏液。
弱毒株冻干前血平板活菌平均数为6.8×109cfu/g，冻干后加复苏液，复苏液I活菌平均数为5.31×109 cfu/g，复苏液Ⅱ活菌平均数为3.91×109cfu/g，复苏液Ⅲ活菌平均数为4.93×109cfu/g，复苏液Ⅳ活菌平均数为3.51×109cfu/g，复苏液I复苏效果最好，差异显著，P<0.05，结果见表2。
实施例4 冻干弱毒株保存温度与保存时间研究
加PBS调整菌液体积到98 mL，加入14 mL冻干保护剂，平均分装至24个10 mL的冻干瓶中，计算冻干前活菌数。按冻干程序进行冻干，冻干后各取24瓶于室温25℃、4℃、-20℃保存。分别在第0 d、15 d、30d、60d、90d、180 d、360d和540d各取3瓶进行复苏，每瓶冻干株加入复苏液1mL，分别检测冻干后在不同温度相同时间下保存的弱毒株细菌数。
弱毒株在25℃保存不同天数与4℃、-20℃保存不同天数均差异极显著，P>0.05；4℃、-20℃在第15d 差异不显著，P<0.05，但第30d、60d、90d、180d、360d、540d差异极显著，P>0.05。-20℃间保存天数越长，冻干弱毒株细菌数还是有下降，但是对其免疫原性影响小，结果见表3。
实施例5 冻干后弱毒株物理性状观察
冻干弱毒株外观呈乳白色疏松团块，易于与瓶壁脱离，加稀释液后溶解速度快，无菌检验合格。
实施例6 冻干弱毒株安全性测定试验
设冻干组和对照组共 2组，其中每组75尾鱼，分为5个小组，15尾/组。培养 YM001 至1.0×109CFU/mL，第1小组（免疫组）每尾鱼免疫注射0.2mL YM001，第2小组（对照组）注射0.2mL TSB。48h后分别随机捞取免疫组和对照组各10尾鱼肝脏于研钵中匀浆，加入 PBS4mL，等量注射至第2小组。重复上述方法至第 5小组，每天记录各组鱼死亡数和临床症状。
YM001 在鱼体内连续传5代，未发现罗非鱼发病死亡或其他临床症状，证明了YM001 冻干后其安全性未受影响，无返毒。
实施例7 冻干弱毒株免疫原性测定
取保存180d、360d、540d冻干弱毒株注射罗非鱼，对照组注射加PBS冻干的弱毒株。在免疫后第15d、30d、60d各用强毒株HN016进行腹腔注射感染，每个试验组设3个平行组（20尾/组），同时设立对照组。攻毒后连续观察20d，每天记录试验鱼发病及死亡情况，并用血平板对死亡实验鱼脑和肝组织进行细菌分离鉴定，并计算相对免疫保护率。相对免疫保护率（RPS）=（对照组死亡率-免疫组死亡率）/对照组死亡率。
冻干弱毒株后免疫原性结果显示，随着保存时间增长，YM001相对免疫保护率94.83%降至93.22%，虽然降低了1.61%,结果见表4，但是其免疫原性并未发生较大改变，冻干方法是弱毒菌株保存最好方法。
综上所述，本发明的罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干复苏后安全性、免疫原性未发生明显改变，该方法可为其他弱毒株保存提供借鉴，同时也为成功研究无乳链球菌弱毒疫苗提供基础。
Claims (2)
1.一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存方法，其特征在于包括以下内容：
（1）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种制备方法所述弱毒菌株YM001保藏于中国典型培养物培养中心，保藏号为：CCTCC M 2014045；
（2）罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保种的冻干保护剂包括：蔗糖40%、脱脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）0.8%组成，余量为水，116℃灭菌30 min，获得冻干保护剂；
（3）将罗非鱼源无乳链球菌弱毒株与冻干保护剂按照7:1比例混合，进行冻干，获得冻干无乳链球菌弱毒株。
2.罗非鱼源无乳链球菌冻干弱毒株复苏技术，其特征在于：复苏液为水，复苏后冻干弱毒株稳定性及免疫原性未发生改变。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910255501.7A CN109957509A (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910255501.7A CN109957509A (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109957509A true CN109957509A (zh) | 2019-07-02 |
Family
ID=67025516
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910255501.7A Pending CN109957509A (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109957509A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662633A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-16 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | II型草鱼呼肠孤病毒冷适应株GCRV-GD108ca及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152368A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-11-19 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 罗非鱼源无乳链球菌弱毒株及应用 |
| CN104906568A (zh) * | 2015-04-09 | 2015-09-16 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗 |
-
2019
- 2019-04-01 CN CN201910255501.7A patent/CN109957509A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104152368A (zh) * | 2014-03-11 | 2014-11-19 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 罗非鱼源无乳链球菌弱毒株及应用 |
| CN104906568A (zh) * | 2015-04-09 | 2015-09-16 | 广西壮族自治区水产科学研究院 | 一种罗非鱼无乳链球菌病口服弱毒冻干疫苗 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 郝乾坤: "《药用微生物技术》", 31 August 2015, 重庆大学出版社 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112662633A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-16 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | II型草鱼呼肠孤病毒冷适应株GCRV-GD108ca及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mahony et al. | Stable L-forms of Clostridium perfringens and their growth on glass surfaces | |
| CN104689310B (zh) | 一种嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌二联口服缓释微球疫苗及制备方法 | |
| CN102847146B (zh) | 一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗 | |
| CN108441446A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗及其生产方法和应用 | |
| CN108676778A (zh) | 一株防治土传青枯病的噬菌体及其应用 | |
| CN101338295A (zh) | 双歧杆菌冷冻浓缩发酵剂及其制备方法 | |
| CN101463333A (zh) | 高活性蜡样芽孢杆菌Bacillus cereusCMCC63305菌株的培养及保护方法 | |
| Cepeda et al. | Improved growth of Flavobacterium psychrophilum using a new culture medium | |
| CN108486012A (zh) | 鸭传染性浆膜炎活疫苗及其制备方法 | |
| CN104232535B (zh) | 鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用 | |
| CN104152368A (zh) | 罗非鱼源无乳链球菌弱毒株及应用 | |
| CN104498441A (zh) | 鸭甲肝病毒iii型弱毒株及由其制备的活疫苗和应用 | |
| CN104306963A (zh) | 一种猪丹毒活疫苗的生产方法 | |
| CN108018230A (zh) | 一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用 | |
| CN104109649B (zh) | 粘质沙雷氏菌NlM280及作为杀虫剂的应用 | |
| CN109957509A (zh) | 一种罗非鱼源无乳链球菌弱毒株冻干保存及复苏技术 | |
| CN104087559B (zh) | 一种传染性法氏囊病毒、灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN109182129A (zh) | 一种细菌保护剂及其应用 | |
| Mangunwiryo et al. | Studies on the carrier state of infectious pancreatic necrosis virus infections in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson | |
| CN101474410A (zh) | 一种动物用活疫苗耐热冻干保护剂及其制备方法 | |
| CN101081297A (zh) | 禽多杀性巴氏杆菌活疫苗及其制备方法 | |
| CN106520623B (zh) | 一种血清7型副猪嗜血杆菌弱毒株及其应用 | |
| CN103301452A (zh) | 一种猪乙型脑炎冻干疫苗及其制备方法 | |
| CN107365720B (zh) | 一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用 | |
| CN105727275A (zh) | 一种鸭肝炎二价活疫苗及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190702 |