CN115350161A - 基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统及其制备方法和应用，属于医药技术领域，具体公开了采用了益生菌Escherichia coli Nissle 1917来源的细菌外膜囊泡包载二氧化锰纳米酶，制备成纳米益生菌体。细胞实验显示，该纳米益生菌体能清除细胞内过量的活性氧，同时并未对细胞造成损伤。进一步动物试验证实，该纳米益生菌体可以黏附于炎症的结肠上皮并有效清除肠道过量的ROS。此外，与抗炎药二甲双胍联用后还可以重塑促炎微环境，提高肠道菌群的丰富性和多样性，比市售IBD药物具有更好的疗效。本发明制备的纳米益生菌体能够显著治疗IBD，并具有良好的安全性，有望开发为治疗IBD和其他胃肠道疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及载药纳米粒，具体涉及一种基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备，以及其在抗炎性肠炎方面的应用。
背景技术
炎症性肠病(IBD)，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是一种典型的胃肠道慢性炎症性疾病。其发病机制与肠道氧化应激、肠道菌群失调、促炎微环境失调密切相关。传统的医学IBD治疗集中于抑制系统免疫系统，引起脱靶的副作用，增加感染的风险。因此，临床迫切需要有效治疗IBD的方式。
肠道微生物群的失调是IBD的一个重要标志，这表明肠道微生物群的重塑可能会缓解IBD。有一些证据表明，将益生菌移植到患病动物的肠道中可以缓解这种疾病，而微生物物种的多样性对健康有直接影响。这一理论最成功的应用之一是使用粪便微生物群移植(FMT)治愈复发性艰难梭菌感染。这种以细菌为基础的生物疗法在临床已被证明可以减轻肠道感染。然而，FMT可能导致侵袭性多药耐药微生物传播的潜在风险，并可能产生严重的不良反应。这一在FMT中暴露的安全问题揭示了当前细菌介导的生物治疗的困境。
益生菌衍生的外膜囊泡(OMVs)，自然来源于革兰氏阴性菌，具有直径为20-400nm的双脂层。OMVs由多个生物分子组成，如蛋白质、脂质和细菌特异性抗原，在解毒、基因传递和细菌-细菌通信中发挥重要作用。具有解毒成分和易于大规模生产的OMVs被认为是生物医学应用的细菌替代品。一方面，在澳大利亚，益生菌EcN作为
的主要成分，已作为一种注册的补充药物，用于临床缓解和管理慢性便秘。另一方面，据报道由幽门螺杆菌衍生的OMVs包裹的聚(乳酸共乙醇酸)纳米颗粒继承了天然的细菌粘附素，以阻断幽门螺杆菌与胃上皮细胞的结合。它们作为致病性幽门螺杆菌的竞争对手，减少了幽门螺杆菌对小鼠胃的粘附。该安全有效的平台为IBD和其他胃肠道疾病提供有效的治疗途径。
经文献检索等，迄今为止，尚未发现有益生菌Escherichia coli Nissle 1917的OMVs制备包被二氧化锰的OMVs载药系统，并进行IBD及其他胃肠道疾病研究的相关报道。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种益生菌衍生的外膜囊泡包被纳米酶的制备及其用途，尤其是源于益生菌Escherichia coli Nissle 1917的外膜囊泡包载的二氧化锰纳米酶用于制备治疗IBD实例。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种基于工程化益生菌衍生外膜囊泡包被纳米酶递送及其制备方法，以及其在抗炎性肠炎方面的应用，尤其是源于益生菌Escherichia coli Nissle 1917的外膜囊泡包载二氧化锰纳米酶在制备治疗IBD的药物中的用途。
本发明从益生菌Escherichia coli Nissle 1917中分离细菌外膜囊泡，并采用该囊泡包被二氧化锰纳米酶制备成纳米益生菌体，该纳米益生菌体易于富集在炎性肠道，能有效清除炎性肠道过表达的活性氧(ROS)，并竞争性抑制有害微生物群的黏附，调节肠道微生物群的相对丰度。本发明制备的纳米益生菌体可显著抑制小鼠肠道炎症，为IBD和其他胃肠道疾病提供有效的治疗途径。
更具体的，本发明的目的通过下述技术方案实现：
基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其为以工程化益生菌外膜囊泡为载体，内部荷载纳米酶的纳米益生菌体。所述工程化益生菌外膜囊泡为工程化益生菌所分泌的细菌外膜囊泡，所述的工程化益生菌选自E.coli-BL21、Escherichia coli Nissle1917(简称E.coli-1917)、E.coli-K12、E.coli-MG1655、E.coli-TOP10、奥奈达希瓦氏菌MR-1、减毒沙门氏菌VNP20009、蛭弧菌中的一种或多种。所述的被荷载于囊泡内部的纳米酶为可以清除ROS的功能性ROS清除酶，选自Pt、Ag、Cr、MnO2、FeCl3、CuO、Cr2O3、MnO2、Fe2O3、CoO、NiO、Cu2O、ZnO中的一种或多种。
所述纳米益生菌体的制备方法，包括如下步骤：
本发明采用超滤浓缩法和超速离心法从工程化益生菌培养液中分离OMVs；含有油酸的高锰酸钾乳液经过搅拌、离心、洗涤和真空冷冻干燥的步骤得到二氧化锰(MnO2)纳米花；选用脂质体挤出仪配合适当孔径的聚碳酸酯膜为挤出装置，将OMVs与MnO2混悬液挤出混合，将挤出液在4℃，6000g条件下离心20min，弃去上清液，收集底部沉淀即得所制备的纳米益生菌体。
所述制备方法，其中：
所述工程化益生菌优选Escherichia coli Nissle 1917。
所述OMVs与MnO2混悬液来回挤出10次。
本发明的纳米益生菌体的构建具体步骤参见具体实施方式中的实施例1。本发明以小鼠结肠癌细胞CT26为实验对象，结果表明在体外该纳米益生菌体能快速有效的消耗过氧化氢；此外该纳米益生菌体能够被小鼠结肠癌细胞摄取，缓解细胞内较高的氧化应激；然后本发明以雌性C57BL/6J小鼠(18-22g)为实验对象，建立IBD小鼠模型，结果表明，纳米益生菌体能有效富集在炎性肠道部位。同时纳米益生菌体治疗组小鼠疾病指数得到显著改善，显著提高小鼠的生存率，并且能够快速使体重恢复至正常水平；此外，纳米益生菌体与抗炎药二甲双胍联用后还可以重塑促炎微环境，提高肠道菌群的丰富性和多样性，比市售炎症性肠病药物具有更好的疗效。体内外安全性评价表明，该纳米粒无明显的毒副作用。本发明为IBD和其他胃肠道疾病提供一种全新的策略。
本发明还提供所述纳米益生菌体的如下应用：
所述纳米益生菌体在药物传递系统中的应用。
所述纳米益生菌体在治疗肠道性疾病药物中的应用。
所述纳米益生菌体在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
所述纳米益生菌体在缓解氧化应激微环境中的应用。
与现有技术相比，本发明的纳米益生菌体具有以下优点：
1)益生菌Escherichia coli Nissle 1917衍生的OMVs包裹了具有ROS清除能力的二氧化锰(MnO2)纳米酶，可以有效延长肠道滞留时间，缓解炎性部位的氧化应激。
2)抗炎二甲双胍与纳米益生菌体相结合，可以重塑促炎微环境，增加肠道微生物群的丰富度和多样性。
3)联合治疗比市售IBD药物具有更好的治疗效果。重要的是，在这种治疗中没有发现明显的全身毒性。
附图说明
图1是OMVs、MnO2和纳米益生菌体的表征。a.OMVs、MnO2和纳米益生菌的颗粒大小和Zeta电位；b.OMVs、MnO2和纳米益生菌体的透射电子显微镜图像；
图2是评价纳米益生菌的体外有效性和安全性；a.培养48h后，OMVs、MnO2和纳米益生菌体对细胞内过氧化氢的清除作用；b.培养48h后，OMVs、MnO2和纳米益生菌体对CT26细胞的体外细胞毒作用；c-d.在激光共聚焦显微镜下c.0.5h和d.2h CT26细胞摄取OMVs和Escherichia coli Nissle 1917的情况；
图3是口服不同制剂18小时后益生菌衍生的OMVs，在结肠炎或健康小鼠体内的a.荧光图像；b.生物分布强度；
图4是纳米益生菌体治疗显著减少了发炎结肠中的ROS；
图5是纳米益生菌体减轻了小鼠结肠炎的症状；a.每日体重；b.各组生存率；c.结肠长度；
图6是联合治疗组不仅可以减轻小鼠结肠炎的症状，还可以重塑促炎微环境；a.治疗模式图；给C57BL/6小鼠灌胃水或含3％DSS的水；7天后，然后分别灌胃PBS、Met、纳米益生菌体或联合用药；b.每日体重；c.各组存活率；d.动物最终终点的结肠长度图像；e-h.结肠组织中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的浓度；i.结肠组织HE染色
图7是肠道微生物群的16S核糖体RNA测序分析；a.肠道微生物群相对丰富；b.不同组小鼠肠道菌群的操作分类单位水平的稀疏曲线；c.主成分分析；d.坐标分析；e.非计量多维标度，说明肠道微生物群β多样性；f-k.结肠组织中6种短链脂肪酸的含量；
图8是联合用药与市售药物对结肠炎小鼠体内疗效的比较；a.给药方案示意图；给C57BL/6小鼠灌胃加水或含水3％DSS；7天后，然后分别给予PBS、联合用药或商品药灌胃；b.每日体重；c.各组存活率；d.动物最终终点的结肠长度图像；e.动物结肠长度的定量分析；
图9是不同组小鼠的肝肾参数；丙氨酸氨基转移酶(ALT；U/L)、天冬氨酸氨基转移酶(AST；U/L)、尿素氮(UREA；mM)、肌酐(CREA；M)。
具体实施方式
通过以下具体实例，对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但并不表示实施例对本发明的限制。
实施例1：纳米益生菌体的制备：
1.OMVs的制备
益生菌Escherichia coli Nissle 1917(由沈阳药科大学提供)接种于LB培养基，于37℃、180r/min摇床培养，菌体OD值达到1.0后收集菌液。采用超滤浓缩法提取OMVs，取达到培养终点的细菌培养液于离心管中，在4℃，4000g的条件下离心20min，上清液经0.45μm膜过滤。滤液用100kDa超滤浓缩管浓缩。浓缩液在4℃，200,000×g超速离心2h，然后在磷酸缓冲盐水(PBS)中重悬，用PBS洗涤两次，通过0.45μm膜过滤，即得OMVs，-20℃分装冻存。透射电镜和动态光散射粒度仪进行观察以及粒径，电位测定。
2.MnO2的制备
将250mg高锰酸钾加入125mL水中，搅拌30min得到溶液。然后加入2.5mL油酸，继续搅拌形成稳定的乳液。乳液在室温下进一步搅拌24h，最后出现了棕黑块，即合成了MnO2纳米花。随后通过3000g，10min离心，用酒精洗涤三次以去除剩余的反应物，最后通过真空冷冻干燥得到了干燥的MnO2纳米花。透射电镜和动态光散射粒度仪进行观察以及粒径，电位测定。
3.纳米益生菌体的制备
选用脂质体挤出仪配合适当孔径的聚碳酸酯膜为挤出装置，将OMVs与MnO2按照1mg/mL的OMVs混悬液中加入10μL 1mol/L的MnO2的配比混合，混合液来回挤出10次，将挤出液在4℃，6000g条件下离心20min，弃去上清液，收集底部沉淀即得所制备的纳米益生菌体。将其重悬于PBS中，4℃备用。透射电镜和动态光散射粒度仪进行观察以及粒径，电位测定。
由附图1可知，动态光散射法测得纳米益生菌的流体动力学直径为297.2±3.7nm，高于OMVs(182.1±4.0nm)或MnO2(195.3±2.8nm)。同时，Zeta电位从MnO2核心的-21.2±0.7mV改变为纳米益生菌的-19.7±0.8mV。此外，透射电子显微镜图像显示，单一分散的二氧化锰具有花状的形态，而纳米益生菌体具有球状和核壳状的纳米结构。由动态光散射法和透射电子显微镜的结果可知，益生菌衍生的OMVs成功地包裹了MnO2。
实施例2：评价纳米益生菌体的体外有效性和安全性
CT26细胞(由沈阳药科大学提供)培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素/链霉素的RPMI1640液中。
2.1纳米益生菌体的细胞内酶活力检测
通过酶联免疫吸附试验(ELASA)评价纳米益生菌体对小鼠结肠癌细胞CT26的ROS清除能力。
2.2细胞毒性检测
将细胞以每孔7,500个细胞播种在96孔板中并培养过夜。将细胞与裸露的OMVs(50ng蛋白/mL)、MnO2(100ng/mL)或纳米益生菌培养48小时。采用MTT实验检测纳米益生菌体对小鼠结肠癌细胞CT26的杀伤作用，评价其对CT26细胞的毒性。
由附图2a可知，纳米益生菌能够显著清除细胞内的ROS，清除能力与MnO2相当，说明MnO2可以赋予纳米益生菌清除ROS的能力。同时，由图2b可知，纳米益生菌体对细胞没有明显的生长抑制作用，表明益生菌OMVs整合的纳米益生菌体具有较好的生物安全性，具有临床转化的潜在价值。
2.3细胞摄取实验
用共聚焦培养皿培养CT26细胞，浓度为1×105个/mL，分别在不同时间点(0.5h和2h)分别与EcN(1×106cfu/mL)和EcN来源的OMVs孵育，进行时间依赖性研究。然后，用冷PBS冲洗细胞，固定在4％多聚甲醛溶液中。用激光共聚焦显微镜观察细胞形态。采用激光共聚焦显微镜观察CT26细胞对纳米益生菌体的摄取效率。
附图2c，2d结果显示，激光共聚焦扫描显微镜图像显示含有绿色荧光蛋白的益生菌OMVs和CT26细胞共定位。这表明益生菌来源的OMVs可以有效地内吞，并以时间依赖的增加模式清除细胞内的ROS。
实施例3：纳米益生菌体在IBD小鼠结肠的蓄积考察
选用雌性C57BL/6J小鼠(由辽宁长生生物科技有限公司提供)，鼠齢为6-8周左右，体重18-22g，12h昼夜交替，适应性生长7天，称量小鼠体重，随后给与含3％的葡聚糖硫酸钠(DSS，36-50kDa，购自上海麦克莱恩生化科技有限公司)饮用水一周，待小鼠出现稀便，便血，体重下降等症状时说明成功诱导为结肠炎小鼠。实验小鼠被随机分成4组(分别标记为A，B，C，D组)，每组10只，称量小鼠体重，4组小鼠分别做以下处理：A组给予洁净自来水饲养一周后口服灌胃游离的DiR溶液0.5mL；B组给予洁净自来水饲养一周后口服灌胃DiR标记的OMVs溶液0.5mL；C组给予3％的DSS饮用水一周诱导的结肠炎后口服灌胃游离的DiR溶液0.5mL；D组给予3％的DSS饮用水一周诱导的结肠炎后口服灌胃DiR标记的OMVs溶液0.5mL(DiR的含量均为1mg/kg)。口服灌胃18h后脱颈椎处死小鼠，剖取各组小鼠的结肠组织，通过小动物活体成像系统拍照，获取荧光图片和荧光强度，考察纳米益生菌体在IBD小鼠结肠的蓄积能力。
如附图3所示，给药18小时后，发现Dir-标记的益生菌衍生的OMVs可以有效地在结肠黏膜上积累。相反，在正常小鼠的结肠组织中没有观察到Dir-标记的OMVs。
实施例4：纳米益生菌体对IBD小鼠的治疗效果
与实施例3建立小鼠饮水急性结肠炎模型一致，实验小鼠被随机分为5组(n＝10)。(1)对照组，(2)DSS诱导组，(3)OMVs组，(4)MnO2组，(5)纳米益生菌组(相当于5.0mg/kgOMVS剂量)。小鼠被麻醉，并在终点安乐死。然后采集结肠标本。观察小鼠的体重，生存率及结肠长度，评价纳米益生菌体对小鼠结肠炎的治疗效果。将剖取的结肠组织经行冰冻切片免疫荧光实验，再荧光显微镜下观察荧光情况，评价纳米益生菌体对ROS含量的影响情况。将剖取的结肠组织用生理盐水清洗后，精密称量后作匀浆处理，采用Elisa试剂盒检测各组小鼠结肠组织中的各种细胞因子的水平，评价纳米益生菌体对其含量的影响情况。
4.1纳米益生菌体对小鼠结肠炎的治疗效果评价
如附图5所示，用纳米益生菌体处理的DSS诱导的小鼠在纳米益生菌的治疗下体重保持稳定，并显示出较长的存活期。而用其他方法治疗的结肠炎小鼠体重迅速降低，并在15天内全部死亡。此外，纳米益生菌的结肠炎小鼠的结肠长度明显长于其他治疗组的结肠长度，更接近健康小鼠的结肠长度。
4.2纳米益生菌体对IBD小鼠结肠组织ROS含量的影响
如附图4所示，结果表明，纳米益生菌体治疗显著降低了炎症结肠中的ROS含量。
4.3纳米益生菌体对IBD小鼠结肠组织细胞因子含量的影响
纳米益生菌体处理后并不能使IBD小鼠结肠组织细胞因子(IL-1β，IL-6，IL-10，TNF-α和TGF-β1)恢复至健康肠道组织水平。
实施例5：纳米益生菌体联合二甲双胍协同治疗既减少了肠道促炎细胞因子的产生又可以增加纳米益生菌的体内疗效
与实施例3建立小鼠饮水急性结肠炎模型一致，实验小鼠被随机分为5组(n＝10)。(1)对照组，(2)DSS诱导组，(3)二甲双胍组，(4)纳米益生菌组，(5)联合组。从第7天到第12天记录小鼠体重及生存率，12天后安乐死小鼠观察结肠长度变化，并对结肠进行HE染色，评价协同治疗对小鼠结肠炎的治疗效果。将剖取的结肠组织用生理盐水清洗后，精密称量后作匀浆处理，采用Elisa试剂盒检测各组小鼠结肠组织中的各种细胞因子的水平，评价协同治疗对其含量的影响情况。
如附图6所示，与单一纳米益生菌治疗组相比，联合治疗组小鼠的体重明显恢复，结肠损伤长度和促炎细胞因子的表达可以恢复到正常范围，并且联合治疗组大鼠结肠组织恢复正常，结肠上皮未见病理损伤。
实施例6：纳米益生菌体联合二甲双胍协同治疗的安全性实验
与实施例5分组一致，将实验动物摘眼球取血，在4000rpm离心条件下离心15min得到血清样品，检测血清中血清肌酐(CREA)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素氮(UREA)和天冬氨酸转氨酶(AST)的含量，作为评价肝肾功能的指标。
如附图9结果显示，血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、尿素氮(UREA)和肌酐(CREA)的参数没有明显变化，治疗后没有明显的全身毒性。
实施例7：纳米益生菌体联合二甲双胍协同治疗对IBD小鼠肠道微生物群的影响
与实施例5分组一致，剖取各组小鼠结肠处的粪便，采用16S rRNA序列法对样本片段进行筛选，降噪，分析，主要分析样品的Alpha多样性和Beta多样性，以此来评估结肠炎小鼠治疗后肠道微生物群的变化揭示样品的物种构成。
如附图7a-7e结果表明，联合处理显著降低了大肠杆菌-志贺氏菌(感染性病原体)的相对丰度。与DSS诱导的结肠炎小鼠相比，我们还发现联合治疗组显著增加了乳酸菌(可以抑制胃肠道病原体，具有保护胃肠道防御和改善炎症反应作用的益生菌)的相对丰度。此外，联合治疗组显著增加了细菌丰富度。除此之外，通过对不同处理后肠道微生物的相似度进行了比较，发现DSS诱导组和正常组的粪便微生物群组成有明显差异，而联合治疗组各组分与正常组接近。提示联合治疗可重塑结肠炎小鼠肠道菌群失调。
实施例8：纳米益生菌体联合二甲双胍协同治疗对IBD小鼠肠道短链脂肪酸含量的影响
与实施例5分组一致，取出各组小鼠粪便，精确称量粪便0.2g，加入2mL乙醇溶液，涡旋振荡5min，在4℃下5000rpm离心10min，取出样品上清液。再用0.22μm水系滤膜过滤后采用GC-MS上机测定短链脂肪酸的含量。
如附图7f-7k结果表明，肠道微生物区系产生的短链脂肪酸可减少促炎细胞因子的产生，并将IBD的风险降至最低。不同处理后小鼠粪便中六种单链脂肪酸的水平。DSS诱导组短链脂肪酸含量明显减少，联合治疗的结肠炎小鼠短链脂肪酸水平明显增加，与正常小鼠相似。这些结果表明，联合用药可以重塑肠道微生物区系，提高短链脂肪酸的产量，从而极大地促进其抗炎作用。
实施例9：协同治疗与市售抗IBD药物的药效对比
9.1协同治疗与市售抗IBD药物对IBD小鼠的治疗作用对比
与实施例5基本一致，不同的是，将实验小鼠被随机分为6组(n＝10)：(1)对照组，(2)DSS诱导组，(3)地塞米松组，(4)甲基强的松龙组，(5)5-氨基水杨酸组，(6)联合用药组。比较了联合治疗以及目前临床上使用的抗IBD药物，包括5-氨基水杨酸(5-ASA)、甲基强的松龙(MPS)和地塞米松(DEX)的疗效。
如附图8所示，发现与商业药物治疗组相比，二甲双胍和纳米益生菌体的联合治疗组体重和结肠长度完全恢复，最终延长了存活率，显著延缓了结肠炎的进展。
9.2协同治疗与市售抗IBD药物对IBD小鼠的全身毒性对比
与实施例5基本一致，不同的是，将实验小鼠被随机分为6组(n＝10)：(1)对照组，(2)DSS诱导组，(3)地塞米松组，(4)甲基强的松龙组，(5)5-氨基水杨酸组，(6)联合用药组。比较了联合治疗以及目前临床上使用的抗IBD药物，包括5-氨基水杨酸(5-ASA)、甲基强的松龙(MPS)和地塞米松(DEX)的对全身的毒性。
结果发现，二甲双胍和纳米益生菌体的联合治疗具有最小的全身毒性。
综上所述，我们经过实验研究，提供了一种采用源于益生菌Escherichia coliNissle 1917的外膜囊泡包被二氧化锰纳米酶制备的纳米益生菌体，经细胞和动物实验表明，本发明制备的纳米益生菌体可显著抑制小鼠肠道炎症，并具有良好的安全性。因此这种纳米益生菌体可望用于临床IBD和其他胃肠道疾病治疗药物的制备。
Claims (9)
1.一种基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其特征在于，其为以工程化益生菌外膜囊泡为载体，内部荷载纳米酶的纳米益生菌体。
2.根据权利要求1所述的基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统，其特征在于，所述工程化益生菌外膜囊泡为工程化益生菌所分泌的细菌外膜囊泡，所述的工程化益生菌选自E.coli-BL21、E.coli-1917、E.coli-K12、E.coli-MG1655、E.coli-TOP10、奥奈达希瓦氏菌MR-1、减毒沙门氏菌VNP20009、蛭弧菌中的一种或多种；所述的被荷载于囊泡内部的纳米酶为可以清除ROS的功能性ROS清除酶，选自Pt、Ag、Cr、MnO2、FeCl3、CuO、Cr2O3、MnO2、Fe2O3、CoO、NiO、Cu2O、ZnO中的一种或多种。
3.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，按以下步骤制备纳米益生菌体：
益生菌接种培养，菌体OD值达到1.0后收集菌液；离心除去菌体后，超滤浓缩法和超速离心制备OMVs，-20℃分装冻存；含有油酸的高锰酸钾乳液经过搅拌、离心、洗涤和真空冷冻干燥的步骤得到二氧化锰纳米花；二氧化锰纳米花固体粉末分散于PBS中，与OMVs的PBS溶液均匀混合，挤出，将挤出液在4℃，6000g条件下离心20min，弃去上清液，收集底部沉淀即得所制备的纳米益生菌体。
4.根据权利要求3所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，所述工程化益生菌为E.coli-1917。
5.根据权利要求3所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的制备方法，其特征在于，所述OMVs与MnO2混悬液来回挤出10次。
6.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的应用，其特征在于，所述纳米益生菌体在药物传递系统中的应用。
7.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的应用，其特征在于，所述纳米益生菌体在治疗肠道性疾病药物中的应用。
8.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的应用，其特征在于，所述纳米益生菌体在制备注射给药、口服给药或局部给药系统中的应用。
9.一种权利要求1或2所述基于工程化益生菌外膜囊泡包被纳米酶递送系统的应用，其特征在于，所述纳米益生菌体在缓解氧化应激微环境中的应用。
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