CN101903042A - 鱼疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于对抗鱼类细菌感染的不含诺卡菌(Nocardia)的组合疫苗，涉及用于制备这样的疫苗的细菌的用途，涉及制备这样的疫苗及相应试剂盒的方法。

Description

鱼疫苗
本发明涉及用于对抗鱼类细菌感染的不含Nocardia(诺卡氏菌)的组合疫苗，涉及细菌用于制备这样的疫苗的用途，涉及制备这样的疫苗及相应试剂盒的方法。
在过去的几十年，可以看到世界范围内鱼类消费的巨大增长。这也涉及到比如鲑鱼、大菱鲆鱼(Turbot)、大比目鱼(Halibut)、和鳕鱼这样的冷水鱼以及比如尖吻鲈(Asian sea bass)、罗非鱼、遮目鱼、黄尾鱼(yellowtail)、琥珀鱼、石斑鱼、鲷鱼和海鲡这样的热带鱼的消费。
因此，为满足该日益增长的消费，已经可以看到渔场数量和规模的增长。
正如从畜牧学可知的，大量近距离聚居的动物易于受到各种各样疾病的侵袭，甚至受到在大规模商业化农场出现之前几乎未知或未见、或者甚至是未知的疾病的侵袭。对于渔场也同样有这样的情况。发现对鱼类致病的细菌属于诺卡氏菌属(Nocardia)、弧菌属(Vibrio)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、发光杆菌属(Photobacterium)、Tenacibaculum、黄杆菌属(Flavobacterium)、屈挠杆菌属(Flexibacter)、噬胞菌属(Cytophaga)、Francisella、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)或爱德华氏菌属(Edwardsiella)。
在Nocardia种中，Nocardia seriolae在温水鱼类中引起慢性问题。由诺卡氏菌(Nocardial)感染给渔场业带来的损失历年来都在增长。尤其是，黄尾鱼(Seriolae quinqueradiata)、琥珀鱼(Seriolaedumerelli)、海鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、黄鱼(Lamitichthyscrocea)、鲳鱼(Pampus argenteus)、四指马鲅(Eleutheronematetradactylum)、鲷鱼(Lutjanus sp)、石斑鱼(Epinephelus sp)和六带鲹(Caranx sexfasciatus)已经被Nocardia感染。
该疾病——常称作“marine nocardiosis”，开始于无症状感染。其在“fry fish”和幼鱼中发展.该细菌在比如脾、肝和肾这样的主要器官中繁殖。
由于繁殖速率低，该细菌在任何可视症状出现之前可在鱼组织中长时间繁殖。因此该疾病被称作慢性的。当暴发显现时只要其结果是鱼的重量在300至1000g之间，经济损失就是显著的。
研究显示，与患病幼鱼(在先注射过活Nocardia)共享鱼池空间的黄尾鱼(yellow tail)在同居三个月后最终出现体内病状(脾上的白点)。在海洋长须鲸的养殖中，诺卡氏菌(Nocardial)感染在水温达到24℃或更高的夏季月份似乎发展得更快，但是由Nocardia导致的死亡率更常见于秋季和初冬月份，因为该鱼不得不适应新的环境状况但其免疫系统却退化了。
Nocardia本身似乎是非常弱的免疫系统诱导物，因为尽管该疾病进展非常缓慢，但是免疫系统却并不设法清除该感染。这也解释了这样一个事实：不存在对抗Nocardia的有效疫苗。包含一定限定的活减毒或失活细菌的疫苗能模拟天然感染，但是如果甚至天然感染都不能成功诱导足够的免疫反应，那么人们就无法期望疫苗能够做得更好。
显然，极为需要有效的疫苗。
本发明的一个目的是提供更好的对抗Nocardia感染的疫苗。
现在惊人地发现，包含加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)(也已知为Photobacteriumdamselae subspecies piscicidae)和鳗弧菌(目前还已知为Listonella anguillarum)种的不含Nocardia的组合疫苗，不仅按照预期的提供对抗加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、Pasteurellapiscicida和鳗弧菌(vibrio anguillarum)感染的保护，还完全意外地提供显著水平的对抗Nocardia seriolae的保护。最令人惊奇的是，这一对抗Nocardia seriolae感染的保护水平显著高于通过单价Nocardia seriolae疫苗获得的保护水平。
因此，本发明第一种实施方案涉及用于对抗鱼类Nocardia感染的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于所述疫苗含有Lactococcusgarviae、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrioanguillarum种的细菌以及药学上可接受的载体。
这一预料不到的发现背后的工作机理目前尚不清楚。然而，推测存在于或者吸附于所使用的细菌表面的某种成分，是对抗鱼类Nocardia的交叉特异性免疫的强刺激物。交叉特异性在此意指并非由Nocardia引起但仍然提供对抗Nocardia的保护。
对于制备这样的疫苗，细菌的状态，活的或者是失活的，确实并不重要。重要的是这样一个事实：在鱼类中仍然出现对抗Nocardia的交叉特异性免疫。
这可以通过使用全细菌制剂来保证。如上所述，制剂中的细菌是活的、灭活的或者甚至片断化(例如，通过将其挤压通过弗氏压碎器)，这一点是不重要的。
本领域技术人员将理解，用于灭活的方法与细菌活性并不非常相关。经典的灭活方法，例如UV射线、gamma射线、用福尔马林、二乙烯亚胺、热处理等等，所有本领域熟知的方法均可采用。通过物理胁迫方法来灭活细菌，采用例如弗氏压碎器，提供用于同样适宜的制备本发明疫苗的起始材料。因此灭活细菌不必须是灭活的完整细胞形式，这些细胞可以被破坏。
灭活细菌相比活减毒病毒具有非常安全的优点。
因此，在该实施方案的一种优选形式中，本发明涉及其中细菌种为灭活的本发明组合疫苗。
活减毒细菌也是非常适宜的，因为它们显然携带有刺激对抗Nocardia的交叉特异性免疫的因子。并且活减毒细菌相比灭活细菌，尤其是不带佐剂时，还具有以下益处：它们比灭活细菌更为有效。此外，它们进行一定程度的复制直到它们被免疫系统阻止，其结果是可以给予更低数量的细胞。活减毒细菌是比相应的野生型细菌具有更低的致病性但仍然能够诱导有效的免疫应答的细菌。
减毒菌株可通过本领域久已知晓的传统方法获得，例如继代培养、temperature-adaptation、化学诱变、UV射线等，或者定点诱变。
因此，在另一种优选形式中，本发明涉及其中至少一种细菌种为活减毒形式的本发明组合疫苗。
本发明的疫苗可根据本领域技术人员熟知的技术从细菌培养物开始制备。
与鱼疫苗及其制备有关的综述性文章有：Sommerset，L，Krossoy，B.，Biering，E.和Frost，P.发表于Expert Review of Vaccines 4：89-101(2005)，Buchmann，K.，Lindenstrom，T.和Bresciani，发表于J.Acta Parasitologica 46：71-81(2001)，Vinitnantharat，S.，Gravningen，K.和Greger，E.发表于Advances in veterinarymedicine 41：539-550(1999)以及Anderson，D.P.发表于Developments in Biological Standardization 90：257-265(1997)。
本发明的疫苗主要包括有效量的本发明细菌和药学可接受载体。
本文所使用的术语“有效的”被定义为足以在靶鱼中诱导免疫应答的量，从而使得与在相同条件下未经免疫的鱼相比，以及和用野生型Nocardia感染所导致的靶鱼发病水平低50％。
所施用的细胞量依赖于各物种的细菌量、细菌状况、减毒活或者灭活、有无佐剂以及施用方式。
如果从商购疫苗开始，制造商将会提供这一信息。
否则，本领域技术人员可以从上述参考文献以及以下给出的信息尤其是实施例中找到足够的教导。
如上所述，本发明的疫苗可根据本领域技术人员熟知的技术从细菌培养物开始制备。在实施例部分，给出了制备本发明疫苗的实施例。
通常来讲，根据本发明制备的基于灭活细菌的疫苗通常可以给予103至1010，优选106至109，更优选108和109之间个细菌的剂量。超过1010量的细菌，尽管在免疫学上是适宜的，但是由于经济原因却并不那么吸引人。根据本发明方法制备的基于活减毒细菌的疫苗可以给予较低的剂量，因为存在这样一个事实：细菌在施用后将继续复制一定的时间。根据本发明方法制备的基于活减毒细菌的疫苗通常可给予102至108，优选103至105个细菌的剂量。
特别适于本发明疫苗的药学可接受载体的例子有：无菌水、生理盐水、比如PBS这样的水性缓冲液等等。此外，如下所述，本发明的疫苗还可包含比如佐剂、稳定剂、抗氧化剂这样的其他添加剂，以及其他。
如本发明所述制备的疫苗可在优选的呈现形式中包含免疫刺激物质，那所谓的佐剂。佐剂通常包括以非特异性方式增强宿主免疫应答的物质。许多佐剂是本领域已知的。渔场和贝类农场常用的佐剂的例子有胞壁酰二肽、脂多糖、数种葡聚糖和多糖以及Carbopol(R)。Jan Raa在文献综述中给出了适用于鱼类和贝类鱼疫苗的佐剂的广泛综述(Reviews in Fisheries Science 4(3)：229-288(1996))。
该疫苗还包括所谓的“载体”。载体是细菌所依附但不与之共价结合的化合物。这样的载体有生物微囊、藻酸盐微球、脂质体和大分子物，均为本领域已知。
这样的载体的一种特别形式，其中抗原被部分种植于该载体中，是所谓的ISCOM(欧洲专利EP 109.942，EP 180.564，EP 242.380)。
此外，该疫苗可包括一或多种适宜的表面激活化合物或乳化剂，例如Span或Tween。
这样，在该实施方案的一种优选形式中，本发明的组合疫苗含有佐剂。
对于本发明的组合疫苗，油佐剂通常表现得更为有效些。
适用于油包水乳化物的油佐剂有矿物油或可代谢油。矿物油有例如
Figure BPA00001161061400051
和
Figure BPA00001161061400052
可代谢油有例如，比如花生油和大豆油这样的植物油，比如鱼油角鲨烯和角鲨烷这样的动物油，以及生育酚及其衍生物。
适宜的佐剂有例如w/o乳剂，o/w乳剂和w/o/w复乳剂。
非常适宜的o/w乳剂是例如，获自始于5-50％w/w水相和95-50％w/w油佐剂，更优选20-50％w/w水相和80-50％w/w油佐剂的乳剂。
因此，在该实施方案的一种甚至更优选的形式中，本发明的组合疫苗含有佐剂，其中的佐剂是油佐剂。
如上所述，油佐剂可大略分为含矿物油的佐剂和不含矿物油的佐剂。从食品安全的角度以及由于其某些时候带来的损害两方面来看，矿物油都更缺乏吸引力。因此，一种优选的油佐剂含有非矿物油。
一种优选的非矿物油是可以从SEPPIC，法国，商业获得的ISA 763AVG油。
所添加的佐剂量依赖于佐剂自身的性质，关于该量的信息由制造商提供。
疫苗中常混合有稳定剂，例如，为保护有降解倾向的蛋白质免于被降解，为增强疫苗的保质期，或者为提供冻干效率。有用的稳定剂有SPGA(Bovarnik等人，J.Bacteriology 59：509(1950))，碳水化合物——例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷或葡萄糖，比如白蛋白或酪蛋白或其降解产物这样的蛋白质，和比如碱性金属磷酸盐这样的缓冲液。
优选地，所述疫苗以冻干形式呈现。
此外，该疫苗还可悬浮于生理可接受的稀释剂中。
不言而喻，其他佐剂化、添加载体化合物或稀释剂、乳化或稳定蛋白质的方法都包含在本发明中。
可以采用许多施用方式，所有都是本领域已知的。所述疫苗优选通过例如腹膜注射这样的注射、浸泡、喷雾、浸渍或经口施用于鱼类。然而应当牢记，施用途径还可能依赖于疫苗的类型：如果该疫苗含活的减毒Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrioanguillarum菌，它可以容易地通过浸渍施用。另一方面如果该疫苗含有灭活细菌形式的Lactococcus garviae、Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum菌，或者更常说的如果该疫苗可通过混入佐剂来改进，优选的施用方式则是腹膜注射途径。从免疫学的角度，腹膜内接种是鱼类免疫的有效方式，当然是对于灭活细菌，尤其是因为它允许掺入佐剂。
制备本发明疫苗的一种便利方式是，利用可商购的疫苗。Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida疫苗和Vibrioanguillarum疫苗是可商业获得的，和/或文献中已描述了生产它们的方法。
施用方案可以根据标准接种实践最优化。
被接种的鱼龄并不重要，尽管显然人们想要在早期接种以对抗Nocardia感染。对于许多鱼疫苗来说是在鱼重介于10和35克之间时施用。这对于对抗Nocardia也是一个非常适宜的接种时刻。
对于经口施用，疫苗优选与适宜的用于经口施用的载体混合，例如纤维素、食物或可代谢物质，比如α-纤维素或各种植物或动物来源的油类。通过生物封装来施用疫苗也是一种吸引人的方法，其中将活饲料暴露于高浓度的疫苗，然后向鱼类饲喂活饲料生物。尤其优选用于经口运送本发明疫苗的食物载体是能够封装疫苗的活饲料生物。适宜的活饲料生物包括浮游生物样非选择性过滤进食者，优选为轮虫(Rotifera)、卤虫(Artemia)等中的成员。高度优选的是卤虫Artemiasp.。
基于大量对鱼类致病的病毒和生物，对于疫苗生产有益的是还与Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrioanguillarum菌共同施用一或多种其他非Nocardia鱼类致病细菌或病毒、这些细菌或病毒的抗原或编码这样的抗原的遗传材料。
众人皆知的在商业上很重要的鱼类病原例子是近来发现的导致大肚症状的细菌，如同泰国专利申请TH 92840所述，(该新细菌的一个例子(BB E3F1)已保藏于法国微生物保藏中心(CNCM)，InstitutPasteur，25 Rue du Docteur Roux，F-75724 Paris Cedex 15，法国，保藏号为CNCM 1-3257)，Tenacibaculum maritimum、Flavobacterium columnare、Flexibacter maritimus(旧名为Tenacibaculum maritimum)、Streptococcus iniae、Streptococcusdifficile、Streptococcus agalactiae、Streptococcusdysgalactiae、Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacterium maritimum、Francisella sp，以及比如Nodavirus、Irido病毒、Koi herpes病毒、Channel Catfish病毒这样的病毒。
这样的组合疫苗的优点是它不仅提供对抗加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum感染以及Nocardia感染的保护，还提供对抗其他疾病的保护。
因此，在一种优选实施方案中，本发明的不含Nocardia的组合疫苗含有，除Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrioanguillarum种的细菌外，至少还含有一种其它对鱼类致病的微生物或病毒，或这样的微生物或病毒的一种其他抗原或编码所述其他抗原的遗传材料。
在一种更优选的实施方案种中，至少一种对鱼类致病的其他微生物，或一种这样的微生物的其他抗原或者编码所述其它抗原的遗传材料选自：导致引起大肚病的细菌、Flavobacterium columnare、Tenacibaculum maritimum、Streptococcus iniae、Streptococcusdifficile、Streptococcus  agalactiae、Streptococcusdysgalactiae、Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacterium maritimum、Francisella sp.、Nodavirus、Irido痛毒、Koi herpes病毒、Channel Catfish病毒。
本发明的另一种实施方案涉及生产对抗鱼类Nocardia感染的疫苗的方法。这样的方法包括将活减毒或灭活形式的Lactococcusgarviae，Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum细菌与药学可接受载体混合。
该实施方案的一种优选形式涉及还包括与佐剂混合的方法。
如果就Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrioanguillarum疫苗组分来说使用即用型疫苗，则可以在施用前将其混合。
如果它们是经口施用的，较好的选择是在施用前混合。如果疫苗是注射施用的，为同时施用可以将组分混合，也可以以连续注射的方式分别或者依次施用。
无论是使用可商业获得的加氏乳球菌(Lactococcus garviae)疫苗，Pasteurella piscicida(杀鱼巴斯德氏菌)疫苗和Vibrioanguillarum疫苗，或如本发明实施例制备的疫苗，本领域技术人员宁愿使用必需量的诱导对抗各自细菌的免疫应答的各细菌。仅作为举例：本发明不含Nocardia的疫苗中的Lactococcus garviae量优选为足以诱导对抗Lactococcus garviae感染的免疫应答。
组合疫苗中的Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum种的细菌可同时、分别或依次施用。按照下文的解释，如果在短时间间隔内施用的话，它们仍然可以被视为组合疫苗。
同时施用是指在时间上于同一时刻施用Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum菌，优选作为混合物注射。因为便于操作，这当然是一种优选的方法。分别施用是指在两个或者更多个不同的注射位点施用加氏乳球菌、杀鱼巴斯德氏菌和Vibrio anguillarum菌(部分或者全部)，优选在时间上于同一时刻。
依次施用是指在时间上于不同时刻施用Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum菌。显然，如果分别或者依次施用，优选在同一天施用，更优选按照优选顺序在12、10、8、6、4、2或1小时内施用。甚至更优选的是在彼此之后的50、40、30、20、10或5分钟内施用。如果要在十分钟，甚至更好的是5或少于5分钟，内完成全部组合疫苗的施用，在一个时刻处理各鱼将能够实现，并允许几乎同时开始对免疫系统的开启。
本发明的另一实施方案涉及Lactococcus garviae，Pasteurellapiscicida和Vibrio anguillarum中至少一种细菌用于生产对抗鱼类Nocardia感染的不含Nocardia的组合疫苗的用途。
在该实施方案的一种优选形式中，将要对抗其中的Nocardiaseriolae感染以及为此生产疫苗的鱼类属于黄尾鱼(Seriolaequinqueradiata)、琥珀鱼(Seriolae dumerelli)、海鲈鱼(Lateolabrax japonicus)、黄鱼(Lamitichthys crocea)、鲳鱼(Pampus argenteus)、四指马鲅(Eleutheronema tetradactylum)、鲷鱼(Lutjanus sp)、石斑鱼(Epinephelus sp)和六带鲹(Caranxsexfasciatus)。
在该实施方案的另一种优选形式中，用于制备的至少一种细菌物种为活减毒形式。
在该实施方案的另一种优选形式中，用于制备的细菌物种是灭活的。
在该实施方案的一种更优选形式中，为制备所述疫苗还使用至少一种其他对鱼类致病的微生物或病毒、或一种其他这样的微生物或病毒的抗原或编码所述抗原的遗传材料。
在该实施方案的一种甚至更优选形式中，所述其他微生物或病毒选自：引起大肚病(Big Belly syndrome)的细菌、Flavobacteriumcolumnare、Streptococcus iniae、Streptococcus difficile、Streptococcus agalactiae、Streptococcus dysgalactiae、Edwardsiella tarda、Edwardsiella ictaluri、Mycobacteriummaritimum、Francisella sp.、Nodavirus、Irido病毒、Koiherpes病毒、Channel Catfish病毒。
最后，另一实施方案涉及相应试剂盒，其中该试剂盒包含至少两种疫苗瓶，且这至少两种瓶子共同含有用于对抗鱼类Nocardiaseriolae感染的Lactococcus garviae，Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum种的细菌及药学可接受载体。仅仅作为例子：如果该试剂盒共同含有包含Lactococcus garviae，Pasteurellapiscicida和Vibrio anguillarum种的细菌，这意味着这三种类型的细菌各自存在于至少其中一个瓶子中。结果是这三种类型的细菌都存在于试剂盒中。在该例子中，一个瓶子可含有Lactococcus garviae，而另一个瓶子含有Pasteurella piscicida和Vibrio anguillarum。作为选择，一个瓶子可以含有Lactococcus garviae，Pasteurellapiscicida，而另一个瓶子可含有Vibrio anguillarum。如果该试剂盒含有例如三个瓶子，则各类型的细菌可以存在于单一的瓶里。
实施例
实施例1
动物管理：
测试系统
动物
物种：黄尾鱼(Seriola quinqueradiata)
来源：野生捕获的幼鱼
试验开始时的平均体重：约20g(18-27g)
由于这些鱼是野生捕获的幼鱼，因此它们都没有接受过任何在先的接种免疫。在一达到时即将鱼置于隔离鱼池中直到它们长到试验所需的正确大小。
采纳和排除标准
仅使用健康的鱼。免疫接种后，未对患病动物作出治疗或者排除动物。
水
盐度：天然海水25-35ppt
温度：接种后24℃+/-2℃，免疫试验后26℃+/-2℃
喂养
在预备试验阶段，每日随意饲喂数次。一旦足够数量的鱼达到约20g的目标体重并显示出无感染，即将它们转入试验鱼池。在试验阶段(免疫接种后)，每天饲喂其体重的2-3％(BW)(每周调整)。尽可能地使免疫接种和假接种鱼类的每kg体重饲喂量保持相似。以每周间隔，在各组按照10-15条每组称量体重以确定平均体重以重新计算饲喂量。在免疫接种前使鱼饥饿24小时以确保胃肠道为空且由此预防注射对内脏的损伤。免疫试验后给鱼饲喂1-3％BW。
鱼池
试验开始时将鱼分为接种组和假接种组，然后转入500L鱼池中。利用垂直竖立于鱼池中间将鱼池一分为二的网将鱼组区分开。各半鱼池用鱼池编号和字母(A或B)来识别。免疫试验后，将鱼居住于50L鱼池中。
分组和给药
免疫接种
在鱼体测大约胸鳍末端的位置进行IP注射。使用小的一次性皮下注射针头和一次性针管。对照鱼用SVDB(标准疫苗稀释缓冲液＝PBS)假接种。
免疫试验
免疫试验材料的准备
从零下50℃冰箱中取出野生型Nocardia seriolae免疫菌种并令其解冻。将瓶中内容物以1％(v/v)的比率接种到Eugon Broth液体培养基中，在椭圆振荡器上以150RPM的震荡速率于26℃培养约67-71h。相应于每毫升大约108CFU可视细胞数量的培养物OD660nm通常为1.5-1.6。
利用这一呈现延迟对数生长期的悬浮物来制备免疫试验悬浮物。在盐溶液中适当稀释后用于注射。
免疫试验
IP注射完成免疫试验。从试验组，给鱼类注射0.1ml标准化的细菌悬浮液。在AQUI-S中对各组进行麻醉直到它们镇静，在其体左侧紧靠在胸鳍尖后面进行腹膜内注射。注射后立即将鱼转入它们的分配鱼池中，然后回收。在免疫试验前令鱼饥饿24小时以确保其胃肠道全空。
结果评价
通过在对照组的死亡率达到60％或更高的那天计算各组相对于对照组的相对存活百分数(RPS)数值来评估对各疫苗剂型做的免疫试验结果。
此外，用2×2列联表和Fisher′s确切概率(One tailed，Stat SoftInc(2004)，Statistica，data analysis Software system，version6)对最终确定的试验组和各对照组间的确定累计死亡率作了统计分析。
根据以下公式计算RPS值：
Figure BPA00001161061400131
实施例中的抗原浓度常以ODU/ml给出。ODU/ml是根据以下计算的：抗原浓度(ODU/ml)＝(((OD660).1+(OD660).2)/2)-0.2118)/0.0018*DF*106，其中(OD660).1+(OD660).2是两次OD660测定的OD660值，以及其中DF是稀释倍数。
此处所述的所有单价疫苗都来自甲醛灭活的N.seriolae抗原并配制成油佐剂化疫苗。疫苗V1和V2以0.05的注射体积进行注射。将疫苗与等体积疫苗稀释液混合后，以0.1ml注射疫苗V3、V4和V5。
测试项目
疫苗1：类型：单价N.seriolae/油佐剂化
配方：1.0×107ODU/ml(5.0×105ODU/鱼)
疫苗2：类型：单价N.seriolae/油佐剂化
配方：1.0×106ODU/ml(5.0×104ODU/鱼)
疫苗3：类型：单价N.seriolae/油佐剂化
配方：1.0×107ODU/ml(5.0×105ODU/鱼)
疫苗4：类型：单价N.seriolae/油佐剂化
配方：1.0×106ODU/ml(5.0×104ODU/鱼)
疫苗5：类型：单价N.seriolae/油佐剂化
配方：1.0×105ODU/ml(5.0×103ODU/鱼)
疫苗稀释液
类型：油中的标准疫苗稀释缓冲液
SVDB
类型：标准疫苗稀释缓冲液(SVDB)
所测试的疫苗配方列于表1。疫苗是配制成微组分的油包水疫苗，并在使用前与ISA 763A VG油性疫苗稀释液混合。
表1处理组，免疫进行第三周和第六周的鱼数量
  组   Nocardia浓度(ODU/鱼)  #免疫第三周的鱼   #免疫第六周的鱼
  V1   5.0×105   10   5
  V2   5.0×104   10   5
  对照   SVDB   10   5
  V3   5.0×105   15
  V4   5.0×104   15
  V5   5.0×103   15
  对照   SVDB   15
RPS值
表2.最小抗原试验中不同疫苗条件下第三周和第六周免疫的RPS60值
组   RPS≥60第三周   RPS≥60第六周
V1   33   ＜0
V2   33   33
对照死亡率   6.0％   60％
V3   40
V4   30
V5   20
对照死亡率 6.7％
正如从表2得出的，免疫接种的鱼的存活并不显著区别于对照(单尾Fisher exact，p＜0.05)。接种组和对照组的存活率和死亡率的相对百分数在统计学上都不显著。
实施例2
动物管理
测试系统
动物                    同实施例1
采纳和排除标准          同实施例1
水                      同实施例1
喂养                    同实施例1
鱼池                    同实施例1
分组和给药
免疫接种                同实施例1
免疫试验
免疫试验材料的准备      同实施例1
免疫试验                同实施例1
结果评估
                        同实施例1
测试项目
疫苗
疫苗：
类型：三价V.anguillarum/L.garvieae 6.8×108细胞/ml，P.piscicida 1.36×109细胞/ml
注射：0.1ml
所测试的疫苗制剂列于表3。疫苗是配制成微组分的油包水疫苗，并在使用前与ISA 763A VG油-疫苗稀释液混合。这些疫苗所使用的抗原来源于正常生产菌株P.piscicida、L.garvieae和V anguillarum。
表3实验组，所使用的疫苗，免疫接种和免疫试验后分配的半鱼池
  组   组成   N.seriolae浓  #用于免疫试验的鱼
  度(ODU/ml)   第三周
  疫苗   P.piscicida，L.garviae，V.anguillarum   无   15
  对照   -   无   15
RPS值
N.seriolae免疫试验后的RPS(n＝15)。星号*表示免疫物和对照之间的统计学差异(单尾Fisher exact，p＜0.05))。根据计算RPS得到的对照死亡率是73％。
表4免疫试验后的RPS60值
  组   RPS   统计分析
  疫苗   73％   P＝0.0046*
  对照死亡率   72％
从该试验，表4，可以得出，免疫试验组的相对存活百分数是73％，而同时对照组超过60％的鱼死亡(对照组中的实际死亡率是72％)。因此，可以得出结论，含有P.piscicida、L.garvieae和Vanguillarum的疫苗能够保护鱼类对抗Nocardia感染。

Claims (1)

1.1)对抗鱼类中Nocardia感染的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于所述疫苗含有加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum种的细菌和药学可接受载体。
2)根据权利要求的1不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于至少一种细菌种为活减毒形式。
3)根据权利要求的1不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于细菌种为灭活的。
4)根据权利要求的1-3不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于其含有佐剂。
5)根据权利要求4的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于佐剂为油佐剂。
6)根据权利要求4或5的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于佐剂为非矿物油佐剂.
7)根据权利要求4-6的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于佐剂为ISA 763A VG。
8)根据权利要求1-7的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于所述疫苗含有至少一种对鱼类致病的其他微生物或病毒，或这样的微生物或病毒的一种其他抗原或编码所述其他抗原的遗传材料。
9)根据权利要求8的不含Nocardia的组合疫苗，其特征在于所述至少一种其他微生物或病毒选自：引起大肚病的细菌、Tenacibaculum maritimum，Flavobacterium columnare，Streptococcus iniae，Streptococcus difficile，Streptococcusagalactiae，Streptococcus dysgalactiae，Edwardsiella tarda，Edwardsiella ictaluri，Mycobacterium maritimum，Francisellasp.，Nodavirus，Irido病毒，Koi herpes病毒或Channel Catfish病毒。
10)制备根据权利要求1-9不含Nocardia的组合疫苗的方法，其特征在于所述方法包括将加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum物种的细菌与药学可接受载体混合。
11)至少加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurella piscicida)和Vibrio anguillarum用于生产对抗鱼类中Nocardia seriolae感染的不含Nocardia的组合疫苗的用途。
12)根据权利要求11的用途，其特征在于鱼类属于黄尾鱼(Seriolae quinqueradiata)、琥珀鱼(Seriolae dumerelli)，海鲈鱼(Lateolabrax japonicus)或黄鱼(Lamitichthys crocea)种。
13)根据权利要求11或12的用途，其特征在于至少一种所述细菌种为活减毒形式。
14)根据权利要求11或12的用途，其特征在于所述细菌种为灭活的。
15)根据权利要求11-14的用途，其特征在于为制备所述疫苗，还使用至少一种其他对鱼类致病的微生物或病毒，或这样的微生物或病毒的一种其他抗原或编码所述其他抗原的遗传材料。
16)根据权利要求15的用途，其特征在于所述其他的微生物或病毒选自：引起大肚病的细菌、Tenacibaculum maritimum，Flavobacterium columnare，Streptococcus iniae，Streptococcusdifficile，Streptococcus agalactiae，Streptococcusdysgalactiae，Edwardsiella tarda，Edwardsiella ictaluri，Mycobacterium maritimum，Francisella sp.，Nodavirus，Irido病毒，Koi herpes病毒或Channel Catfish病毒。
17)组件的试剂盒，其特征在于该试剂盒含有至少两个疫苗瓶，所述瓶子共同含有用于对抗鱼类中Nocardia seriolae感染的加氏乳球菌(Lactococcus garviae)、杀鱼巴斯德氏菌(Pasteurellapiscicida)和Vibrio anguillarum种的细菌以及药学可接受载体。
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C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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