CN104232535B

CN104232535B - 鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用

Info

Publication number: CN104232535B
Application number: CN201410440154.2A
Authority: CN
Inventors: 夏立群; 陈建林; 鲁义善; 简纪常; 蔡佳; 张红莲
Original assignee: Guangdong Ocean University
Current assignee: Shenzhen Yihai Biotechnology Co., Ltd.; Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Priority date: 2014-09-02
Filing date: 2014-09-02
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2034-09-02
Also published as: CN104232535A

Abstract

本发明涉及一种鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用，属于菌株诱变技术领域；具体为一株鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1 (Nocardia seriolae NSX1)，菌种保藏号为CGMCC NO.9437；一种免疫组合物，包含鰤鱼诺卡氏菌弱毒株作为免疫原性组分，其中鰤鱼诺卡氏菌弱毒株的浓度为10³‑10⁹CFU/ml；该鰤鱼诺卡氏菌弱毒株用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药物，具有显著的低毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致病菌株或毒力株导致的鰤鱼诺卡氏菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的防治效果。

Description

鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用

技术领域

本发明涉及一种鱼类诺卡氏菌的诱变及其应用，具体涉及一种鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株及其应用，属于菌株诱变技术领域。

背景技术

鱼类诺卡氏菌病是池塘养殖、浮筏式网箱养殖和深水网箱养殖模式中的常见病害之一，是一种慢性系统性肉芽肿疾病，鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是其主要的致病菌。该病能在鱼体内及体表形成大量结节，还会引起鱼类体表出血及溃疡，严重影响成鱼的商品价值，其感染率和死亡率都较高,自然发病率可达到15～30％，严重时可达50～60％，平均死亡率约20％，人工感染的死亡率可高达90％～100％。近年来鱼类诺卡氏菌病在我国和东南亚地区呈上升趋势，染病的鱼种不断增加(据不完全统计已有近20种)，造成的经济损失也日益严重。根据已有报道，在我国鰤鱼诺卡氏菌感染的鱼种既有卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)、暗纹东方鲀(Fugu obscurus)、鲈(Lateolabrax japonicus)和花身鯻(Terapon jarbua)等海水鱼类，又有乌鳢(Channamaculata)、大口黑鲈(Micropterus salmoides)等淡水鱼类。

传统意义上，治疗和预防鱼类细菌病主要依赖其菌株敏感性的抗生素。然而，由于诺卡氏菌主要存在于患病鱼体的结节中，药物的临床应用基本无效，目前尚无该病害的有效防治措施。再加上抗生素的滥用还会引起鱼体药物残留、造成环境污染、破坏水体有益菌群平衡等更为严重的问题。因此，为避免上述问题的产生，且能有效控制该病的发生与流行，我们必须不遗余力地研发出实用性和可操性强的免疫防控新技术，其中首当其冲的是高效疫苗的研制，这代表了当今国际水产业发展的前沿与趋势。

然而从世界范围来看，鱼类诺卡氏菌疫苗的研发进程不甚理想，因为与其他鱼类致病菌不同，研究发现鰤鱼诺卡氏菌的多种灭活疫苗基本不能提供免疫保护作用，这使得灭活疫苗的开发路线丧失了可行性。减(弱)毒活疫苗因具有给药方便(可浸泡给药)、免疫效价高(可减少给药剂量)、成本低廉、可开发广谱疫苗(活菌疫苗往往具有交叉保护性)的技术优势，已成为当前国际上水产养殖用疫苗研究和开发的热点和前沿领域。为了打破鱼类诺卡氏菌疫苗的研究困境，筛选弱毒株、研制高效安全的鰤鱼诺卡氏菌活疫苗应是行之有效的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株、相关制剂及应用，具有显著的低毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致病菌株或毒力株导致的鰤鱼诺卡氏菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的防治效果。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：

一株鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1(Nocardia seriolaeNSX1)，于2014年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.9437。

一种免疫组合物，包含上述鰤鱼诺卡氏菌弱毒株作为免疫原性组分。本发明免疫组合物中，所述鰤鱼诺卡氏菌弱毒株的浓度为10³-10⁹CFU/ml。本发明免疫组合物，还可包含磷酸缓冲液。

鰤鱼诺卡氏菌弱毒株可以用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药物。

本发明的有益效果在于：

1.本发明的鰤鱼诺卡菌株诱变弱毒株是经过紫外和化学试剂多重诱变，筛选后获得，相对于野生毒株ZJ0503具有显著的低毒效果，同时能有效地保护鱼类免受诺卡氏菌病致病菌株或毒力株导致的鰤鱼诺卡氏菌的侵害，免疫效果显著，具有非常好的诺卡氏菌病的防治效果；

2.本发明的鰤鱼诺卡菌株诱变弱毒株不携带任何抗生素抗性标记和其它标记，对环境不存在传播抗生素抗性的潜在危险；无任何外源性基因片段，极大消除向环境传播大量毒性病原体的可能性，具有技术上的环境和产品安全性，有实际的商业开发应用价值；

3.本发明的鰤鱼诺卡菌株诱变弱毒株为活疫苗的商业化进程提供了现实的开发和应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

本发明实施方式之一提供了一种鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株。具体地说，从患诺卡氏菌病的卵形鲳鲹中分离获得了一株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503，以鰤鱼诺卡氏菌野生菌株ZJ0503为基础，经过紫外和化学多重诱变，筛选得到了一株颜色与ZJ0503不同(ZJ0503菌落呈淡黄色，而该菌株颜色为黄色)且在斑马鱼模型上具有显著减毒效果的天然弱毒株，将其命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1(Nocardia seriolae NSX1，后文简称“NSX1”)，于2014年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNo.9437。其特点是，它是鰤鱼诺卡氏菌野生毒株的诱变弱毒株，因此该弱毒株不携带任何外源性基因片段。

本发明的鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株可按照鰤鱼诺卡氏菌常规培养方法进行培养。例如，培养基可选用BHI培养基和鰤鱼诺卡氏菌改良培养基(夏立群等，鰤鱼诺卡氏菌培养条件及培养基的优化，南方水产科学，2013，9(3):51-56)，于25-28℃固体或液体培养。本发明实施例之一选用了鰤鱼诺卡氏菌改良培养基。

本发明的另一实施方式提供了一种免疫组合物，其中包含本发明的鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1作为免疫原性组分。本发明的免疫组合物还可以包含各种适宜的载体和免疫佐剂。所述载体例如无菌磷酸缓冲液和生理盐水。本发明实施例之一采用无菌磷酸缓冲液作为载体。所述免疫组合物的pH以生理pH、尤其是目标鱼类的体内生理pH为宜，例如pH6-8和pH 7-7.2。

本发明免疫组合物的形式之一是即用组合物，其中作为免疫原性组分的本发明弱毒株NSX1的浓度可以采用常规技术手段试验确定，也可参照本领域实践经验来试验确定。例如，本发明的免疫组合物中，所述鰤鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1浓度的数量级为10³-10⁹CFU/ml，例如10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹CFU/ml，或者以上所述任意两两构成的区间，例如10³-10⁸CFU/ml。本发明实施例之一的注射剂型中，所述鰤鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1浓度的数量级为10⁴-10⁹CFU/ml。

本发明的另一实施方式提供了一种防治鱼类诺卡氏菌病的方法，采用本发明的鰤鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1来免疫鱼类。可以将本发明的弱毒株NSX1作为疫苗使用，也可以将其和合适的免疫组合物配置使用。水产养殖业常规免疫方式均适用于本发明，例如注射、浸泡和口服。适宜的使用浓度为10³-10⁹CFU/ml，或者10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹CFU/ml，或者以上所述任意两两构成的区间，例如10³-10⁸CFU/ml。或者，免疫剂量可以是10²-10⁹CFU/尾，或者10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹CFU/尾，或者以上所述任意两两构成的区间，例如10²-10⁸CFU/尾，10³-10⁹CFU/尾等。又或者，免疫剂量可以是10²-10⁹CFU/g(体重)，或者10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹CFU/g，或者以上所述任意两两构成的区间，例如10²-10⁸CFU/g，10¹-10⁷CFU/g等。例如，注射免疫时，弱毒株亦即疫苗株剂量的数量级可以是10⁴CFU/g(体重)。

本发明用下列实施例来进一步说明。

实施例1弱毒活疫苗的制备

(一)鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株的诱变、筛选和鉴定

1、鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503菌悬液的制备

2005年03月本实验室从广东省湛江港和阳江闸坡海水网箱养殖场的患结节病卵形鲳鲹中分离所得一株鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503(黄郁葱等，卵形鲳鲹结节病病原的分离与鉴定，广东海洋大学学报，2008,28(4):49-53)。将保存于-80℃冰箱的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌种划线于BHI固体培养基上，于28℃恒温倒置培养7d，挑取单菌落于无菌磷酸缓冲液中，混匀制成菌悬液。

2、紫外诱变

分别吸取0.1ml ZJ0503菌悬液涂布到含有0.3％～0.5％氯化锂(LiCl，是一种诱变剂)的鰤鱼诺卡氏菌改良固体培养基平板上。涂布接种后的平板在30W紫外灯、照射距离65cm的无菌条件下分别紫外诱变1min、2min、5min、10min、15min和30min，每个照射时间设置3个平行样品。将经紫外线诱变后的所有平板置于28℃培养24-48h。同时将接种后未经紫外线诱变的平板在相同条件下培养，作为对照。培养后，统计各皿菌落数和菌落形态突变菌落数，计算不同剂量紫外诱变处理的菌落致死率和菌落形态突变率。计算公式如下：

选取致死率为90％左右的平板，挑取单菌落(重点选取菌落形态发生改变的菌落)，分别继续进行下一代的紫外诱变和亚硝酸诱变，诱变持续20代左右。

3、亚硝酸诱变

所需试剂：

A.1mol/L pH4.5的醋酸缓冲液：取1mol/L醋酸溶液126mL，加入1mol/L醋酸钠溶液126mL。

B.0.1mol/L亚硝酸钠溶液：称取0.69gNaNO2定容于100mL蒸馏水中。

C.0.07mol/L pH8.6Na2HPO4溶液：称9.94gNa2HPO4定容于100mL蒸馏水中。

实验步骤：

(1)制备菌悬液

(2)取菌悬浮液2mL，加入0.1mol试剂B和1mL试剂A(NaNO2终浓度为0.025mol/L)，28℃保温诱变5min，10min，15min和20min。

(3)处理结束后，加入适量试剂C，使pH调整为7，诱变作用终止。

(4)分别取100μL处理液在含0.3％～0.5％LiCl的改良培养基平板上进行涂布，每个诱变时间梯度做3个重复。

(5)将诱变后的培养平板放入28℃的恒温培养箱中培养48小时，统计各皿菌落数和菌落形态突变菌落数，计算不同时间亚硝酸处理的菌落致死率和菌落形态突变率。计算公式如下：

(6)选取致死率为90％左右的平板，挑取单菌落(重点选取菌落形态发生改变的菌落)，分别继续进行下一代的紫外诱变和亚硝酸诱变，诱变持续20代左右。

4、弱毒株筛选和鉴定经将紫外、氯化锂、亚硝酸多重诱变约20代后，找到5株菌落形态发生明显改变的菌株，分别命名为NSX1、NHX5、NHX10、NZX15和NZX20。将5株突变株与野生毒株ZJ0503的菌悬液分别腹腔注射斑马鱼(10μL/尾)，每组50尾，并设置无菌磷酸缓冲液对照组。注射后观察2周，记录斑马鱼的死亡情况，统计死亡率。筛选出毒性较野生毒株ZJ0503明显减弱的弱毒株NSX1。对弱毒株NSX1的16S rDNA进行PCR扩增及测序，通过NCBIBlast比对发现其16S rDNA序列与鰤鱼诺卡氏菌种的同源度在98％～99％之间。将该诱变弱毒株命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1(Nocardia seriolae NSX1)，并于2014年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCC No.9437。

(二)活疫苗的制备

1.培养基与磷酸缓冲液的配制：

1)斜面培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，K2HPO4 0.75g/L，CaCl2 0.2g/L(单独灭菌)，NaCl 5g/L，琼脂15g/L，pH 6.5±0.2；

2)种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，K2HPO4 0.75g/L，CaCl2 0.2g/L(单独灭菌)，NaCl 5g/L，pH 6.5±0.2；

3)发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，K2HPO4 0.75g/L，CaCl2 0.2g/L(单独灭菌)，NaCl 5g/L，pH 6.5±0.2；

4)磷酸缓冲液(PBS)：NaCl g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4 1.42g/L，KH2PO4 0.27g/L，pH7.4，121℃灭菌20分钟。

2.活疫苗组合物的制备：

取一接种环保存于斜面培养基上的弱毒株NSX1种子，接种于装有100ml液体种子培养基的500ml摇瓶，在28℃下振荡培养(转速130转/分钟)。36小时后，取5ml生长旺盛的菌液接种于100ml新鲜发酵培养基，28℃培养36小时。用磷酸缓冲液洗涤3次，离心收获菌体(8000rpm，15分钟，15℃)，无菌磷酸缓冲液稀释成一定浓度菌悬液(10³～10⁹CFU/ml)，由此制得含有弱毒株NSX1作为活疫苗的免疫组合物，保藏于15℃备用。

实施例2鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1的致病力检测

在实验室条件下，以斑马鱼作为模式动物对诱变筛选获得的鰤鱼诺卡氏菌弱毒株NSX1进行毒力检测。试验用斑马鱼(平均体长2.5～3cm，体重约0.2g)先置于洁净水箱适应养殖1周，以剔除不正常个体，死亡率应低于2％。在感染试验前，将试验用鱼随机分组，每组2个水箱平行试验，每箱(20L)养殖50条。试验水箱每天使用充氧24h以上的自来水替换1/2体积养殖水，水温28±2℃。在感染试验中，每组试验鱼用一定梯度剂量(10⁷～10¹⁰CFU/ml)的鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503和弱毒株NSX1通过腹腔注射进行人工感染。注射量10μL/尾，注射后观察7天，记录每个感染剂量下每天的死亡尾数，并计算累计死亡率，测定LD50值(见表1)。斑马鱼半数致死量(LD50)由LD50数据处理软件(蓝宙工作室，Version 1.01)计算。

表1.鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1对斑马鱼半致死剂量LD50

以上结果显示NSX1具有显著的弱毒特性，相对于鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503减毒至少1000倍，弱毒特性明显，适宜用作弱毒活疫苗和用来生产免疫组合物。

实施例3鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1的免疫保护率评价

以斑马鱼为试验动物进行免疫保护试验，试验斑马鱼随机分为3组，每组3个平行水箱，16尾/箱。用弱毒株NSX1作为活疫苗采用腹腔注射方式免疫斑马鱼，注射免疫剂量为10⁷CFU/尾。对照组注射无菌磷酸缓冲液。免疫14天后对各组斑马鱼用鰤鱼诺卡氏菌野生毒株ZJ0503进行人工感染攻毒，攻毒剂量为10⁶CFU/尾。在14天内观察统计对照组和免疫组死亡数，计算每组的免疫保护率(见表2)。

其中，按下列公式计算免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)％＝(对照组死亡率–免疫组死亡率％)/对照组死亡率×100％。

表2.鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1对斑马鱼的免疫保护力评价

从上述数据可以看出，弱毒株NSX1具有良好的抗鰤鱼诺卡氏菌感染防治效果，注射免疫4周后的免疫保护率达到98％，而没有接种疫苗的鱼类死亡率高达79％，说明本发明的鰤鱼诺卡氏菌弱毒株具有明显的减毒特性和良好的免疫保护力，适合用作鱼类活菌疫苗和用来生产免疫制剂。

综上，本发明的鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株NSX1具有非常显著的减毒效果，并在斑马鱼动物模型上具有非常良好的抗鰤鱼诺卡氏菌免疫保护效果，同时消除了传统抗生素药物防治所存在的潜在环境和产品安全风险，是针对养殖鱼类的诺卡氏菌病的一种安全、有效、经济的疫苗。

Claims

1.一株鰤鱼诺卡氏菌诱变弱毒株，其特征在于：命名为鰤鱼诺卡氏菌NSX1(Nocardiaseriolae)，其菌种保藏号为CGMCC NO.9437，保藏日期2014年7月10日。

2.一种免疫组合物，其特征在于：鰤鱼诺卡氏菌NSX1弱毒株作为免疫原性组分，其菌种保藏号为CGMCC NO.9437，保藏日期2014年7月10日。

3.根据权利要求2所述的一种免疫组合物，其特征在于，所述鰤鱼诺卡氏菌NSX1弱毒株的浓度为10³-10⁹CFU/ml。

4.鰤鱼诺卡氏菌NSX1弱毒株的应用，其菌种保藏号为CGMCC NO.9437，保藏日期2014年7月10日，其特征在于：用于制造抗鱼类诺卡氏菌病的药物。