KR20100105142A - 양식 어류용 백신 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 양식 어류용 백신 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트, 오일성분, 고급알코올 및 수성성분을 함유하는 나노리포좀 및 항원성 물질을 포함하는 양식 어류용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 양식 어류용 백신 조성물은 보다 강한 면역반응을 유도하고, 약효의 방출시간이 지속적이고, 어류에 적용시 안전성이 크게 증가되어 조성물의 유통기간을 늘여 제품의 단가 및 사용기간을 증가시키고 부영양화를 초래하지 않아, 백신의 제형으로서 효과가 매우 우수하다.
나노리포좀, 백신, 어류 양식, 세균성, 항원

Description

양식 어류용 백신 조성물{A Vaccine Composition For cultured fish}
본원 발명은 양식 어류용 백신 조성물에 관한 것이다.
어류는 변온동물로서 환경에 대한 적응력을 어느 정도 갖고 있지만 그 한계를 넘어버리면 생리적 장해를 일으키게 된다. 어류에 있어서 질병은 육상동물과 같이 내적·외적 환경에 대해 더 이상 건강상태를 유지할 수 없는 상태를 말한다. 질병은 숙주의 요인, 발병인자 및 환경과의 상관관계에 의한 결과로서 나타나는 현상으로 질병 발생요인 중 발병 인자만이 반드시 질병을 발생시키는 것은 아니며, 숙주와 환경의 상호작용에 의해 질병이 발생하거나 발생하지 않는다. 즉 발병인자와 숙주의 요인 그리고 환경과의 균형이 잘 이루어진 상태에서는 질병이 발생하지 않으며 이들 균형이 깨어질 경우 발생하는데 대부분의 경우 질병의 발생은 환경조건에 크게 영향을 받는다고 볼 수 있다.
어류의 체내에 병원체가 침입하는 경로는 피부, 아가미, 비강, 소화관 등으로 볼 수 있다. 이들 기관은 점액, 효소, 항균성 및 살균성 물질, 항체, 백혈구, 대식세포 등의 분비 및 작용에 의해 침입하는 세균 등으로부터 보호되고 있으나. 선별 시에 입는 기계적인 손상 또는 기생충에 의한 상처, 사육관리의 부실 등에 의해 이들 보호물질이 손상을 입게 되며 그곳을 통하여 병원체가 체내에 침입하게 되고 이어서 혈류를 타고 장기나 조직에 도달하여 병소를 형성하게 된다.
어류에 피해를 입히는 병원생물은 크게 나누면 원생동물(기생충), 진균류(곰팡이), 세균, 바이러스 등이 있다. 기생충은 수 십 ㎝에서부터 수 백㎛, 세균은 수 ㎛, 바이러스는 수 천분의 1 ㎛ 되는 정도로 대단히 작다. 따라서 이들이 어류에 피해를 주는 방법 및 대책법도 당연히 서로 다르게 되는 것이다.
우리나라 해산어 양식은 양식기술의 발달과 더불어 지속적인 생산성 향상을 가져왔지만 현재 양식 산업은 연안 양식 환경의 악화, 장기간의 집약적인 양식으로 인한 어장의 노화, 양식품종의 열성화 및 질병발생의 원인으로 양식생산성이 저하되고 있다. 특히, 양식어종의 다양화에 따라 어종에 빈발하는 각종 감염증 및 이들의 합병증은 화학요법제의 빈번한 사용에 의한 약제내성균의 출현과 아울러, 양식어의 품질 저하나 폐사어나 병어의 폐기에 의한 생산비용의 상승을 초래하고, 이러한 감염증에 대한 대책이 현재 양식업계의 가장 중요한 과제가 되고 있다. 게다가 질병 발생에 의한 피해가 차지하는 비중이 점점 높아지는 경향이 있어 질병발생을 사전에 예방하고 대책을 강구하여 질병치료의 근본적인 방법이 강구되고 있는 실정이다.
한편, 양식어의 세균성 질병은 병원성 세균으로부터 다른 원인에 의한 2차적인 감염으로 어류를 죽게하는 조건적 병원체에 의해 발생한다. 양식장의 사육수에 는 유기질이 많기 때문에 많은 세균이 번식할 수 있는 환경임으로 어류가 건강하지 못하거나 방어력이 약해졌을 때 질병을 일으킨다. 세균성 질병은 감염세균의 종류 및 증상에 따라 질병의 종류가 구분되며, 발생빈도가 높고 전염성이 강하며 일단 감염이 되면 누적폐사량이 많기 때문에 양식장에서는 경제적 손실이 대단히 크게 된다.
현재, 국내 어류 양식장에서 발생하는 세균성 질병에는 비브리오병, 에드워드병, 연쇄구균증, 활주세균증 등 여러 가지가 있지만, 세균성 질병 중 넙치 양식장에 가장 많은 피해를 주는 질병은 에드워드병과 연쇄구균증이다.
에드워드 병원체는 그램 음성 단간균인 Edwardsiella tarda로, 다른 세균과 마찬가지로 양식장 환경수 중에 존재하며 많은 경골어류에 질병을 일으킨다는 보고가 있으며(Wyatt et al., 1979; Yasunaga et al., 1982), 특히, 뱀장어(Aoki et al., 1977; Kanai et al., 1977), 숭어(Kusuda et al., 1976), chinook salmon(Amandi et al., 1982), 넙치(Yasunaga et al., 1982), 틸라피아(Miyashita, 1984; Oh and Chun, 1988) 등에서 감염된 보고가 있다. 본 질병이 발생되는 수조를 잘 관찰해 보면 이들 개체는 체색이 흑화되고 중앙 배수 파이프 근처에서 수류를 따라 빙빙 돌거나 배수 파이프에 붙어서 죽어 있기도 한다. 외부 증상으로는 복수가 고여 있고, 지느러미 및 복부 발적 및 충혈, 복부팽만, 탈장을 보인다. 양어지의 보균어, 사육수 및 저질에 생존해 있는 병원균이 어류에 경구적 또는 피부나 아가미의 손상부위를 통해 감염되어 발병된다. 본 질병은 연중 발생하는 경향을 보이나 수온이 20~30℃가 유지되는 여름철에 발생이 현저하며, 특히 25℃를 넘으면 급 격하게 발생율, 피해율도 함께 증가하게 된다. 넙치 양식장에서의 에드워드병은 심각한 피해를 주지만 내성균 출현 등의 문제로 치료 효과가 잘 나타나지 않아 장기적인 사용 가능성에 대해서 의문이 제기되고 있으며(권, 1999; Aoki et al., 1985), 저밀도 사육으로 사육 조건을 개선하여 예방을 하고자 하지만(水野, 1993), 그 효과는 일반적으로 높지 않다.
연쇄구균증(Streptococcosis)은 우리나라 뿐 만 아니라 인근 아시아, 미국, 남아프리카, 호주, 이스라엘 및 유럽 등 전 세계적으로 많은 피해를 야기시키는 질병으로서 원인균으로는 연쇄구균(Streptococcus iniae(syn. S. shilot)), S. difficile, Lactococcus garvieae(syn. Enterococcus seriolicida), L. piscium 및 Vagococcus salmoninarum 등 분류학적으로 다양한 균주들이 관여하는 것으로 알려져 있다. 연쇄구균(S. iniae)에 감염된 넙치는 체색이 검어지고 안구에 백탁이 생기면서 돌출되고, 눈 가장자리 및 지느러미가 붉어진다. 또한, 해부해 보면 간장의 충혈, 비대 또는 축소, 장관의 염증 및 출혈, 뇌출혈 및 아가미 뚜껑 내부에 농창이 형성되는 것으로 알려져 있다.
우리나라 주요 양식어류인 넙치는 국내 육상 수조에서의 양식어종 중 성장이 빠르고 사료 효율이 높아 우리나라의 동, 서, 남해 및 제주도 연안에서 양식되고 있으며, 양식 어류의 생산량 중에 가장 우위를 점하고 있는 종이다. 넙치는 자치어 때부터 다양한 질병의 피해를 입고 있으며, 양식장에서 치어 입식 후부터 성어를 출하하기 전까지 누적폐사량이 20~80% 정도 된다. 그 중 세균성 질병에 의한 피해가 가장 크며, 세균성 질병 중에서도 에드워드병과 연쇄구균증에 의한 피해가 80% 이상을 차지하고 있다. 그 중 에드워드병은 고수온기를 중심으로 특히 넙치 양식장에서 장기간에 걸쳐 발생하여 심각한 피해를 주고 있어 세균성 질병에 대한 항생제 등 여러 가지 방법으로 대책을 마련하고 있지만, 내성균 출현 등의 문제로 치료 효과가 잘 나타나지 않아 장기적인 사용 가능성에 대해서 의문이 제기되고 있으며(권, 1999; Aoki et al., 1985), 저밀도 사육으로 사육 조건을 개선하여 예방을 하고자 하지만(水野, 1993), 그 효과 또한 그리 높지 않다(Mekuchi et al., 1995).
최근 진 등(2005)의 연구에 의하면 제주도에 1996년도부터 2004년까지 9년 동안 양식 넙치의 전염성 질병검사 결과(10,187건)를 통하여 세균성 질병이 45.6%를 차지하였으며, 세균성 질병 중 비브리오 병 44.3%, 연쇄구균증 24.9%, 활주세균증 19.7%, 에드워드병 11.1%로 발병하였으며, 연쇄구균증의 월별 발생동향을 보면 8, 9, 10, 7월 순으로 호발하였음을 보고하였다. 어체 크기별로 연쇄구균증 발생동향을 조사한 결과, 20㎝이하의 치어에서 13건, 20~30㎝크기의 넙치에서 61건, 30~40㎝ 넙치에서 133건, 40㎝이상의 넙치에서 83건이 확인되어 30㎝이상의 성어에서 주로 피해가 나타나고 있음을 보고하였다.
또한 multiplex PCR로 가검물에서 분리된 187개의 균주를 감별검사한 결과, S.iniae가 84균주로 44.9%, S.parauberis가 103균주로 55.1%의 검출률을 보였다. 최근 김 등(2005)은 넙치에서 분리된 연쇄구균(S. iniae)의 형태학적 특성에 따른 병원성의 차이에 대해 보고하였는데, 국내 양식넙치에서 분리된 S. iniae는 기존에 보고되었던 non-viscous colony type과 달리 chain당 cell의 수가 더 많은 점액성의 viscous form이고, Yoshida et al.(1996)이 보고한 capsule을 가지고 있는 β- hemolytic Streptococcus spp.와 유사하다고 보고하였다. 또한 capsule을 가지는 균주가 capsule을 가지지 않는 균주에 비해 숙주의 serum killing에 저항성을 나타내며, 이 capsule이 균의 병원성 발현에 중요한 역할을 담당한다고 보고되고 있다.
한편, 백신은 사균화시킨 미생물(세균, 바이러스), 약화시킨 유기체 등을 체내에 투여하여 특정 질병에 대한 항체 형성에 따른 면역반응을 유도하도록 준비된 것으로, 특정의 전염병을 예방하기 위한 목적으로 개발된 항원(병원체)이 투여된 체내에서 만들어진 면역에 의해 질병을 예방할 수 있다. 하지만 개체의 면역반응에는 각기 차이가 있어 반드시 100%의 유효성이 보장되지는 않지만, 난치성 악성 전염병의 발생 증가에 의한 양식 어류 피해 증대 및 약제 오·남용에 의한 내성균 출현 증가에 따른 치료효과 저하, 외래종 도입 증가와 감염 종묘 이동에 의한 질병 확산이 우려에 따라 적절한 백신의 필요성이 증대되고 있다.
백신의 효능과 지속력을 증대시켜 주고 적절한 면역반응을 유도하기 위해 면역증강제(Adjuvants)를 필요로 한다. 백신의 면역증강제는 항원에 대한 특별한 면역반응과 백신의 효능을 최대한으로 이끌어 낼 수 있지만, 보편적으로 사용할 수 있는 면역증강제는 없으며, Target 동물, 질병 등과 같은 변수에 따라 적정한 면역증강제를 선택하고, 이외에도 면역증강 및 부작용이 없는 면역증강제의 선택이 백신 개발에 있어 매우 중요하다.
연쇄구균증에 대한 예방 백신으로는 Ghittino et al.(1995)이 무지개송어를 대상으로 S. iniae 및 L. garvieae의 formalin-inactivated whole cells vaccine의 효능을 조사한 바 있으며, Eldar et al.(1995)는 틸라피아에서 발생하는 S. difficile에 대한 whole cells vaccine 및 bacterial protein extract의 면역 효과를 보고하였으며, Klesius et al.(2000)이 S. iniae의 formalin-killed cells 및 concentrated extracellular products(ECPs)의 single and combined vaccine에 대한 틸라피아의 면역반응에 대해 보고한 것이 있다. Evans et al.(2004)은 S. agalactiae의 formalin-killed cells 및 ECPs를 틸라피아에 복강주사 및 침지면역 시킨 후 이들 백신의 효능을 비교하였으며, 최근에는 whole cells vaccine 및 ECPs 이외에도 live attenuated vaccine의 가능성에 대해서도 연구가 시도되고 있다.
이에, 본 발명자들은 어류의 세균성 질병의 발생을 감소시켜 국내 양식 환경의 피해량을 최소화 시키고, 약제 오남용에 의한 내성균 발생 등의 약제에 대한 안전성 및 유효성을 유지하기위해 예의 노력한 결과, 나노리포좀과 같은 면역증강제를 포함하는 어류용 백신 조성물이 양식 어류의 세균성 질병 발생을 예방하고 치료하는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트, 오일성분, 고급알코올 및 수성 성분을 함유하는 나노리포좀 및 항원성 물질을 포함하는 양식 어류용 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양식 어류용 백신 조성물은 보다 강한 면역반응을 유도하고, 약효의 방출시간이 지속적이고, 어류에 적용시 안전성이 크게 증가되어 조성물의 유통기간을 늘여 제품의 단가 및 사용기간을 증가시키고 부영양화를 초래하지 않아, 백신의 제형으로서 효과가 매우 우수하다.
본 발명에서 "글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트"는 하기의 화학식 구조에 의해 표시되는 비이온성 계면활성제로서, 난황 및 대두에 다량으로 포함된 천연계면활성제인 레시틴과 화학적 구조가 유사하다. 하기 구조의 화학물은 포스파티딜 콜린이 결합된 레시틴과는 달리 시트릭애씨드 락테이트 글리세롤 코코넛오일의 에스테르 결합으로 연결된 특징을 지닌 것으로, R은 12~16개인 알킬기로 구성되어 있다. 상기 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트는 화학적으로 합성할 수 있으며, 자연계에서 추출할 수도 있고, 상품화 된 것을 구입하여 사용할 수도 있다
<글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트의 구조>
Figure 112009017019595-PAT00001
* 상기 구조식에서 R은 C12-C16의 알킬기이다.
본 발명의 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트의 함량은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.01 내지 20% 중량%이며 바람직하게는 0.1 내지 5%이다.
본 발명의 나노리포좀에서 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트의 보조유화제로 폴리솔베이트(Polysorbate), 소르비탄올리에이트를 사용할 수 있으며, 상기 폴리솔베이트는 예를 들어 트윈-80, 트윈-60, 트인-40 및 트윈-20이고, 소르비탄 올리에이트는 Span 80이며, 상기 보조유화제의 함량은 나노리포좀의 총 중량에 대하여 0.1 내지 2 중량% 이며, 바람직하게는 0.2 내지 1 중량%이다.
본 발명에 사용된 "오일성분"은 어류에 의해 대사될 수 없는 오일로서, 무기오일을 지칭하며, 상기에서 언급한 "무기 오일"은 증류 기법을 통해 석유로부터 수득된 액체 탄화수소들의 혼합물을 지칭한다. 상기 용어는 "무기 경유", 즉 석유의 증류에 의해 유사하게 수득되지만 비중이 유동 파라핀보다 약간 더 낮은 오일을 포함한다. 상기 오일에는 알케인, 알켄, 알카인, 및 이들의 상응하는 산 및 알콜, 이들의 에테르 및 에스테르, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 바람직하게는, 상기 오일의 개별적인 화합물들은 가벼운 탄화수소 화합물, 즉 탄소수 6 내지 30의 상기와 같은 성분들이다. 상기 오일을 합성에 의해 제조하거나 또는 석유 산물로부터 정제할 수 있다. 상기 오일은 대사될 수 없는 오일로, 본 발명의 나노리포좀 및 백신 조성물에 사용하기에 바람직한 무기 오일로서 예를 들어 미네랄 오일, 스쿠알렌, 하이드로게네이티드 폴리데센(hydrogenated polydecene), 하이드로게네이티드 캐스트롤(hydrogenated castrol), 파라핀 오일 및 사이클로 파라핀 등의 비극성 오일이 있으며, 이로 제한되지 않는다.
본 발명에 사용된 "어류"는 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치 등을 의미하며, 바람직하게는 넙치, 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어이며, 더욱 바람직하게는 넙치, 조피볼락이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나노리포좀에서 오일 성분은 나노리포좀 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%이며, 바람직하게는 1 내지 20 중량%이며 보다 바람직하게는 1 내지 10 중량%이다.
본 발명의 수성 성분은 물, 완충 염수 또는 임의의 다른 적합한 수용액일 수 있으며, 나노리포좀 총 부피에 대하여 1 내지 90 중량%의 양으로 존재한다.
본 발명에서 용어 "나노리포좀"은 통상적인 리포좀의 형태를 갖는 것으로 평균 소적 크기가 50 내지 500 nm이며, 바람직하게는 80 내지 300 nm이며, 가장 바람직하게는 100 내지 200nm인 나노화된 리포좀을 의미한다. 상기에서 언급한 용어 "리포좀"은 수용성 머리와 불용성의 꼬리를 가진 양친매성 분자로 구성된 입자의 상호 자발적인 결합 및 정렬된 콜로이드 입자로, 내부에는 친수성의 공간이 있으며 외부로는 닫힌 이중의 지질막을 가지고 있는 미세 소포체(일종의 주머니)로서 세포막과 유사한 이중막 구조를 가진다. 나노리포좀은 중앙의 친수성공간에 수용성 분자(DNA 포함)나 혹은 약물을 내포시키며, 외부의 지질 이중막에는 지용성 약물을 붙이거나, 혹은 양전하 및 음전하 물질을 결합시킬 수 있다. 나노리포좀의 가장 큰 특성은 다양성과 신축성으로 구조 변경이 용이하며, 구조와 성분을 달리 함으로서 전혀 새로운 물성과 기능 및 용도가 제공될 수 있다. 여기에 나노리포좀은 생체 적합성과 분해성, 안정성이 뛰어난 장점이 있어 수없이 많은 물질 및 약물의 전달물질로 광범위하게 이용될 수 있다. 일반적으로 나노리포좀을 포함한 리포좀이 약물 및 유전자전달에 유용한 이유는 크게 4가지로서: 1) 약물이나 DNA를 싸서 보호하여 혈중 내 효소 등에 의해 파괴되는 것을 막고; 2) 원 상태로는 세포 내로 들어가기 힘든 물질, 예컨대 DNA를 세포내로 끌고 들어가는 기능이 있으며; 3) 약물방출이 지연되도록 조절하는 일종의 약물송달시스템(DDS)역할을 할 수 있으며; 4) 치료 물질을 표적세포로 향하게 하거나, 혹은 특정 부위로 가는 것은 막는 기능을 할 수 있다. 이로서 본 발명의 나노리포좀은 표적 약물의 효과를 극대화하면서 부작용을 최소화할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 나노리포좀에 포함 가능한 물질로는 항세균제, 면역조절물질, 항원(항원성 물질 포함) 및 항체, 사이토카인 등의 펩타이드, 단백질, 지방, 그리고 DNA 등이 있으며, 적합하고 바람직한 추가 성분들, 예를 들어 보존제, 삼투제, 생체 결합성 분자, 및 면역자극 분자를 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 나노리포좀은 생체세포막과 유사하므로 생체막 기능연구와 약물투과의 모델로도 널리 이용될 수 있다.
본 발명의 나노리포좀는 W/O/W 형태로, 외부상은 수상이므로 부드럽게 혈관에 침투될 수 있으며, W/O 형태보다 지속시간이 길며, 생분해성 물질로서 안전하여 동물에게 스트레스를 덜 주며, W/O/W 나노리포좀 보다 크기가 작고 외부막이 견고해 약물의 안정성을 확보하는 등 약물의 효과를 극대화 한다.
본 발명의 나노리포좀의 "평균 소적 크기"는 입자 크기의 부피 분포 내의 부피 평균 직경(이하, VMD) 입자 크기를 지칭한다. 상기 VMD는 각각의 입자직경에 상기 크기의 모든 입자들의 부피를 곱하고 합하여 산출된다. 이어서 상기를 모든 입자의 전체 부피로 나눈다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제(製劑)로서, 감염증의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원(免疫原)을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명의 상기 항원성 물질은 펩티드, 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 발현하는 유산균, 단백질, 상기 단백질을 발현하는 유산균, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 재조합 박테리아 및 재조합 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 상기 항원성 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 에드워드샐라 타라(Edwardsiella tarda), 연쇄구균(Streptococcus iniae(syn. S. shilot), S. 디피셜(S. difficile), 락토코커스 가배(Lactococcus garvieae(syn. Enterococcus seriolicida)), L. 피셤(L. piscium), 바고코커스 살모니나럼(Vagococcus salmoninarum), 마이코플라스마 MYO, 마이코플라스마 하이포뉴모니아에, 해모필루 스솜누스, 해모필루스 파라수이스, 보르데텔라 브론치셉티카, 액티노바실러스 플레우로뉴모니아에, 파스테우렐라 뮬토시다, 만헤이미아 헤몰리티카, 마이코플라스마 보비스, 마이코플라스마 갈라나시에움, 마이코박테륨 보비스, 마이코박테륨 파라 튜베르큘로시스, 클로스트리디알 스페시즈, 스트렙토코커스 유베리스, 스트렙토코커스 수이스, 스타필로코커스 아우레우스, 에리시펠로트릭스 루소파티아에, 캄필로박터 스페시즈, 퓨소박테륨 네크로포룸, 에스케리키아 콜라이, 살로넬라 엔테리카 세로바르스, 렙토스피라 스페시즈와 같은 병원성 세균; 칸디다와 같은 병원성 진균; 크립토스포리듐 파르븀, 네오스포라 카늄, 톡소플라스마 곤디, 에이메리아 스페시즈와 같은 원생동물; 오스테르타지아, 쿠페리아, 헤몬큐스, 파시올라와 같은 장내 기생충으로부터 제조된 항원이 있으며, 바람직하게는 에드워드샐라 타라, 연쇄구균, S. 디피셜, 락토코커스 가배, L. 피셤(L. piscium), 바고코커스 살모니나럼이다. 추가적인 항원에는 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 병원성 바이러스가 포함될 수 있다.
상기 항원성 물질의 함량은 백신 조성물 총 중량에 대해서 1~50 중량%이며, 바람직하게는 10~ 30% 중량%이다.
본 발명에 따른 백신용 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N--디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 나노리포좀 제조 시, 나노리포좀을 강화하기 위한 계면막 안정화제로서, 바다양식을 고려하여 침지제로서 고급 알코올 및 고급지방산 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 고급 알코올 또는 고급 지방산으로는, 예컨대 미리스틸 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 베헤닐 알코올 등이 포함될 수 있으며, 상기 고급 알코올 또는 고급 지방산의 함량은 나노리포좀 총중량에 대하여 0.1 내지 5중량% 이며, 바람직하게는 0.2 내지 1 중량 % 이며, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 백신 조성물을 어류에 주입하여 항원에 대한 항체 생성률을 높 이는 방법을 제공한다.
하기의 실험예 및 실시예들은 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 내용이 이에 한정된 것은 아니다.
실시예 1. 나노리포좀의 제조
하기 표 1의 조성으로 나노리포좀을 제조하였다.
나노리포좀의 제조 (함량: 중량%)
성분 비교예1 비교예2 비교예3 실험예1 실험예2 실험예3 실험예4 실험예5 실험예6 실험예7 실험예8 실험예9 실험예10 실험예11 실험예12
A 정제수 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to 100 to
100
레시틴 1 3 4 - - - - - - - - - - - -
글리세릴 코코에이트 / 시트레이트/ 락테이트 - - - 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
B 미네랄 오일 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
트윈 60 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
미리스틸알코올 0.1 0.5 1.0
세틸알코올 0.1 0.5 1.0
스테아릴 알코올 0.1 0.5 1.0
베헤닐 알코올 0.1 0.5 1.0
C 에드워드 시험 항원(5mg/ml) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10
A상과 B상을 각각 80℃까지 가열하여 완전히 용해하고 B상을 A상에 혼입한 후 호모믹서(TK-homomixer, 마크-2-F)를 이용하여 3500rpm으로 혼합물을 유화시켰다. 유화된 혼합액은 40℃까지 천천히 냉각시킨 후 40℃가 되면 C상의 항원을 혼입한 다음, A, B, 및 C상이 혼합된 혼합액을 상기와 동일한 호모믹서를 이용하여 3500rpm으로 교반한 후 미세균질기(Niro. Soavi, 이탈리아)를 이용하여 500 Bar의 압력으로 각각 3회씩 통과시켰다.
상기 A 상의 글리세릴 시트레이트/락테이트/리놀레이트/올레이트는 독일의 사솔(Sasol)사로부터 구입하여 사용하였고, 항원성분인 C상의 에드워드 시험 항원은 녹십자수의약품주식회사에서 개발한 시험항원(5mg/ml)을 사용하였다.
실시예 2. 나노리포좀 입자의 에너지 여과 투과 전자 현미경(EF-TEM)사진
본 발명에서 제조된 실험예 5의 나노리포좀의 다중층 형성 여부를 판별하기 위하여 에너지 여과 투과 전자현미경(EF-TEM, Carl Zeiss)을 이용하여 나노리포좀의 계면을 촬영하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3 의 결과에서도 알 수 있듯이, 본 발명의 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트로 제조된 나노리포좀 입자의 계면이 이중층으로 구성된 것을 확인할 수 있었다. 모양이 원형이 아닌 것은 입자의 강도가 유연하기 때문인 것으로 판단된다.
실시예 3. 나노리포좀의 안정성 시험
실시예 1에서 제조한 비교예 1 내지 3 및 실험예 1 내지 12의 조성물의 안정성 시험을 실시하였다. 안정성 평가는 조성물의 침전상태, 색상, 변취 정도를 4℃, 25℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도순환의 조건에서 8주 동안 확인하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
나노리포좀의 안정성 시험
안정성 침전상태 변취 색상
(온도) 25℃ 42℃ 온도순환 4℃ 42℃ 42℃
비교예 1 안정 안정 침전 침전 산패됨 변색(노란색)
비교예 2 안정 안정 침전 침전 산패됨 변색(노란색)
비교예 3 안정 안정 침전 침전 산패됨 변색(노란색)
실험예 1 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 2 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 3 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 4 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 5 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 6 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 7 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 8 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 9 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 10 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 11 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
실험예 12 안정 안정 안정 안정 안정 안정(백색)
표 2의 결과에서도 알 수 있듯이, 레시틴으로 제조된 나노리포좀(비교예 1 내지 3)의 경우 4℃, 42℃ 및 24시간 주기로 하여 4℃ 내지 50℃로 순환하는 온도순환 조건에서 침전과 합일이 발생하나 본 발명의 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트와 고급알코올을 포함하는 나노리포좀의 경우에는 침전이나 변색 또는 변취 없이 안정하였다.
실시예 4. 나노리포좀의 안전성 시험
실시예 1에서 제조한 실험예 2, 5, 8, 11을 이용하여, 넙치 80미에 대하여 복강 또는 침지방법으로 시험백신 접종 후 10일간 관찰하면서 운동성, 식욕감퇴, 복부팽만, 탈장, 폐사 등의 임상증상이 발현되는지를 관찰하였다.
시험백신별 접종경로별 넙치에 대한 안전성 시험결과
시험군 접종 접종 후 일별 임상증상 발현수(누적폐사수)
경로 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
실험예2 복강 0(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0)
침지 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
실험예5 복강 0(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0)
침지 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
실험예8 복강 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
침지 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
실험예11 복강 0(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0) 1(0)
침지 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0) 0(0)
상기 표 3의 결과에서도 알 수 있듯이, 실험예 2, 5, 8, 11을 침지접종한 개체 중 '복강투여의 경우 2일째부터 임상증상 발현수가 일부 나타나기는 하나 시험 사육 중 폐사건수는 전혀 없었다. 게다가 실험예 8의 고급알코올로 스테아릴 알코올을 포함하여 제조한 나노리포좀의 경우에는 침지 및 복강의 경우 모두에서 임상증상이나 폐사건수가 전혀 발견되지 않았다(표 1).
실시예 5. 실험실내 목적동물에 대한 안전성 및 유효성 시험
실험실내 목적동물에 대한 안전성 및 유효성 시험을 실시하였다. 시험은 실시예 1의 실험예 8, 실험예 8에서 C상의 에드워드 시험백신 대신 연쇄구균 시험백신을 동일함량으로 첨가한 실험예 13 및 상용백신으로서 연쇄구군백신 및 에드워드 백신을 각각 비교예 4, 비교예 5로 지정하여 하기의 실험을 실시하였다. 안전성 시험은 연쇄구균의 경우 복강에 접종방법으로, 에드워드 항원의 경우 침지방법으로 사용량의 2배량으로 과량접종하여 시행하였다.
- 시험백신 : 실험예 8, 실험예 8에서 에드워드 시험항원 대신 연쇄구균 시험항원이 첨가된 실험예 13, 연쇄구균백신(상용백신, 비교예 4), 에드워드백신(사용백신, 비교예 5)
- 시험동물 : S.iniae 및 E.tarda에 대한 항체 음성인 평균 체장 15~20cm의 넙치 270미
- 공격균주 : 연쇄구균(S.iniae) JSL0208주
1) 안전성 시험-과량접종/2배량
: 넙치 120미를 공시하여 각 그룹당 30미씩 4그룹으로 나누고, 4 그룹을 실험예 8(에드워드 시험백신, I군), 실험예 13(연쇄구균 시험백신, II군), 비교예 4(연쇄구균 상용백신, III군) 및 비교예 5(에드워드 상용백신, IV군)을 각각 권장용량보다 2배 많은 함량으로 복강 또는 침지접종한 후 21일동안 복부팽만, 탈장, 운동성, 식욕상태 등의 임상증상과 폐사유무를 관찰하였다.
2) 유효성 시험
: 유효성 시험은 응집항체가 및 폐사율 변화를 관찰하여 시험하였으며, 백신항원은 연쇄구균으로만 시행하였다. 실험은 넙치 180미를 공시하여 60미에는 실험예 13을(연쇄구균 시험백신, A군), 60미에는 비교예 4를(연쇄구균 상용백신, B군). 각각 미당 0.1㎖씩 복강으로 접종하고, 나머지 60미는 아무것도 접종하지 않는 비백신 대조군(비접종군, C군)으로 비교하기로 하였다. 백신 접종 후 8주까지 2주 간격으로 각 시험군 당 5미씩 무작위로 선발하여 채혈하였으며, 백신 접종 후 8주째에 백신을 접종하지 않은 넙치에서 2주간 누적페사율이 최소 60%를 보이는 균량의 S.iniae균(JSL0208)으로 모든 시험군에 대하여 복강으로 공격접종하였다. 공격접종 후 2주간 관찰하면서 대조군의 누적 폐사율이 최소 60%이상을 보였을 때, 나머지 백신군들의 상대생존율을 하기의 수학식 1에 따라 산정하여 상대생존율이 60%이상을 보였을 때 유효한 것으로 판정한다.
누적폐사율(%) = (1 - 백신군 누적폐사율/대조군 누적폐사율) X 100
<안전성 시험 결과>
: 모든 시험군에서 관찰기간 동안 복부팽만, 탈장, 운동성 저하, 식욕저하 등 어떠한 임상증상도 없이 건강하게 생존하였다(표 4, 5 참조).
시험백신의 넙치에 대한 안전성 시험 결과(1)
시험군 일별 임상증상 및 폐사현황 (임상증상발현수(누적폐사수))
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
I군 (n=30)
(실험예 8)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
II군(n=30)
(실험예13)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
III군(n=30)
(비교예 4)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
IV군(n=30)
(비교예 5)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
시험백신의 넙치에 대한 안전성 시험 결과(2)
시험군 일별 임상증상 및 폐사현황 (임상증상발현수(누적폐사수))
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
I군 (n=30)
(실험예 8)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
II군(n=30)
(실험예13)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
III군(n=30)
(비교예 4)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
IV군(n=30)
(비교예 5)		 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
2) 유효성 시험
백신 접종 후 2주째부터 항체가가 확인되었으며, 6주째에 항체가가 최고로 상승하였다(도 1 참조). 실험예 13을 적용한 A 군(연쇄구균 시험백신 접종군)의 경우, 최고 평균 1:2.8배 까지 상승하였으며(p<0.01), 비교예 4를 적용한 B군(연쇄구균 상용백신 접종군)의 경우, 최고 평균 1:2배까지 상승하였다(p<0.05).
백신 접종 후 8주째 공격접종 후 2주간 폐사수를 확인하면서 각 시험군별로 누적폐사율을 측정한 결과, 공격접종 후 11일째 대조군(비접종군)의 누적폐사율이 60%에 이르렀으며, 이때 A군(연쇄구균 시험백신 접종군)의 누적폐사율은 20%, B군(연쇄구균 상용백신 접종군)의 누적폐사율은 23.3%였다(도 2). 이를 토대로 A군과 B군의 상대생존율을 산출하였을 때, 각각 66.7%, 61.2%였다.
새롭게 개발된 나노리포좀 형태의 아쥬반트가 함유된 시험백신과 아쥬반트가 포함되어 있지 않으며 기존 상용화된 넙치연쇄구균백신을 각각 목적동물인 넙치에 접종하여 안전성과 유효성을 평가하였다. 먼저 안전성 시험결과, 위와 같이 시험백신, 상용화 백신 모두 과용량 접종시에도 넙치에 안전하였다. 그리고 면역원성에 있어서는 두 가지 백신 모두 넙치에서 유의적인 수준의 항체를 유도하였으며, 특히 아쥬반트가 함유된 백신이 다소 높은 수준의 항체가를 유도하였다. 이 결과는 백신 접종 후 8주째 실시한 공격접종시험에서도 상대생존율에 있어 아쥬반트가 첨가된 시험백신을 접종한 시험군이 상용화 백신을 접종한 시험군보다 약 5%정도 높은 상대생존율을 보임으로서 나노리포좀 형태의 아쥬반트가 백신의 면역원성과 방어효과를 높이는 효과가 있음이 입증되었다.
실시예 6. 야외 넙치 양식장 적용시 안전성 및 유효성 시험
1) 백신 접종
: 3,600미의 넙치를 공시하여 연쇄구균 시험항원이 첨가된 실험예 13 0.1㎖을 넙치의 복강으로 1회 접종하였다. 그리고 비교를 위하여 3,000미를 비백신 대조군(비접종군)으로 두었다.
2) 관찰사항
: 백신 접종 후 2개월간 관찰하면서 백신 접종군과 비백신군에서 매주 폐사현황 및 2주, 4주, 8주째의 임상증상 발현여부 및 증체량 및, 응집 항체가를 조사하였다. 임상증상 발현여부 및 증체량 조사 시험은 각 군당 무작위로 10미씩 선별하여 채혈하였으며, S.iniae에 대한 응집 항체가도 측정하였다.
3) 결과
<임상증상 및 폐사현황>
: 각 군의 페사현황을 관찰한 결과, 백신 접종 후 1주째부터 실험예13(백신접종군)과 대조군 모두에서 매주 폐사가 확인되었으며, 폐사 개체는 흑화, 복부팽만 등의 증세를 보였다(도 4 참조). 폐사된 개체로부터 세균분리를 시도하였으며, 분리 동정 결과, S. iniae로 확인되었다. 폐사 경향은 백신 접종후 초기 2주간은 백신 접종군과 대조군에서 모두 비슷한 수준의 페사율을 보였으나, 3주 이상에서는 백신 접종군의 폐사수가 급격히 감소하는 경향을 보였다. 또한 대조군에서의 주간 누적 폐사율은 상당히 불규칙한 양상을 보였다(도 4).
<증체량>
: 백신 접종에 대한 증체량 조사는 백신 접종전, 백신 접종 4주후, 8주후에 백신 접종군 및 대조군에서 무작위로 각각 100미씩 무작위로 포획하여 측정하였다. 백신 접종전의 백신 접종군의 미당 평균체중은 79.4g이었고, 대조군의 경우 81.2g이었다. 또한 백신 접종후 4주째 백신 접종군의 미당 평균 체중은 145.3g이었고, 대조군의 경우 143.8g이었으며, 8주째에는 백신 접종군의 경우 198.3g이었고, 대조군의 경우 181.3g으로 확인되었다(도 5 참조).
<항체가 변화>
: 백신 접종군에서의 항체가 변화는, 백신 접종전 평균 2배 이하의 음성 수준이 백신 접종 후 2주째부터 상승되기 시작하였다. 게다가 백신 접종 후 4주째에는 가장 높은 수준으로 유도되어 일정기간동안 유지되는 양상을 보였다. 이와 같은 실험실 내 면역원성 시험시보다 높은 수준으로 응집항체가가 유도된 이유는 야외에서 자연감염에 의한 부스팅 효과로 사료된다. 또한, 대조군의 경우 8주동안 개체별로 항체가 높게 유도되기는 하였으나 평균 항체가가 2배 이하로 백신 접종군에 비해 낮게 유지되었다.
<결론>
나노리포좀 형태의 아쥬반트(면역증강제)가 함유된 연쇄구균백신을 넙치 양어장에 적용하였을 때, 넙치에 대한 안전성과 유효성을 8주간의 시험기간을 통하여 평가하였다. 백신 접종 후 8주간 백신을 접종한 백신군(연쇄상구균 시험백신 접종군)과 백신을 접종하지 않은 대조군의 폐사현황, 임상증상 발현 유무를 관찰, 비교한 결과, 폐사현황에서 처음 2주간은 모든 시험군의 폐사율이 비슷하게 1.5%내외였으나 3주째부터 백신 접종군은 점차 감소하는 양상을 보여 백신이 야외 양식장에서 사육하고 있는 넙치에도 매우 안전함을 확인할 수 있었다. 그리고, 증체율에 있어서도 백신 접종전 비슷한 어체중을 보였으나 백신 접종 후 4주, 8주째에는 백신 접종군이 대조군에 비하여 1.6g, 17g정도 증체되어 백신에 의한 효율적인 연쇄구균증 방어에 의한 효과가 나타난 것으로 사료된다. 항체가도 백신 접종군의 경우 백신 후 4주째 평균 1:4배 수준의 높은 항체가를 유도한 반면, 대조군의 경우 1:2배 이하의 항체를 유도하여 면역원성에도 충분한 유도능을 나타내었다.
도 1은 백신 접종 후 시험군별 응집항체가 변화를 그래프로 나타낸 것이다(A: 연쇄상구균 시험백신(실험예13) 접종군, B: 연쇄상구균 상용백신(비교예4) 접종군, D: 비접종군).
도 2는 공격접종 후 시험군별 누적폐사현황을 나타낸 것이다(A: 연쇄상구균 시험백신(실험예13) 접종군, B: 연쇄상구균 상용백신(비교예4) 접종군, D: 비접종군).
도 3은 본 발명의 나노리포좀의 전자현미경 사진이다.
도 4는 백신 접종 후 시험군별 주간 누적폐사율 변화를 나타낸 것이다(백신군: 연쇄상구균 시험백신(실험예13) 접종군, 대조군: 비접종군).
도 5는 백신 접종 전후 시험군별 어체중 변화를 나타낸 것이다(백신군: 연쇄상구균 시험백신(실험예13) 접종군, 대조군: 비접종군).
도 6은 시험백신 접종 전후 주기별 항체가 변화를 나타낸 것이다(백신군: 연쇄상구균 시험백신(실험예13) 접종군, 대조군: 비접종군).

Claims (7)

  1. 하기 구조식 1로 정의되는 글리세릴 코코에이트/시트레이트/락테이트, 오일성분, 고급알코올 및 수성성분을 함유하는 나노리포좀 및 항원성 물질을 포함하는 양식 어류용 백신 조성물.
    <구조식 1>
    Figure 112009017019595-PAT00002
    상기 구조식 1에서 R은 C12-16의 알킬기이다
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 항원성 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태, 또는 통상적인 단백질 정제, 유전 공학 기법 또는 화학 합성에 의해 수득되는 항원 분자 형태의 에드워드샐라 타라, 연쇄구균(Streptococcus iniae), S. 디피셜, 락토코커스 가배(Lactococcus garvieae), L. 피셤 및 바고코커스 살모니나럼으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 양식 어류용 백신 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 항원성 물질은 불활성화된 전체 또는 부분 세포 제제 형태의 넙치연쇄구균(Streptococcus iniae)인 것인 양식 어류용 백신 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 고급 알코올은 미리스틸 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 및 베헤닐 알코올로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 양식 어류용 백신 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 어류는 넙치(광어), 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 고등어, 전갱이, 쥐치 등을 의미하며, 바람직하게는 넙치, 조피볼락, 우럭, 감성돔, 참돔, 능성어, 숭어, 농어 및 전어로 이루어진 군 으부터 선택되는 어느 하나인 것인 양식 어류용 백신 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 어류는 넙치(광어)인 것인 양식 어류용 백신 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항의 백신 조성물을 어류의 양식에 복강투여 또는 침지의 방법으로 접종하여 양식 어류의 세균성 질병을 예방 또는 치료방법.
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