TW200936759A - Fish vaccine - Google Patents

Description

200936759 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明關於用於對抗魚細菌感染之不含土壤絲菌（ Nocardia)的組合疫苗、細菌於製造該疫苗之用途 '用於 製備該疫苗之方法及部件套組（kit-of-parts)。 【先前技術】 φ 過去數十年，全世界可見到魚的消耗量大爲增加。就 冷水性魚（諸如鮭魚、大菱鲆、大比目魚及鳕魚）及熱帶 魚（諸如亞洲海鱸、吳郭魚、蝨目魚、獅魚、琥珀魚、石 斑魚、紅魚及軍曹魚）的消耗量來看二者相等。 因此，已見到魚養殖場之數量及大小增加以符合市場 增加之需求。 自例如動物飼養可知，在大規模商業養殖之前，大量 動物緊靠居住極易受所有種類之疾病侵襲，即使是少爲人 φ 知或不常見’或甚至是不爲人知之疾病。此情況在魚養殖 中亦同。被發現對魚具致病性之細菌係屬於，如：土壤絲 菌屬、弧菌屬、巴斯德氏菌屬、發光菌屬 (P/zoioftacieriww)、屈撓桿菌屬、黃 桿菌屬（)、屈携桿菌屬（) 、嗜纖維菌屬（)、法蘭西斯菌屬（ Francisella )、分枝桿菌（)、鏈球菌（ SirepiococcMi)、乳球菌屬（Zaciococcws)或愛德華氏菌 屬(Edwardsiella) 〇 200936759 在土壤絲菌屬中，獅土壤絲菌（) 引起溫水魚之慢性問題。該由土壤絲菌感染造成之魚養殖 -工業的傷害逐年增加。尤其是獅魚（青甘鰺（Serio/ae quinqueradiata ))、號珀魚（紅甘鰺（Serfo/ae dumer elli )) '海爐魚（日本真爐（Lateolabrax japonicus))、黃花魚、（大黃魚（Lamitichthys crocea) )、鯧（銀鯧（Pa/npws flrgeniew ))、馬鲅魚（四指馬 鲅（Eleutheronema tetradactylum ))、鯛（笛鯛屬（ •ίΜΟ'ύΤίίΜί1 ?/?))、石斑魚（石斑魚屬5/7) )、竹奨魚（六帶鰺（Caranx iex/aic/aiwi ))已被土壤 絲菌感染所影響》 該疾病（通常稱爲海洋土壤絲菌病）開始時爲隱性感 染。其在魚苗及幼魚中發展出。此細菌在主要器官（諸如 脾臟、肝臟及腎臟）內繁殖。 由於繁殖率低，該細菌可在魚組織中長期繁殖後才出 現任何目視可見之症狀。因此，該疾病稱爲慢性病。當疾 病爆發出來時，由於魚重通常係介於300至1000克，因 此經濟損失重大。 硏究指出與生病之幼魚（先前被注射活土壤絲菌）同 槽之獅魚在同處三個月後終究顯示出內部病理現象（其脾 臟中有白點）。在海水脊鰭鯨之培養中顯示出當夏季期間 水溫達到24°C或更高時土壤絲菌感染會更快速惡化，但在 秋天及初冬時更易因感染土壤絲菌而死亡，因爲魚必須適 應新環境而使其免疫系統變弱。 -6- 200936759 土壤絲菌本身似乎爲非常差之免疫系統誘發劑，因爲 儘管該疾病之進展非常慢，免疫系統並未完成清除感染》 此亦可解釋爲何現今並無有效之對抗土壤絲菌感染的疫苗 。疫苗包含減毒活菌或經某種程度去活化以模擬自然感染 之細菌，但即使天然感染無法誘發適當之免疫反應，吾人 仍無法期待疫苗能有更好之表現。 顯然地，吾人對於有效之疫苗存在著高度需求。 ❿ 【發明內容】 本發明之目的係提供用於對抗土壤絲菌感染的較佳疫 苗。 令人驚I牙地，現已發現包含格氏乳球菌（Zaciococcw garvz'ae)、殺魚巴斯德氏菌（尸wieMre/ZAf ( 亦稱爲美人魚發光桿菌殺魚亞種（PAoiohcieri’ww damselae subspecies pis cicidae ))及媛弧菌（Vibrio ❹ )菌種之不含土壤絲菌之組合疫苗不僅如同預 期般可提供對抗格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌感 染之保護作用，且完全出人預料地亦可提供明顯之對抗鯽 土壤絲菌感染的保護作用。最令人驚訝地，此對抗鯽土壤 絲菌感染的保護水準明顯高於藉由單價鲫土壤絲菌疫苗所 取得者。 因此，本發明之第一種較佳體系係關於用於對抗魚感 染土壤絲菌的不含土壤絲菌之組合疫苗，其中該疫苗包含 格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌種之細菌以及藥學 200936759 上可接受之載體。 此出人意料之發現背後的作用機制目前未知。然而， 據推m，有一種存在或黏附於所使用之細菌細胞表面上的 成分爲魚對抗土壤絲菌之交叉特異性免疫力的強力刺激劑 。本觀點之交叉特異性意指：非由土壤絲菌所誘發但提供 對抗土壤絲菌之保護作用。 爲了製造這類疫苗，細菌之狀態（存活或去活化）並 不真的重要。重要的是，魚對抗土壤絲菌之交叉特異性免 疫力的刺激劑仍然存在。 此可，如：利用全細菌製劑確認。如上述，製劑中之 細菌是否存活、死亡、甚至是呈片段狀（如：將其通過法 式細胞破碎器（French Press))並不重要。 熟習本技藝之人士將可察知用於去活化之方法與細菌 之活性並不是非常有關。用於去活化之傳統方法，諸如 UV放射照射、γ-放射照射、以福馬林、二乙烯亞胺、硫 柳汞，等處理（均爲本技藝所熟知）皆可應用。藉由物理 壓力（如：使用法式細胞破碎器）將細菌去活化可提供一 樣合適之用於製造本發明疫苗的起始物質。因此，經去活 化之細菌不必一定爲去活化之全細胞形式；該細胞可經過 碎裂。 經去活化之細菌優於減毒活菌之處在於其非常安全。 因此’於本較佳體系之較佳形式中，本發明關於根據 本發明之組合疫苗，其中該細菌種係經去活化。 減毒活菌亦非常合適，因其係被定義爲攜帶對抗土壤 -8- 200936759 絲菌之交叉特異性免疫力的刺激因子。減毒活菌優於經去 活化之細囷（尤其是在給予.時未加入佐劑者）之處在於其 較經去活化之細菌更有效。再者，其可複製到某一程度直 至被免疫系統終止，因此，可給予較少量之細胞。減毒活 菌較其野生型對應菌不具致病性，但卻可誘發有效之免疫 反應。 減毒菌種可循本技藝長久已知之傳統途徑取得，諸如 一系列通路、溫度適應、化學性致突變、UV放射照射， 等，或藉由定位突變。 因此，於另一較佳形式中，本發明關於根據本發明之 組合疫苗，其中該細菌種中至少有一爲減毒活菌之形式。 根據本發明之疫苗可根據熟習本技藝之人士所熟知的 技術從細菌培養開始製備。 與魚疫苗及其製造方法相關之評論文章有，如： S ommerset, I.，Kross0y, B., Biering, E. and Frost, P. in Expert Review of Vaccines 4:89-101(2005), Buchmann, K., Lindenstrom, T. and Br esciani, in J. Acta P ar as it o l o gi c a 46:71-81(2001), Vinitnantharat, S., Gravningen, K. and Greger, E. in Advances in veterinary medicine 41 :539-550 (1999)以及 Anderson, D.P. ζ·« 5/ o/ ogicii/

Standardization 90:257-265 (1997)° 根據本發明之疫苗基本上包含有效量之根據本發明之 細菌及藥學上可接受之載體。 此處所使用之“有效”一詞係定義爲足以在目標魚中 -9 - 200936759 誘發免疫反應之量，其造成之致病力較野生型土壤絲菌在 相同條件下對未經免疫接種之魚造成感染時所產生之致病 力低5 0 % ί 欲投服之細胞量係取決於，如：所使用之各細菌種的 細菌量、細菌之狀況（減毒存活或去活化）、是否存有佐 劑及投服途徑。 當從市售之疫苗開始時，製造者將提供此資訊。 或省，熟習本技藝之人士可在上述參考資料及下列資 料（尤其是實例）中得到充分指導。 如上述，根據本發明之疫苗可根據熟習本技藝之人士 所熟知的技術從細菌培養開始製備。實例部分中提供根據 本發明之疫苗的製備方法之實例。 一般而言，以經去活化之細菌爲基礎之根據本發明製 造的疫苗一般係以103-101β(宜爲1 06- 1 09，更宜爲108-1〇9)個細菌之劑量投服。雖然在免疫上適合，但超過 1〇1()細菌之劑量在經濟考量上將較無吸引力。由於該細菌 可在投服後仍持續複製一段時間，因此，以經減毒活菌爲 基礎之根據本發明製造的疫苗可以較低之劑量投服。以減 毒活菌爲基礎之根據本發明製造的疫苗一般可以102至 1〇8 (宜爲1〇3至105 )個細菌之劑量投服。 特別適合用於根據本發明之疫苗中的藥學上可接受之 載體的實例爲無菌水、生理食鹽水、水性緩衝劑（諸如 P B S )，等。此外，根據本發明之疫苗可包含其他添加劑 ，諸如下述之佐劑、安定劑、抗氧化劑，等。 -10- 200936759 在較佳之呈現形式中，依本發明之描述製造的疫苗可 含有免疫刺激物質（稱爲佐劑）。佐劑一般包含以非特異 性^方式加強宿主之免疫反應的物質。本技藝已知多種不同 之佐劑。常用於魚類及甲殼類養殖中之佐劑的實例包括胞 壁醯二肽、脂多醣、數種葡聚醣和聚醣以及卡波姆（ Carbopol® )。適合用於魚類及甲殼類疫苗之佐劑的大量 評論列於 Jan Raa( Reviews in Fisheries Science 4(3): 0 229-288(1 996))之評論文章中。疫苗亦可包含稱爲“載 劑”者。載劑爲細菌黏附，而非與其共價結合之化合物。 這類載劑爲，如：生物微膠囊、微形藻酸鹽、脂質體及大 分子物（其均爲本技藝所已知者）。 其中該抗原係部分包埋在載劑中之一種這類載劑的特 殊形式稱爲ISC0M (歐洲專利EP 109.942、EP 180.5 64、 EP 242.3 80 )。此外，該疫苗可包含一或多種合適之表面 活性化合物或乳化劑，如：Span或吐溫（Tween )。 φ 因此，在本較佳體系之更佳形式中，根據本發明之組 合疫苗包含佐劑。 在根據本發明之組合疫苗方面，油佐劑通常顯示出較 爲有效。 適合用於油包水乳劑中之油佐劑爲，如：礦物油或可 代謝之油。 礦物油爲，如：Bayol®、Marcol®及 Drakeol®。 可代謝之油爲，如：蔬菜油，諸如花生油和大豆油， 動物油，諸如魚油角鯊烷和角鯊烯，以及生育酚和其衍生 -11 - 200936759 物。 合適之佐劑爲，如：水/油乳劑、油/水乳劑及水/油/ 水雙重乳劑。一 特別合適之油/水乳劑爲，如：自5-50%重量/重量水 相及95 -50%重量/重量油佐劑開始來取得，更宜爲自20- 5 0%重量/重量水相及80-50%重量/重量油佐劑開始來取得 〇 因此，在本較佳體系之一種更佳形式中，根據本發明 _ 之組合疫苗包含佐劑，其中該佐劑爲油佐劑。 如上述，油佐劑可約略分爲包含礦物油之佐劑及包含 非礦物油之佐劑。從食品安全之觀點以及其有時造成損傷 的原因來看，礦物油可能較不具吸引力。因此，較佳之油 佐劑包含非礦物油。 更佳之非礦物油爲，如：可自法國 SEPPIC購得之 ISA 763A VG 油。 加入之佐劑量係取決於佐劑本身之性質，關於這類量 © 之資訊將由製造者提供。 通常，疫苗係與安定劑（如：防止有降解傾向之蛋白 質降解）混合以增加疫苗之保存期限，或改良凍乾效能。 可用之安定劑係，如：SPGA(Bovarnik et al; J. Bacteriology 59:509 (1 950)) ' 碳水化合物（如：山梨糖 醇、甘露醇、海藻糖、澱粉、蔗糖、右旋糖酐或葡萄糖） 、蛋白質（諸如白蛋白、或酪蛋白、或彼等之降解產物） 以及緩衝劑（諸如鹼金屬磷酸鹽）。 -12- 200936759 較佳地，所描述之疫苗係以凍乾形式呈現。 此外，可將疫苗懸浮在生理上可接受之稀釋劑中。自 不待言-，其他輔助（加入載劑化合物或稀釋劑）、乳化或 穩定蛋白質之方式亦包含在本發明中。 可應用之投服方式有多種，其均爲本技藝所已知。所 描述之疫苗宜經由注射（諸如腹膜內注射）、浸沒、噴灑 、浸泡或經口投服給魚。然而，需僅記在心，投服途徑亦 φ 可取決於疫苗之類型：若該疫苗包含減毒活格氏乳球菌、 殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌時，其可很容易地經由浸泡投服 。另一方面，若該疫苗包含去活化細菌形式之格氏乳球菌 、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌，或更槪咯的說，若該疫苗可 經由與佐劑混合來改良，則較佳之投服方式將爲經由腹膜 內途徑投服。從免疫學觀點來看，經由腹膜內途徑接種疫 苗爲魚疫苗接種之有效途徑，此當然適用於去活化之細菌 ，尤其是因爲其可合倂佐劑。 〇 製造根據本發明之疫苗的合宜方式爲使用市售之疫苗 。格氏乳球菌疫苗、殺魚巴斯德氏菌疫苗及鰻弧菌疫苗可 從市面上購得’及/或製造這些疫苗之方法已描述於文獻 中〇 投服之議定計劃可根據標準之疫苗接種操作將其最優 化。 魚接種疫苗之年齡並無嚴格規定，但顯然地，吾人會 希望早期接種疫苗以對抗土壤絲菌感染。多種魚疫苗係在 魚之重量介於10至35克時投服。此亦爲接種對抗土壤絲 -13- 200936759 菌之疫苗非常合適的時間。 在口服方面，該疫苗宜與適合口服之載體（即，纖維 素、食物或可代謝之-物質，諸如α-纖維素或不同之蔬菜 油咸動物油）混合。另一吸引人之方法係透過生物包囊投 服疫苗，藉此可將活飼料暴露於高濃度之疫苗中，再將該 活飼料有機體餵食給魚。用於經口投遞根據本發明之疫苗 的特佳食物載體爲可將疫苗包囊之活飼料有機體。合適之 活飼料有機體包括浮游生物樣非選擇性濾食動物，宜爲輪 蟲網、豐年蝦，等之成員。特佳者爲豐年蝦屬之鹽水蝦。 鑑於大量病毒及有機體對魚具致病力，宜將格氏乳球 菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌與一或多種其他非土壤絲菌 之魚致病性細菌或病毒、那些細菌或病毒之抗原或編碼這 類抗原之遺傳物質一起投用以用來製造疫苗。 市售之知名的有害重要魚病原菌之實例爲最近發現之 引起大肚症候群（Big Belly syndrome)之細菌，如泰國 專利申請案TH 92840中所描述者（此新穎細菌之種實例 (BB E3F1)已存放在 Collection Nationale de Cultures de Microorganisms (CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux，F-75724 Paris Cedex 15，France 中，編號 CNCM 1-3 257 )、海洋屈撓桿菌（ maritimum )、柱狀黃桿菌 l Flavobacterium columnar e ) 、海洋屈擦桿菌(Flexibacter maritimus ) ( T enac ib aculum maritimum 之舊名）、海膝鍵球菌（ Streptococcus ini a e )、艱難鏈球菌（ 200936759 difficile )、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae )、 壞乳鍵球菌、遲純愛德華 氏菌（五、給魚愛德華氏囷 （ 心 ζ·β//ύτ icia/wrz_)、海洋分枝桿菌（从少 c 0 办 α (^e 尸z w w maritimum )、法蘭西斯菌屬（a sp_)以及病毒 ，諸如野田村病毒（Nodavirus )、虹彩病毒（Irido virus )、錦鋰疱疹病毒（Koi herpes virus )、美洲河鯰（ Channel Catfish )病毒。 這類組合疫苗之益處是不僅可提供對抗格氏乳球菌、 殺魚巴斯德氏菌和鰻弧菌感染以及土壤絲菌感染的保護作 用，還可提供對抗其他疾病之保護作用。 因此，於一較佳體系中，根據本發明之不含土壤絲菌 的組合疫苗除了包含格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧 菌種外，還包含至少一種對魚具致病力之其他微生物或病 毒，或一種這類微生物或病毒之其他抗原或編碼該其他抗 原之遺傳物質。 於一更佳體系中，對魚具致病力之至少一種其他微生 物、或一種這類微生物之其他抗原、或編碼該其他抗原之 遺傳物質係選自引起大肚症候群之細菌、柱狀黃桿菌、海 洋屈撓桿菌、海豚鏈球菌、艱難鏈球菌、無乳鏈球菌、壞 乳鏈球菌、遲鈍愛德華氏菌、鯰魚愛德華氏菌、海洋分枝 桿菌、法蘭西斯菌屬、野田村病毒、虹彩病毒、錦鋰疱疹 病毒、美洲河給病毒。 本發明之另一較佳體系係關於用於製備對抗魚感染土 -15- 200936759 壤絲菌之疫苗的方法。這類方法包含將減毒活菌或去活化 形式之格氏乳球菌'殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌與藥學上可 接受之載體混合的步驟。- 本較佳體系之一種較佳形式係關於額外包含混合佐劑 之方法。 在格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌疫苗成分方 面，若係使用即時可用之疫苗’則其可在投服前混合。若 其係經口投服，則在投服前混合爲較佳之選擇。若係經由 注射投服疫苗，則在同時投服方面可將成分混合，亦可將 成分分開投服，或以一系列之連續注射依序投服。 不論係使用市售之格氏乳球菌疫苗、殺魚巴斯德氏菌 疫苗及鰻弧菌疫苗或依實例中所描述者製備之疫苗，熟習 本技藝之人士較偏好使用之各細菌的量爲誘發對抗各細菌 種之免疫反應所必須之量。僅用於舉例：在根據本發明之 不含土壤絲菌的疫苗中之格氏乳球菌的量宜爲足以誘發對 抗格氏乳球菌感染之免疫反應。 組合疫苗中之格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌 種之細菌可同時、分別或依序投服。若這些疫苗係在短期 間內給予，則其可被視爲一種如下說明之組合疫苗。 同時投服係在同一時點內投服格氏乳球菌、殺魚巴斯 德氏菌及鰻弧菌，宜以混合物之形式注射投服。由於容易 操作，此方法當然爲較佳之投服方法。 分別投服係將格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌 (部分或全部）分別在二或三個不同注射部位投服，宜在 -16- 200936759 同一時點內投服。 依序投服係將格氏乳球菌、殺魚巴斯.德氏菌及鰻弧菌 在不同時點內投服^很清楚地，若給予分別或依序注射’ 其宜在同一天內給予，較宜爲在12、10、8、6、4、2或 1小時內給予（依其優先順序）。更宜爲在50、40、30、 20、10或5分鐘內彼此接續投服。若組合疫苗之全部疫 苗係在1 〇分鐘內（更佳爲5分鐘或少於5分鐘）投服， 0 則單一時點對每一隻魚之處理即已足夠且幾乎可即時觸動 免疫反應。 本發明之另一較佳體系係關於使用至少一種格氏乳球 菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌來製造用於對抗魚感染鯽土 壤絲菌之不含土壤絲菌的組合疫苗。 於此較佳體系之一種較佳形式中，需克服體內感染之 鲫土壤絲菌且用於對抗其感染之鲫土壤絲菌的疫苗係依本 發明方法製造之魚係屬於鲫魚（青甘鰺）、琥珀魚（紅甘 0 鰺）、海鱸魚（日本真鑪）、黃花魚（大黃魚）、鯧（銀 鯧）、馬鲅魚（四指馬鲅）、鯛（笛鯛屬）、石斑魚（石 斑魚屬）或竹策魚（六帶驂）品種。 於此較佳體系之另一較佳形式中，該用於製造方法中 之細菌種至少有一爲減毒活菌型。 再於此較佳體系之另一較佳形式中，該用於製造方法 中之細菌種係經去活化。 於此較佳體系之更佳形式中係額外使用至少一種對魚 具致病力之其他微生物或病毒，或一種該微生物或病毒之 -17- 200936759 其他抗原或編碼該其他抗原之遺傳物質來製造該疫苗。 再於此較佳體系之更佳形式中，該其他微生物或病毒 係選自引起大肚症候群之細菌、-海洋屈撓桿菌、柱狀黃桿 菌、海豚鏈球菌、艱難鏈球菌、無乳鏈球菌、壞乳鏈球菌 、遲鈍愛德華氏菌、鯰魚愛德華氏菌、海洋分枝桿菌、法 蘭西斯菌屬、野田村病毒、虹彩病毒、錦鋰疱疹病毒或美 洲河鯰病毒。 最後，另一較佳體系係關於部件套組（kit-of -parts) ，其中該套組包含至少二個疫苗小瓶，且此至少二個小瓶 同時包含格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌種之細菌 以及藥學上可接受之載體以對抗魚感染獅土壤絲菌。僅用 於舉例：若該套組包含二個同時包含格氏乳球菌、殺魚巴 斯德氏菌及鰻弧菌種之細菌的小瓶，此意指此三種類型之 細菌各存在於至少其中一個小瓶中。因此，該三種類型之 細菌均存在於該套組中。在此實例中，一個小瓶可能包含 格氏乳球菌，而另一小瓶包含殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌。 或者，一個小瓶可能包含格氏乳球菌及殺魚巴斯德氏菌’ 而另一小瓶包含鰻弧菌。若該套組包含，如：三個小瓶’ 則各細菌類型可各存於一個小瓶中。 【實施方式】 實例1 動物飼養： 測試系統 -18- 200936759 動物 m 獅魚（青甘鰺） $ '源 . 捕獲之野生小魚 實驗開始時之平均重量 約20克（18-27克） 由於該魚爲捕獲之野生小魚，其先前未接受過任何疫 苗接種。當魚到臨時先將其置於隔離槽中，直到其達到用 於實驗之正確體重。

包含-排除標準 僅使用健康之動物。接種疫苗後，不再治療生病之動 物或排除動物。 水 •鹽度·· 天然海水25-3 5ppt •溫度： 接種後2 4 t： + / - 2 t，

挑戰後 26°C +/-2°C

飼料 在治療前之期間，每日隨意給予飼料數次。一旦足夠 數量之魚、達到約20克之所需重量且顯示出無任何感染時 將其轉移至實驗槽。實驗期間（接種疫苗後），以魚體重 (BW)之2-3% (每週調整）餵食魚其。在經接種疫苗及 模擬接種疫苗之魚中每公斤體重所餵食之飼料量儘可能保 持類似。隔週’分組爲每組丨04 5隻魚稱重以決定平均之 魚重’以重新計算飼料量。在接種疫苗前令魚飢餓24小 -19- 200936759 時，以確定胃腸道完全清空，藉此可預防因注射而傷害體 內器官。挑戰後，以1-3 %BW之量餵食魚。 槽 實驗開始時將魚依經接種疫苗或模擬接種疫苗分組’ 接著，將其轉移至500升之槽中。將網垂直置於槽的中間 將槽分成兩半，以將不同組之魚分開。以槽之編號及字母 (A或B)來鑑定槽之兩半。挑戰後，將魚飼養在50升 之槽中。 分組及給藥 疫苗接種 藉由IP注射在魚之一側，約爲胸鰭尾端來進行疫苗 接種。使用小號皮下、單次使用之針頭及單次使用之注射 筒。以SVDB爲對照組魚進行模擬疫苗接種（標準疫苗稀 釋緩衝劑=PBS)。 挑戰 挑戰材料之製備方法 從<-50 °C之冷凍庫取出野生型鯽土壤絲菌挑戰種子， 令其解凍。將小瓶之內容物以1 % (體積/體積）之比例接 種在 Eugon Broth中，在旋轉式震盪器上，在 26°C以 150RPM之搖動速度培養約67-71小時。培養之〇D 6 6 0 nn 通常爲1.5-1.6，其約相當於每毫升108CFU之存活細胞數 200936759 。使用此代表後對數期之懸浮液製備挑戰懸浮液。在生理 食鹽水中進行適當之稀釋並用於注射。 挑戰 藉由IP注射進行挑戰。爲來自實驗組之魚注射0.1 毫升之標準化細菌懸浮液。將各組在AQUI-S中麻醉直至 鎭靜，再經由腹膜內途徑注射在身體左側，胸鰭尖端後方 。注射後立即將魚轉移至其指派槽中，使其復原。在挑戰 前令魚飢餓24小時，以確定胃腸道完全清空。 評估結果 在對照組死亡率達到60%或更高之日，與對照組相比 較以計算各組之相對存活率（RPS)之數値，從而評估各 疫苗調製劑之挑戰結果。 此外，利用2x2列聯表（contigency table)及費雪精 確檢定（Fisher's exact test)(單尾，St at Soft 公司（ 2004 ) ，Statistica，數據分析軟體系統，第6版）對治療 組及對應之對照組間的最終確認之累計死亡率進行統計分 析。 根據下式計算RPS値： rps4i-(厕苗組中之%死亡率)} xl00

1 對照組中之％死亡率 J 實例中之抗原濃度通常係以0DU/毫升表示。依下述 測定0DU/毫升：抗原濃度（0DU/毫升）=(((OD66()).l + -21 - 200936759 (OD66〇).2)/2)-0.2118) /0.0018*DF*106，其中（〇d 6 6 0 ).1 + (OD66〇).2爲二次OD66〇測量之OD66〇値，其中DF爲稀釋 因子。 - 所有此處描述之單價疫苗係源自經福馬林去活化之鲫 土壤絲菌抗原且配製成加有油佐劑之疫苗。使用0.05毫 升之注射體積注射疫苗VI及V2。將等體積之疫苗與疫苗 稀釋劑混合後，以0.1毫升之注射體積注射疫苗V3、V4 及V5。 測試物 疫苗1: 類型：單價獅土壤絲菌/加有油佐劑 調製劑 l.〇xl〇7〇DU/毫升（5.0xl〇5 ODU/魚） 疫苗2 : 類型：單價獅土壤絲菌/加有油佐劑 調製劑 l.〇xl〇6〇DU/毫升（5.0x104 〇DU/魚） 疫苗3 : 類型：單價獅土壤絲菌/加有油佐劑 調製劑 ιοχ1070011/毫升（5·〇χ1〇5 ODU/魚） 疫苗4 : 類型：單價獅土壤絲菌/加有油佐劑 調製劑 l.〇xl〇6〇DU/毫升（5 0xl04 〇DU/魚） 疫苗5 : 類型：單價獅土壤絲菌/加有油佐劑 調製劑 mo50011/毫升（5.〇xl〇3 ODU /魚） 200936759 疫苗稀釋劑 類型： 在油中之標準疫苗稀釋緩衝劑

S VDB 類型： 標準疫苗稀釋緩衝劑（SVDB ) 測試之疫苗調製劑列於表1中。該疫苗爲配製成微量 成分形式之油包水疫苗且在使用前與ISA 763A VG油-疫 苗稀釋劑混合。 表1.在第3週及第6週進行之挑戰的治療組、魚的數目 組別 獅濃度 (ODU/魚） 第3週時用於 挑戰之魚數 第6週時用 挑戰之魚數 VI 5.0x1〇5 10 戰， - 5 V2 5 ·0χ 1 〇4 10 5 對照組 SVDB 10 5 V3 5.0xl〇5 15 V4 5·0χ104 15 V5 5 ·0χ1〇3 15 對照組 SVDB 15 -23- 200936759 RPS値 組別 RP S>6〇 第3週 RP S>6〇 第6週 VI 33 <0 V2 33 33 對照組死亡率 60% 60% V3 40 V4 30 V5 20 對照組死亡率 6 7% 表2.在最少抗原試驗中之不同疫苗條件中，第3週及第 ό週挑戰之RPS6〇値。_ ^ 從表2中可知，經接種疫苗之魚的存活率與對照組並 無顯著不同（單尾費雪精確試驗，p<0.05 )。經接種疫苗 組與對照組之相對存活百分比及死亡率在統計上並無差異 〇 實例2 © 動物飼養： 測試系統 動物 如實例1 包含-排除標準 如實例1 水 如實例1 -24- 200936759 飼料

如實例1 如實例1 分組及給藥 疫苗接種 如實例1 挑戰 挑戰材料之製備方法 如實例1 挑戰 如實例1 評估結果 如實例1 測試物 疫苗 疫苗： 類型：三價鰻弧菌/格氏乳球菌6 · 8 X 1 〇8細胞/毫升 殺魚巴斯德氏菌1.3 6x 1 09細胞/毫升 注射：0.1毫升 測試之疫苗調製劑列於表3中。該疫苗爲配製成微量 成分形式之油包水疫苗且在使用前與ISA 763Α VG油-疫 -25- 200936759 苗稀釋劑混合。這些疫苗所使用之抗原係源自殺魚巴斯德 氏菌、格氏乳球菌及鰻弧菌之天然產製菌株。 表3:實驗組、使用之疫苗、接種疫苗及挑戰後所分派之 半邊槽。 組別 組成 獅土壤絲菌之濃度 (ODU/毫升） 用於挑戰之魚數 第3週 疫苗 L-格氏乳球菌，殺 魚巴斯，德氏菌， 鰻弧菌 ft 15 對照組 - Μ j\\\ 15 RPS値 鯽土壤絲菌挑戰後之RP S ( 1 5 )。星號*代表疫苗 與對照組間之統計差異（單尾費雪精確試驗，P<〇. )。 計算RPS時所得之對照組死亡率類73%。 表4.挑戰後之RPS6〇値。 組別 RPS 統計分析 疫苗 73% p = 0.0046* 對照組死亡率 72% 從此實驗、表4中可知經接種疫苗組之相對存活率爲 7 3 %，然而，此時對照組中> 6 0 %之魚死亡（對照組中之確 實死亡率爲72%)。因此，可歸結出包含殺魚巴斯德氏菌 、格氏乳球菌及鰻弧菌之疫苗可保護魚對抗感染之獅土壤 絲菌。 -26-

Claims (1)

1. 200936759 十、申請專利範圍 1. —種用於對抗魚感染土壤絲菌（Wocarrfia)之不含 土壤絲菌的組合疫苗，其特徵在於該疫苗包含格氏乳球菌 (Lactococcus garviae)、殺魚巴斯德氏菌 /M'scicida)及鰻弧菌（種之細菌以及 藥學上可接受之載體。 2. 如申請專利範圍第1項之不含土壤絲菌的組合疫苗 0 ，其中該細菌種中至少一者爲減毒活菌型。 3 ·如申請專利範圍第1項之不含土壤絲菌的組合疫苗 ，其中該細菌種係經去活化。 4.如申請專利範圍第1項之不含土壤絲菌的組合疫苗 ，其中該疫苗包含佐劑。 5 .如申請專利範圍第4項之不含土壤絲菌的組合疫苗 ，其中該佐劑爲油佐劑。 6.如申請專利範圍第5項之不含土壤絲菌的組合疫苗 φ ，其中該佐劑爲非礦物油佐劑。 7 .如申請專利範圍第6項之不含土壤絲菌的組合疫苗 ，其中該佐劑爲ISA 763A VG。 8.如申請專利範圍第1-7項中任一項之不含土壤絲菌 的組合疫苗’其中該疫苗包含至少一種對魚具致病性之其 他微生物或病毒，或一種該微生物或病毒之其他抗原或編 碼該其他抗原之遺傳物質。 9 .如申請專利範圍第8項之不含土壤絲菌的組合疫苗 ，其中該至少一種其他微生物或病毒係選自引起大肚症候 -27- 200936759 群（Big Belly syndrome ) 之 細菌、 海洋 屈 撓 桿菌 ( Tenacibaculum maritimum ) 、 柱 狀 黃 桿 菌 ( Flavobacterium columnar e ) 、 海 豚 鏈 球 菌 ( Streptococcus ini a e )、艱難鏈球菌（（SVre/JiococcMj· 心//^£；//6)、無乳鏈球菌（iS^repiococww·? aga/flciiae)、 壞乳鏈球菌（Sire/^ococcws )、遲鈍愛德華 氏菌（五ί/ιναΑ·ί/Λ·ίβ//α )、総.魚愛德華氏菌 （ icia/«ri)、海洋分枝桿菌（从少coftacierfww maritimum )、法蘭西斯菌屬（_ΡΓαηί：ζ·5Ή/α sp.)、野田村 病毒（Nodavirus)、虹彩病毒（Irido virus)、錦鋰疱疼 病毒（Koi herpes virus)或美洲河総（Channel Catfish) 病毒。 10. —種用於製備如申請專利範圍第1-9項中任一項 之不含土壤絲菌的組合疫苗之方法，其特徵在於該方法包 含將格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌種之細菌與藥 學上可接受之載體混合的步驟。 11. 一種至少格氏乳球菌、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌 種之細菌於製造用於對抗魚感染獅土壤絲菌（iVocari/k ser/o/ae)的不含土壤絲菌之組合疫苗上之用途。 1 2 .如申請專利範圍第1 1項之用途，其中該魚屬於鯽 魚（青甘驂（Ser/o/ae gMingwerarfifliii))、號拍魚（紅 甘鰺（Serio/ae i/wwere//〇 )、海鱸魚（曰本真鱸（ Lateo labrax japonicus ))或黃花魚（大黃魚（ Lamitichthys croce a ))品種。 200936759 1 3 .如申請專利範圍第1 1項之用途 至少一者爲減毒活菌型。 14.如申請專利範圍第11項之用途 經去活化。 1 5 .如申請專利範圍第1 1 -1 4項中 中爲製造該疫苗，額外使用至少一種對 微生物或病毒，或一種該微生物或病毒 φ 該其他抗原之遺傳物質。 1 6 .如申請專利範圍第1 5項之用途 物或病毒係選自引起大肚症候群之細菌 柱狀黃桿菌、海豚鏈球菌、艱難鏈球菌 乳鏈球菌、遲鈍愛德華氏菌、鯰魚愛德 桿菌、法蘭西斯菌屬、野田村病毒、虹 病毒或美洲河総病毒。 17· —種部件套組（kit-of-parts) φ 組包含至少二個疫苗小瓶，該等小瓶同 、殺魚巴斯德氏菌及鰻弧菌種之細菌以 載體以用於對抗魚感染鯽土壤絲菌。 ’其中該細菌種中 ’其中該細菌種係 f壬一項之用途，其 魚具致病性之其他 之其他抗原或編碼 ’其中該其他微生 、海洋屈撓桿菌、 、無乳鏈球菌、壞 華氏菌、海洋分枝 彩病毒、錦鋰疱疹 ，其特徵在於該套 時包含格氏乳球菌 及藥學上可接受之 -29- 200936759 無 • · 明 說 單 無簡 ..號 為符 圖件 表元 代之 定圖 :指表 圖案代 表本本 代} } 定一二 ^ (( ❹ 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：無 ❹ -4-