KR102489930B1 - 어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 리포좀 백신 - Google Patents

어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 리포좀 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 리포좀 백신, 이의 제조방법 및 이를 활용한 어류의 에드워드병 예방 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 리포좀 기반의 어류 백신은 뱀장어류 등 어류에 경구로 투여되어 에드워드병에 대한 항체를 효과적으로 형성시킴으로써 에드워드병 예방 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 리포좀 백신은 어류의 에드워드병의 예방을 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 리포좀 백신{Oral Liposomal Vaccine for Prevention of Edwardsiellosis of Fish}
본 발명은 어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 리포좀 백신, 이의 제조방법 및 이를 활용한 어류의 에드워드병 예방 방법에 관한 것이다.
어류의 수요는 해마다 증가하고 있고, 이에 따라 고밀도로 수행되는 수산 양식에서 어류의 질병 발생은 생산량 감소의 큰 문제 중 하나로 지적되고 있다. 어류 질병 치료를 위해 항생제를 사용할 수 있으나 수역 오염 및 다제 내성균 유발 등의 문제가 있다. 이에 따라 어류 질병의 예방을 위한 다양한 백신 개발에 대한 필요성이 증대하고 있다.
어류에서 발생하는 질병 중 에드워드병(Edwardsiellosis)은 수산 양식의 큰 문제 중 하나이다. 에드워드병은 세균성 질병으로 그 원인체는 에드워드시엘라(Edwardsiella) 속 균주로 알려져있다. 예컨대, 양식 중인 뱀장어에서 에드워드병이 발병하면 지느러미나 복부가 붉어지고 항문의 확대와 돌출 또는 가장자리가 붉게 부어오르며 궤양이 형성된다. 내부 증상으로 간, 신장, 비장의 염증이 심해지고 농이 흘러 화농성 염증이 발생한다. 연중 나타나는 에드워드병은 실뱀장어부터 성어에 이르기까지 유행되며 장기간의 약품치료가 필요하다.
기존의 에드워드병 예방 백신은 에드워드시엘라 속 균주인 E. tarda의 포르말린 사균체를 주사 또는 침지(immersion) 투여하거나 경구 투여하는 방식이었다. 그러나, 주사 백신 형태로 접종이 수월하지 않은 문제가 있고, 경구 투여의 경우 백신 항원에 해당하는 사균체를 경구 복용 후 항원이 화학적, 생물학적 및 물리학적 분해에 직면하게 되어 소장의 Payer’s patch를 통해 흡수되어 체내 항체를 원활하게 생산하는 데에 한계가 있는 문제가 있다.
이에, 본 발명자는 상기 문제점들을 해결하고, 경구 투여가 가능하면서 어류 백신으로서 예방 효과가 뛰어난 리포좀 기반의 어류 에드워드병 백신을 개발하고자 하였다.
대한민국 등록특허 10-1569151 대한민국 등록특허 10-2047910
본 발명의 목적은 어류의 에드워드병 예방을 위한 경구용 백신을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 경구용 백신을 위한 리포좀 기반의 백신 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 경구용 리포좀 백신을 어류에게 투여하여 에드워드병의 예방을 달성하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 어류 에드워드병 예방용 리포좀 백신 조성물의 제조방법을 제공한다:
(i) 1~10 중량%의 레시틴(lecithin)을 수용액 내에 분산시켜 인지질 분산액을 형성하는 단계;
(ii) 상기 인지질 분산액에 1~5 중량%의 폴리소르베이트 20을 혼합하는 단계;
(iii) 상기 인지질 분산액에 에드워드시엘라(Edwardsiella) 속 균주의 사균체를 포함하는 용액을 적가(dropwise)하는 단계; 및
(iv) 형성된 리포좀을 수득하는 단계
여기서, 상기 (ii) 및 (iii) 단계는 동시에 수행되어 상기 인지질 분산액 내에 에멀젼이 형성되고, 이를 통해 상기 에드워드시엘라 속 균주의 사균체가 내부에 포집된 리포좀이 생성된다.
구체적으로, 상기 (i) 단계는 균질화기(homogenizer)로 3,000~9,000 rpm에서 1~10 분 동안 분산하는 과정에 의해 수행될 수 있다.
구체적으로, (ii) 및 (iii) 단계는 균질화기로 3,000~9,000 rpm에서 15~45 분 동안 분산하는 과정에 의해 수행될 수 있다.
구체적으로, (iii) 단계에서 에드워드시엘라 속 균주의 사균체를 포함하는 용액 내에 포함되는 에드워드시엘라 속 균주의 사균체는 4.0×108 내지 6.0×108 CFU/mL, 구체적으로 5.3×108 CFU/mL일 수 있다. 이때, 에드워드시엘라 속 균주의 사균체를 포함하는 용액은 인지질 분산액 부피의 0.5~2%의 부피로 적가될 수 있다.
구체적으로, 사균체는 포르말린 불활성화 사균 (FKC; formalin killed cell)일 수 있다.
구체적으로, 에드워드시엘라 속 균주는 E. tarda, E. piscicida 및 E. anguillarum로 구성된 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체적으로, 어류는 뱀장어목(Anguilliformes)에 속하는 어류일 수 있다.
구체적으로, 리포좀의 평균 입도가 150~300 nm일 수 있고, 평균 다분산지수가 0.1~0.4일 수 있다. 또한, 25℃ 기준 리포좀의 용출률이 10~30 %일 수 있다.
또다른 일측면에서, 본 발명은 상술한 리포좀 백신 조성물의 제조방법에 따라 제조된 어류 에드워드병 예방용 리포좀 백신 조성물이다.
구체적으로, 상기 리포좀 백신 조성물은 사료에 혼합되어 어류에게 투여될 수 있다.
또다른 일측면에서, 본 발명은 상술한 리포좀 백신 조성물을 어류에게 경구로 투여하는 단계를 포함하는 어류의 에드워드병 예방 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 예방 방법은 어류 1 마리당 평균 15 mg 이상의 리포좀이 경구로 투여되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 리포좀 기반의 어류 백신은 어류에게 경구로 투여되어 에드워드병에 대한 항체를 효과적으로 형성시킴으로써 에드워드병 예방 효과를 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 리포좀 백신은 어류의 에드워드병의 예방을 위한 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 어류 백신 투여 실험 일정을 시각적으로 표시한 도이고,
도 2는 어류 백신의 항체 응집가 측정 방법을 나타낸 사진이고,
도 3은 어류 백신의 리포좀 포집율을 측정한 HPLC 분석 결과를 나타낸 도이고,
도 4는 어류 백신의 리포좀 입도 측정 결과를 나타낸 그래프이고,
도 5는 어류 백신의 리포좀 용출 시험 결과를 나타낸 도이고,
도 6은 어류 백신의 리포좀 pH 안정성 시험 결과를 나타낸 도이고,
도 7은 어류 백신 투여 후 어류의 누적 폐사율을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 용어 "백신"은 생체에 면역을 주는 항원성 물질을 함유한 생물학적인 제제로서, 감염증의 예방을 위하여 생물체에 주입 또는 주사하여 생체에 면역이 생기게 하는 면역원을 말한다. 생체내 면역은 병원균의 감염 후에 생체내 면역력이 자동으로 얻어지는 자동면역과 외부에서 주입한 백신에 의하여 얻어지는 수동 면역으로 크게 나누어진다. 자동면역이 면역에 관계하는 항체의 생성 기간이 길고 지속적인 면역력의 특징이 있는 반면, 백신에 의한 수동 면역은 감염증 치료에 즉시 작용하나 지속력이 떨어지는 단점이 있다.
본 발명에서 용어 "리포좀"은 인지질 이중층의 매트릭스 형태를 갖추고 있는 세포막과 가장 유사한 형태의 단층 혹은 다층의 지질-이중막 구조를 지칭한다. 리포좀은 포스파티딜콜린(PC), 에탄올아민(PE), 세린, 스핑고미엘린, 카디올리핀, 플라스모젠, 포스파티딜산, 세레브로시드 등의 인지질로 구성되어 있는 이중층 폐쇠막을 형성하여 물과 평형상태에 있는 분자단일 수 있다. 리포좀을 구성하는 기본 단위인 인지질은 음이온성, 또는 극성머리부분과 비극성인 2개의 탄화수소 사슬로 되어있다. 탄화수소 사슬은 길이가 다양한데, 천연 인지질의 경우 탄화수소의 길이는 16개 이상이며, 1쌍 정도의 불포화도를 가진다. 리포좀은 천연 또는 합성 인지질로서 신진대사에 참여하여 생체막 분자와 상호교환이 가능하고, 생분해성이고, 신체에 대한 독성이 거의 없으며, 화학적 결합 없이 활성물질을 포집할 수 있다.
종래 어류 백신의 대다수인 주사 백신은 근육이나 복강으로 백신을 투여하여 면역화시키는 방법으로, 보조제와 함께 사용할 수 있어 면역 반응이 강하게 나타나고 효과적이나 백신 처리 과정에서 스트레스를 유발하는 등 현장에서 대량의 어류에 처리하기가 매우 어려우며, 전신 면역기구를 활성화해 백신의 효능을 유도하는 메커니즘이나, 주사 백신이 경골어류의 점막 면역을 효과적으로 유도할 수 있는지 문제가 제기되어 왔다. 반면, 본 발명의 경구용 백신은 장 점막을 이용하여 면역 반응을 유도하기 위한 백신으로 장 점막은 많은 병원체의 중요한 감염 경로 중 하나이다. 어류의 장에는 포유류의 장처럼 조직화한 림프 조직의 존재에 관한 연구가 부족하지만, 후천 면역 생성을 위한 면역 기관의 역할을 한다는 증거가 발견되고 있다(Yongyao et al., 2020 등). 그러나 종래 경구백신으로 장에 도달한 항원은 위산과 담즘 염으로 파괴되어 항원이 적합한 곳에 도달하지 못하는 경우가 많았다. 이러한 경구백신의 단점을 없애기 위하여, 본 발명자는 항원을 효과적으로 전달하는 방법으로 미세입자로 항원을 캡슐화하여 전달하는 리포좀 및 코팅 리포좀 기술을 적용함으로써 본 발명의 리포좀 백신을 제조하였다.
본 발명에서 레시틴(lecithin)은 글리세린 인산을 함유하는 인지질의 하나이다. 레시틴은 생체막의 주요 구성 성분으로, 동물의 뇌, 척수, 혈구, 난황 따위와 식물의 종자, 효모, 곰팡이류 등에 많이 함유되어 있다. 본 발명에서, 1~10 중량%의 레시틴을 수용액 내에 분산시켜 인지질 분산액을 형성한다.
상기 인지질 분산을 위해 균질화기(homogenizer)를 사용할 수 있다. 균질화기는, 기계적 힘을 가해 두 가지 이상의 액체물질을 유화시키는 장치로서, 서로 용해되지 않는 물질을 무리 없이 혼합할 수 있게 된다.
보다 구체적으로, 상기 균질화기는 애지 호모 믹서(Agi homo mixer)일 수 있다. 애지 호모 믹서는 페이스트, 크림, 로션, 슬러리, 껌, 접착제, 안료 코팅 및 수지 화합물을 혼합, 균질화 또는 유화하기 위한 것이다. 애지 호모 믹서의 임펠러가 강력한 회전을 통해 내용물을 흡입시키고 몸통과 임펠러 사이의 미세한 간극을 통해서 빨려들어가게 되며 body 위에 뚫린 홀로 입자들이 빠져나가게 된다. 불균질물이 임펠러를 통해 간극을 통과하면 아주 작은 size로 재구성되어 서로 섞이므로 균질한 상태가 된다.
본 발명에서 폴리소르베이트(polysorbate) 20은 Tween 20으로도 불리며, 라우릴산 첨가 전 솔비탄의 에톡시화에 의해 형성되는 폴리소르베이트-타입의 비이온성 계면활성제이다. 폴리소르베이트 20은 안정하고 비독성 물질로서, 유화제로 유용하게 사용된다. 본 발명에서, 인지질 분산액에 1~5 중량%의 폴리소르베이트 20을 혼합하여 사용하였다. 폴리소르베이트 20은 레시틴이 균질화기에 의해 수용액에 분산된 후 인지질의 친수성 머리와 소수성 꼬리의 친화도에 의해 리포좀을 잘 형성할 수 있도록 돕는다.
혼합을 위해 균질화기로 3,000~9,000 rpm에서 15~45 분 동안 분산할 수 있다.
본 발명에서, 에드워드병의 항원인 에드워드시엘라 속 균주의 사균체는 인지질 분산액에 적가(dropwise)하여 수행된다. 이 과정은 인지질 분산액에 폴로스로베이트 20을 혼합하는 것과 동시에 수행되며, 이를 통해 인지질 분산액 내에 에멀젼이 형성되고, 상기 에드워드시엘라 속 균주의 사균체가 내부에 포집된다.
본 발명에서, 에드워드병(Edwardsiellosis)은 해산어를 비롯 담수산어류에서 패혈증을 유발하는 질병으로, 양식어류에서 가장 높은 피해를 유발하는 세균성 질병 중 하나이다. 에드워드병에 감연된 어류는 양식지 수면을 맥없이 유영하고, 흰색으로 변하고, 항문돌출, 안구돌출, 발적 및 확장이 일어나고 복부가 팽만 되며 꼬리지느러미가 적변화되며 내부증상으로는 복수가 차 있거나 생식소의 발적과 경화가 나타나며 누적폐사율이 20-30%에 달하는 경우도 있다. 또한, 병원균이 간장을 침해하는 경우 복부전체가 붉게 변하여 곪거나 부어오르며 복벽에 구멍이 생길 수 있다. 병원균이 신장을 침해하는 경우 항문확대 및 돌출이 일어나며 지느러미와 피부의 출혈이 생긴다.
본 발명에서, 에드워드시엘라(Edwardsiella) 속 균주는 대장균과 유사한 통성혐기성 그람음성 간균이다. 에드워드시엘라 속 균주에 속하는 대부분의 종이 편모(flagella)에 의한 운동성을 가진다. 어류의 표피 및 장기에 궤양 등 다양한 증상을 동반하는 에드워드병을 일으키는 세균으로 알려져 있다. 에드워드병의 주요 원인체는 E. tarda로 알려져 있었으나, 추가적인 연구로 인해 E. piscicida와 E. anguillarum이 발견되었으며, 현재 E. tarda로 분리된 균주들은 대부분 E. piscicida로 알려져있다(Bujan et al., 2018; Shafiei et al., 2016 등).
본 발명에 따른 리포좀 백신에서 에드워드시엘라 속 균주 사균체의 리포좀 포집률은 30 내지 50%일 수 있고, 예컨대 38.36%일 수 있다.
본 발명에 있어서, 어류는 해산어류 또는 담수어류일 수 있고, 예컨대 넙치류, 가자미류, 농어류, 능성어, 감성돔, 참돔, 돌돔, 기타돔류, 민어, 방어, 복어류, 조피볼락, 기타볼락류, 고등어류, 노래미류, 송어류, 숭어류, 연어, 붕장어, 전갱이류, 전어, 참조기, 쥐치류, 철갑상어, 잉어류, 뱀장어류, 메기류, 쏘가리 및 열대어로 구성된 군에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 리포좀 백신을 뱀장어의 에드워드 병 예방을 위해 투여하고 그 예방 효과를 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 어류의 바람직한 예는 뱀장어목(Anguilliformes)에 속하는 어류, 예컨대 뱀장어과(Anguillidae), 붕장어과(Congridae), 갯장어과(Muraenesocidae) 또는 곰치과(Muraenidae) 어류이다.
본 발명에 따른 어류 리포좀 백신 조성물을 어류에게 경구 투여한 결과, 임위감염 실험에서 폐사율이 대조군 대비 현저히 감소하였으며(실험예 4; 도 7), 백신 투여 후 추출한 혈청에서 수행한 항체응집률 역시 대조군 대비 현저히 낮아 에드워드병에 대한 항체가 효과적으로 형성되었음을 확인하였다(실험예 5; 도 2). 따라서, 본 발명의 어류 리포좀 백신은 에드워드병 항원인 에드워드시엘라 속 균주를 리포좀으로 효과적으로 코팅함으로써 어류에서 충분한 면역반응을 유도하여 백신으로서의 기능을 훌륭히 수행함을 확인하였다.
본 발명의 리포좀 백신 조성물에서, 에드워드시엘라 속 균주의 사균체 함량은 리포좀 총 중량에 대해서 15 내지 45 중량%이며, 예컨대 30 중량%이다.
본 발명에 따른 백신용 조성물은 안정제, 유화제, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, pH 조정제, 계면활성제, 리포솜, 이스콤(iscom) 보조제, 합성 글리코펩티드, 증량제, 카복시폴리메틸렌, 세균 세포벽, 세균 세포벽의 유도체, 세균백신, 동물 폭스바이러스 단백질, 서브바이랄(subviral) 입자 보조제, 콜레라 독소, N, N--디옥타데실-N',N'-비스(2-하이드록시에틸)-프로판디아민, 모노포스포릴 지질 A, 디메틸디옥타데실-암모늄 브로마이드 및 이의 혼합물로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 제 2 보조제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 또한 수의학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. "수의학적으로 허용 가능한 담체"란 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항원보강제, 안정제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 작용제, 흡착지연제 등을 포함한다. 백신용 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제, 희석제로는 락토즈, 덱스트로스, 슈크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 글리세린, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들수 있다.
또한, 본 발명의 백신용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 레시틴 유사 유화제에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 슈크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 사용할 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제가 포함된다. 비수용성제제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 상기 어류 병원체의 불활성화 균체를 포함하거나, 완충액을 추가로 포함할 수 있으며, 불활성화 균체는 포르말린 처리 방법, 열처리 방법 또는 동결처리 방법 등으로 제조될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명의 백신 조성물은 면역 보조제 또는 면역 증강제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 조성물은 어류 병원체를 완충액에 현탁하여 현탁액으로 사용하거나, 어류 병원체가 포함된 완충액 현탁액과 면역 보조제를 혼합하여 제조할 수 있다. 또는, 면역 보조제와 완충액의 혼합 용액에 어류 병원체를 완충액에 현탁하여 현탁액를 첨가하여 제조할 수도 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 부형제 및/또는 안정화제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 경구 투여용 백신 조성물은 사료에 포함되어 투여될 수 있다. 본 발명에서 상기 “사료”란 동물이 먹고 섭취하고 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 또는 한끼식의 성분을 의미한다. 본 발명에 따른 사료는 통상의 어류 양식에 사용되는 배지에, 본 발명에 따른 백신 조성물을 일정량 첨가하여 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 리포좀 백신 조성물은 어류에 경구 투여되어 에드워드병의 예방을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물에 포함되는 병원체 균주의 사균체는 적용 대상 어류 또는 병원체 등에 따라 적절히 조절하여 설정될 수 있다. 본 발명의 백신 조성물은 어류 1 마리당 주입되는 불활성화 균체의 함량을 고려하여 제조될 수 있으며, 상기 균체의 함량은 일괄 또는 수회 나누어 투여될 수 있다. 구체적으로, 뱀장어목 어류에 대해 본 발명의 백신 조성물 내 리포좀 15 mg 이상을 어류 1 마리당 투입할 때 그 효과가 극대화될 수 있음을 확인하였다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예>
1. 에드워드병 항원의 제조
본 발명의 백신 항원으로 병원체 균주의 사균체인 FKC (Formalin killed cell) 항원을 사용하였다.
구체적으로, 에드워드병의 발병 균주로 알려진 Edward piscicida 균주는 전북 고창의 양만장에서 질병으로 자연사 한 뱀장어를 수거하여 분리하였다. 분리한 균주를 TSA (tryptic soy agar)에 스트리킹하고 30℃에서 24-48시간 동안 배양하고, 형성된 콜로니를 TSB로 계대배양하였다. 완충된 포르말린(0.5%)을 균주 현탁액에 첨가하고 4℃에서 밤새 배양하여 균주를 불활성화시켰다. 비활성화된 균주를 후속적으로 수확하고 멸균 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 5000×g에서 4℃에서 5분 동안 원심분리하였다. 포르말린이 확실히 제거되도록 3회 세척을 수행하였다. 비활성화된 세포를 멸균 PBS에 재현탁하고, 약 1mL의 백신을 혈액 한천에 스트리킹하여 무균 상태를 확인하였다. 혼합물을 최종적으로 37℃에서 24-48시간 동안 배양하였다. 균주의 농도는 콜로니를 계수하여 계산하였고, 540 nm에서 흡광도가 1일 때 5.3 × 108 CFU/mL로 측정되었다. 리포좀 제조를 위해 FKC 항원의 습중량을 측정한 후에 사용하였다.
2. 경구용 에드워드병 리포좀 백신의 제조
PBS 100 ml에 레시틴 5 g을 혼합한 후 agi homo mixer 6,000 rpm에서 5분간 분산시켰다.
그 후, tween 20 2.5 ml와 E. piscicida FKC 1 ml을 추가로 혼합하여 agi homo mixer 6,000 rpm에서 30분간 분산시켰다. 구체적으로, 포집될 물질이 녹아 있는 인지질 수용액에 에멀전이 만들어질 수 있도록 분산과 동시에 E. piscicida FKC를 peristaltic pump를 사용하여 1 ml/min으로 적가(dropwise)하여 E. piscicida FKC가 포함된 리포좀의 수용상 코어를 형성시켰다.
상기 제조된 용액 내에 포함되는 에드워드시엘라 속 균주의 사균체는 5.3×108 CFU/mL였다.
3. 뱀장어 중간 육성어 샘플의 준비
양식장에서 임상시험 장소로 뱀장어를 운송하고, 시험 수조에 순치시켰다. 시험 수조의 크기는 약 500L이고, 수조 당 입식 마릿수는 50 마리이며, 수온은 28℃로 하였다. 뱀장어의 안정을 위해 수조 전체를 덮을 수 있는 가림막을 설치하였다.
뱀장어에게 경구백신을 투여해야 하므로 사료를 급이한 뒤 24 시간 후 사료가 남아있는지를 확인하여 섭이 유무를 지속적으로 관찰하였다. 또한, 사료를 지속적으로 주기 때문에, 사육수의 수질 변화(수온, 용존산소, pH, NO2, NO3)를 지속적으로 관찰하였다.
4. 리포좀 경구 백신 및 주사 백신 접종
상술한 리포좀 경구 백신은 사료와 섞어 투여하며, 1회 투여량이 FKC로서 5 mg/fish, 10 mg/fish, 20 mg/fish의 농도가 되도록 조절하여 제조하였으며, 주사 백신은 FKC로서 10mg/fish의 농도가 되도록 조절하여 제조하였다. 실험군은 대조군(control), 경구백신 투여군 및 주사백신 투여군으로 나누어 각 50마리씩 수조에 분주하여 시험을 수행하였다.
각 시험그룹에 대한 접종 농도와 방법은 다음과 같았다.
[표 1]
Figure 112022004583884-pat00001
경구 백신 그룹의 경우, 전동 피펫을 이용하여 백신의 양을 각각 정량하여 일정량의 사료와 혼합하여 투약하였다(도 1). 주사 백신 그룹의 경우 뱀장어 복강 내 10 mg/fish 으로 접종하였다. 주사 백신 접종 시 시험어의 스트레스 감소와 접종 용이성을 위해 수산용 마취제를 이용하여 마취 후 접종하였다.
5. 백신 접종 후 혈청 추출
응집항체가 분석을 위해 백신 접종 후 뱀장어의 혈청을 추출하였다. 실험어를 마취 후 미부정맥에서 말초혈액을 추출하고, 4℃에서 1시간 동안 반응 후 6000rpm에서 4℃, 15분간 원심분리한 후 혈청을 분리하였다. 시험어의 스트레스 감소와 시험 용이성을 위해 수산용 마취제를 이용하여 마취 후 주사기를 이용하여 채혈하였다. 채혈한 혈액은 4℃에서 1시간 동안 반응 후 6000rpm에서 4℃, 15분간 원심분리 후 혈청을 분리하였다. 채혈한 혈액은 시료 운송 전까지 -80℃의 초저온 냉동고에 보관하고, 분리된 혈청은 아이스팩과 함께 보온용기에 포장하여 운송하였다.
6. 인위감염 후 그룹별 누적폐사율 측정
경구백신 투여 종료 후 사전에 확인한 농도의 E. piscicida를 1.0×109 CFU/fish 이상의 농도로 인위감염시켜 15일간 폐사율과 상대 생존율을 측정하였다. 구체적으로, BHIA(Brain Heart Infusion Agar) 평판배지에 계대배양한 E. piscicida를 BHIB(Brain Heart Infusion Broth) 액체배지 100 ml에 접종하여 진탕배양기에서 24시간 배양하였다. 증균된 배지는 4000rpm에서 15분간 원심 분리하여 배지와 균을 분리하였다. 분리된 배지는 폐기하고 PBS를 이용하여 균을 현탁하였다. 균 현탁액의 최초 농도(CFU/mL)를 확인한 뒤 2.46×109 CFU/mL 의 농도로 개체당 100μl 씩 복강주사 하였다. 시험어의 스트레스 감소와 접종 용이성을 위해 수산용 마취제를 이용하여 마취 후 접종하였다. 접종 후 15일 간 폐사율을 관찰하였다(도 1).
폐사 개체의 신장과 비장을 무균적으로 분리하여 SS(Salmonella-Shigella) 평판배지에 조직의 단면을 찍어 도말한 결과, E. piscicida에 의해 황화수소가 발생, 구연산 철과 반응하여 검정색 집락을 띔을 확인하였다.
7. 경구백신 투여 후 그룹별 항체응집가 측정
경구백신 투여 종료 후 얻은 혈청을 이용하여 항체응집가를 측정하였다. 항체응집검사(antibody agglutination test)는 특정 항원에는 특정 항체만 결합하는 항원-항체 결합을 이용한 검사 방법으로 입자 상태의 항원이 항체와 결합하여 엉킨 상태를 응집이라 하며, 항체가 응집원을 다리처럼 서로 연결시켜 항원과 항체가 덩어리지도록 하는 것을 응집 반응이라고 한다. 이러한 응집반응을 이용하여 항체의 존재를 검출하는 방법을 항체응집검사라고 한다.
항체응집가를 조사하기 위하여 96 well plate에 마지막 희석배수를 제외한 well마다 100 ul의 PBS를 첨가하였다. 각 실험구간의 혈청을 well마다 100 ul씩 넣어 2배씩 단계희석을 수행하였다. 단계희석을 수행한 모든 well에 준비된 E. piscicida 불활화 균주 107 CFU/mL 용액을 50 ul씩 투여 후 시간에 따른 응집가를 확인하였다.
응집가를 확인할 때 96 well plate를 세웠을 경우 아래로 흐르면 음성, 흐르지 않으면 양성으로 확인하여 단계희석 배수를 확인 후 기록해 평균값을 계산하였다. 확인한 평균값을 log2 값으로 표현하여 실험구별 항체 응집가를 비교하였다(도 2).
<실험예 1> 뱀장어 리포좀 경구 백신의 리포좀 포집율 측정
FKC를 포함하는 리포좀 백신의 포집율을 확인하기 위하여, 리포좀 제조 시 10% 갈산(gallic acid; junsei, Japan)을 첨가하여 제조하였다. 리포좀 제조 후 시료를 1 ml씩 샘플링한 후 15,000 rpm에서 20 분간 원심분리하여 상층과 하층을 분리했다. 이중, 하층에 포함된 리포좀이 FKC가 포함된 리포좀 백신에 해당한다. 이후, 60℃ dry oven에서 건조시킨 후 상층과 하층에 각각 100 μl triton X-100을 추가하여 vortex 하였다. 그 후 지표 물질로서 0.1% 이부프로펜(ibuprofen, Merck, Korea)) 900 μl를 추가하고 0.22 μM PVDF 필터를 사용하여 여과 후 HPLC로 분석하였다. 리포좀 포집율 확인을 위한 HPLC 분석 조건은 다음과 같았다.
[표 2]
Figure 112022004583884-pat00002
HPLC 분석 결과 포집물질인 갈산(gallic acid)은 RT 2.08 min에 검출되었고 지표 물질인 이부프로펜은 RT 4.75 min에 검출되었다(도 3). 검출된 피크 면적을 통해 포집율을 계산하였다. 이부프로펜 값이 일정하다는 조건 하에 matrix의 간섭을 비율로 계산한 결과 상층은 61.64%, 하층은 38.36%의 포집율을 나타냈다.
[표 3]
Figure 112022004583884-pat00003
<실험예 2> 뱀장어 리포좀 경구 백신의 리포좀 입도 측정
상술한 실시예에 따라 제조된 리포좀의 리포좀 입도를 하기 조건에 따라 분석한 결과, 평균 입도 201.7 nm, 다분산지수 0.179로 측정되었다(도 4). 측정 파라미터 정보는 아래 표와 같았다.
[표 4]
Figure 112022004583884-pat00004
<실험예 3> 온도 및 pH 변화에 따른 항원 용출 시험
온도에 따른 항원 용출 정도를 알아보기 위해 실시예에서 제조한 리포좀을 각각 25, 37, 60, 80℃에 1시간 방치 후 HPLC로 용출률을 측정하였다. HPLC 분석 방법은 포집율 분석법과 동일하게 진행되었다. 상온(25℃)에서 리포좀 용출률이 21.85±7.11%로 측정되었다. 온도가 높아질수록 용출율도 높아졌으나 60℃에서 31.33±5.68%, 80℃에서 35.59±3.15%로 유의적인 차이가 없이 안정함을 나타냈다(도 5).
다음으로, 낮은 pH 조건에서의 항원 용출 정도를 알아보기 위해 인공위액(pH 1.2)을 제조하고 시간에 따른 탁도의 변화를 측정하였다. 1시간 동안 10분 간격으로 반응 후 UV/Vis spectrophotometer를 사용하여 695 nm에서 흡광도를 측정한 결과 인공위액에서 안정하다는 것을 확인하였다(도 6).
<실험예 4> 누적 폐사율
상술한 실시예에 따라, 백신 접종 후 뱀장어의 누적 폐사율을 측정한 결과, 대조구 > 경구투여 5mg = 경구투여 10mg > 주사접종(10mg) > 경구투여 20mg 순으로 누적 폐사율이 낮아짐을 확인하였다. 구체적으로, 백신을 접종하지 않은 대조구에서는 누적 폐사율이 46.0%로 나타났으며, 백신을 접종한 실험구의 평균 폐사율인 11.0% (최고값 14.0%)에 비해 4.18배 높은 폐사율을 보였다. 또한, 경구투여 20 mg/fish 그룹의 경우 누적폐사율이 6.0%로 백신이 투여된 모든 그룹 중 가장 낮은 누적폐사율을 보였다(도 7).
<실험예 5> 항체응집가
상술한 실시예에 따라, 백신 접종 후 뱀장어의 항체응집가를 측정한 결과, 경구투여 20mg > 경구투여 10mg > 경구투여 5mg > 대조구(control) 순으로 항체응집가가 낮아짐을 확인하였다.
전체적으로 백신을 투여한 실험구에서 대조구보다 높은 항체응집가를 나타내었으며 20 mg 경구 투여구에서 25.125로 높은 항체응집가를 나타내었다.

Claims (15)

  1. (i) 1~10 중량%의 레시틴(lecithin)을 수용액 내에 분산시켜 인지질 분산액을 형성하는 단계;
    (ii) 상기 인지질 분산액에 1~5 중량%의 폴리소르베이트 20을 혼합하는 단계;
    (iii) 상기 인지질 분산액에 에드워드시엘라(Edwardsiella) 속 균주의 사균체를 포함하는 용액을 적가(dropwise)하는 단계; 및
    (iv) 형성된 리포좀을 수득하는 단계
    를 포함하는 방법에 의해 제조되고, 여기서 상기 (ii) 및 (iii) 단계는 동시에 수행되어 상기 인지질 분산액 내에 에멀젼이 형성되고, 이를 통해 상기 에드워드시엘라 속 균주의 사균체가 내부에 포집된 리포좀이 생성되는 것을 특징으로 하고,
    사료에 혼합되어 투여되는 것을 특징으로 하는
    경구용 뱀장어목(Anguilliformes) 어류 에드워드병 예방용 리포좀 백신 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, (i) 단계는 균질화기(homogenizer)로 3,000~9,000 rpm에서 1~10 분 동안 분산하는 과정에 의해 수행되는 것인, 리포좀 백신 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, (ii) 및 (iii) 단계는 균질화기로 3,000~9,000 rpm에서 15~45 분 동안 분산하는 과정에 의해 수행되는 것인, 리포좀 백신 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, (iii) 단계에서 에드워드시엘라 속 균주의 사균체를 포함하는 용액 내에 포함되는 에드워드시엘라 속 균주의 사균체는 4.0×108 내지 6.0×108 CFU/mL인 리포좀 백신 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, (iii) 단계에서 에드워드시엘라 속 균주의 사균체를 포함하는 용액은 인지질 분산액 부피의 0.5~2%의 부피로 적가되는 것인, 리포좀 백신 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 사균체는 포르말린 불활성화 사균 (FKC; formalin killed cell)인 리포좀 백신 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 에드워드시엘라 속 균주는 E. tarda, E. piscicida 및 E. anguillarum로 구성된 군에서 선택된 1종 이상인 리포좀 백신 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 미네랄 오일을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 리포좀의 평균 입도가 150~300 nm인 리포좀 백신 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 리포좀의 평균 다분산지수가 0.1~0.4인 리포좀 백신 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 25℃ 기준 리포좀의 용출률이 10~30 %인 리포좀 백신 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 뱀장어목 어류에게 경구로 투여하는 단계를 포함하는 어류의 에드워드병 예방 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 뱀장어목 어류 1 마리당 평균 15 mg 이상의 리포좀이 경구로 투여되는 것인 예방 방법.
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