CN116585449A - 一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和应用。所述系统由益生菌芽孢和多粘菌素类抗生素修饰的金纳米颗粒组成；所述金纳米颗粒负载在益生菌芽孢表面。本发明所述递药系统能够减少多粘菌素类抗生素对肠道造成的功能紊乱，调节肠道菌群；又可以在萌发过程中使生长在表面的金纳米粒子脱落，发挥特异性杀菌的疗效；本发明为口服给药的细菌性肠炎治疗提供了新思路。本发明所述纳米抗菌递药系统制备简单，生产成本低，稳定性强，具有巨大潜在的经济和社会效益。

Description

一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和应用。
背景技术
以沙门氏菌为代表的革兰氏阴性菌感染已成为国际公共卫生的一个重要课题。沙门氏菌是一种食源性的致病菌，是世界卫生组织(WHO)公布了一份列有12种“超级细菌”之一当沙门氏菌在肠道爆发性生长时，其活性成分和特异性代谢产物会通过破坏肠道菌群、引起肠道屏障功能损伤、诱导紊乱的黏膜免疫反应诱导细菌性结肠炎的发生，有可能在慢性肠道炎症过程中诱导结肠炎症向癌的转变，最终导致恶性结肠炎-结直肠癌(CAC)。目前，抗生素疗法是治疗沙门氏菌感染的主要临床手段。然而，长期口服大剂量广谱抗生素会大量杀灭体内正常细菌，从而引起肠道菌群失调，降低机体免疫力，给人体健康带来不可逆转的损伤。因此，在开发精准抗击口服给药制剂的同时，保证肠道菌群的协调对于疾病的治疗具有正向的推动作用。
多粘菌素类抗生素是一种窄谱抗菌药，主要包括多粘菌素B和多粘菌素E。多粘菌素类是一种由多粘芽胞杆菌产生的多肽类抗生素，常用于大肠杆菌、沙门杆菌、志贺杆菌等引起的肠道感染。20世纪40年代，多粘菌素类首次被发现并相继应用于临床实践中。多粘菌素类仅可治疗革兰氏阴性菌的感染，可以靶向并中和细菌外膜上的LPS，增加外膜的通透性和泄漏内容物而杀菌。
基于微生物体系合成的无机纳米材料已成为纳米材料领域的一个重要研究方向，因其具有安全高效、成本低、生物相容性好等优点。通过构建微生物-无机纳米杂化体，具有生物活性的微生物可以作为一种新型的智能药物传递载体。在趋化性等不同刺激信号下到达目标区域，杂交纳米材料可以通过搭便车的方式与微生物一起运送到目标。在过去几十年间，合成简单、安全性高的金纳米材料被广泛用于微生物合成无机纳米材料的研究中。但目前将该体系用于口服制剂的研究较少，这很可能是由于消化系统存在复杂的生物屏障，从而导致药物疗效极低。因此，努力找到克服或规避这些生物屏障的有效途径，实现药物在病理部位的高效积累并提高其治疗效果具有重大意义。
随着新型包封材料和技术的不断发展，新型益生菌疗法将在通过口服途径给药时实现功能更稳定、治疗效率高和副作用最小化。益生菌芽孢是益生菌的休眠生命形式，由于其在胃中具有很强的抗性并且可以在肠道中萌发，芽孢本身可以用于益生菌的传递。芽孢外层包裹在一层厚厚的疏水蛋白外壳，可以帮助益生菌抵抗恶劣的胃肠道条件(pH值、胆盐和消化酶)、有毒化学物质和极端温度。芽孢的这些特性使其能够在口服给药后成安全过胃。芽孢一旦到达肠道就开始萌发，生成新的营养细胞并大量增殖。因此，具有较强抗逆性的芽孢本身可作为载体构建口服纳米递药系统，当益生菌定植后可发挥相应的抗菌及抗炎作用，是一种很有前途的新型口服抗菌载体策略。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统及其制备方法和应用，本发明所述纳米抗菌递药系统可通过口服的给药方式将多黏菌素类递送于肠道中，为口服给药的细菌性肠炎治疗提供了新思路。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统，所述系统由益生菌芽孢和多粘菌素类抗生素修饰的金纳米颗粒组成；所述金纳米颗粒负载在益生菌芽孢表面。
进一步地，所述金纳米颗粒粒径为10-15nm。
本发明第二方面提供以上第一方面所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将处于对数生长期的益生菌以2％-5％的比例接种于产孢培养基中进行培养，收集菌液进行加热以去除未形成芽孢的菌体，进行冷却、离心、沉淀、洗涤、冻干，得芽孢冻干粉；
将芽孢冻干粉与超纯水混匀，加入HAuCl4溶液，进行搅拌、预热，加入多粘菌素类抗生素溶液，混合搅拌，调节溶液pH值，得到白色混悬状的混合物溶液；将所得混合物溶液在30-37℃温度条件下进行加热搅拌，待混合物溶液变为紫红色，停止加热，冷却至室温，即得。
进一步地，所述芽孢冻干粉与超纯水质量体积比为0.1-5mg/mL。
进一步地，混合物溶液中，HAuCl4与多粘菌素类抗生素摩尔浓度比为3-15:1。
本发明第三方面提供以上第一方面所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统、以上第二方面所述方法制备得到的纳米抗菌递药系统在制备治疗细菌性肠炎药物中的应用。
进一步地，所述药物为口服制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明所制备的益生菌芽孢负载金纳米粒子，利用芽孢自身的生理生长特性，在胃内保持稳定性，并能够在肠道微环境中保持活性重新生长成为益生菌定植在肠道，其释放的短链脂肪酸等可以正向调节肠道菌群，重构肠道微生态，减少多粘菌素类对肠道造成的功能紊乱；又可以在萌发过程中使生长在表面的金纳米粒子脱落，发挥靶向杀菌的疗效，本发明为口服给药的细菌性肠炎治疗提供了新思路。
(2)本发明所制备的益生菌芽孢负载金纳米粒子，合成方法简单，包封率高达72.1％，具有良好的生物相容性，其表面生长的金纳米粒子的大小为10-15nm，小尺寸保证了纳米粒优良的抗菌疗效。
(3)本发明所制备的益生菌芽孢负载金纳米粒子，将负载抗生素的纳米制剂和益生菌设计成联合制剂，打破了益生菌和抗生素难以同服的障碍，因其多粘菌素类合成的金纳米粒子特异性靶向革兰氏阴性菌，不会对革兰氏阳性益生菌造成损伤。
(4)本发明所述纳米抗菌递药系统制备简单，生产成本低，稳定性强，具有巨大潜在的经济和社会效益。
附图说明
图1为BCs的TEM图；
图2为BCs@PME-Au的TEM图；
图3为BCs修饰前后生长活性柱形图；
图4为不同制剂基于Caco-2细胞生物安全性柱形图；
图5为各试验小组中小鼠体重变化图；
图6结肠组织研磨计数图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
针对背景技术部分所述问题，本发明第一方面提供一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统，所述系统由益生菌芽孢和多粘菌素类抗生素修饰的金纳米颗粒组成；所述金纳米颗粒负载在益生菌芽孢表面。
作为本发明一优选实施方式，所述金纳米颗粒粒径为10-15nm。
作为本发明一优选实施方式，所述益生菌芽孢包括但不仅限于枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及丁酸梭菌中的一种或几种。
本发明第二方面提供以上第一方面所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将处于对数生长期的益生菌以2％-5％的比例接种于产芽孢培养基中进行培养，收集菌液进行加热以去除未形成芽孢的菌体，进行冷却、离心、沉淀、洗涤、冻干，得芽孢冻干粉；
将芽孢冻干粉与超纯水混匀，加入HAuCl4溶液，进行搅拌、预热，加入多粘菌素类抗生素溶液，混合搅拌，调节溶液pH值，得到白色混悬状的混合物溶液；将所得混合物溶液在30-37℃温度条件下进行加热搅拌，待混合物溶液变为紫红色，停止加热，冷却至室温，即得。
每种益生菌所对相应的产芽孢培养基为现有技术。
作为本发明一优选实施方式，所述芽孢冻干粉与超纯水质量体积比为0.1-5mg/mL。
作为本发明一优选实施方式，混合物溶液中，HAuCl4与多粘菌素类抗生素摩尔浓度比为3-15:1。
作为本发明一优选实施方式，采用NaOH溶液调节溶液pH值至6-7。
本发明第三方面提供以上第一方面所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统、本发明第二方面所述方法制备得到的纳米抗菌递药系统在制备治疗细菌性肠炎药物中的应用。
作为本发明一优选实施方式，所述药物为口服制剂。
作为本发明一优选实施方式，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂中的任意一种。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，包括以下步骤：
(1)通过HAuCl4和多粘菌素E(PME)之间的一锅反应合成PME-Au NPs：首先配制1mM的HAuCl4溶液，取62μL的HAuCl4储备液，加至盛有30mL超纯水的圆底烧瓶中，固定在集热式磁力搅拌器上，启动仪器并预热5min；其次加入1mL的0.0130g/mL的PME溶液，此时HAuCl4和PME的摩尔浓度比为3:1；混合搅拌5min后，加入50μL的NaOH储备液调节pH至6～7，此时溶液从黄色转为澄清透明，该混合物在37℃搅拌反应0.5h；待到溶液变为紫红色，关闭电源以停止加热，冷却至室温。
(2)凝结芽孢杆菌芽孢的提取：将处于对数生长期的凝结芽孢杆菌以3％的比例接种于产孢培养基中，其中产芽孢培养基的配方为：1g蛋白胨、0.3g牛肉膏、0.5g氯化钠、0.5mg MnSO4·H2O、100mL双蒸水。然后，37℃的震荡培养48～72h，之后收集菌液于80℃下加热25～40min以去除未形成芽孢的菌体，冷却，离心、沉淀、洗涤，所得芽孢冻干备用；
(3)通过HAuCl4、多粘菌素E和凝结芽孢杆菌芽孢(BCs)冻干粉之间的一锅反应合成芽孢衍生物(BCs@PME-Au)：取10mg凝结芽孢杆菌芽孢冻干粉，加到盛有30mL超纯水的圆底烧瓶中；配制1mM的HAuCl4溶液，取62μL加入到圆底烧瓶中，将圆底烧瓶中固定在磁力搅拌器上，预热5min；加入1mL 0.0130g/mL的多粘菌素E溶液，此时HAuCl4和多粘菌素E的摩尔浓度比为3：1；混合搅拌5min后，加NaOH溶液调节pH值至6～7，此时溶液从黄色转为白色混悬状混合物溶液，将混合物溶液在37℃搅拌反应0.5h；观察到溶液变为紫红色，停止加热，冷却至室温，即得BCs@PME-Au。
实施例2
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述益生菌为枯草芽孢杆菌，其它均与实施例1相同。
实施例3
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述益生菌为地衣芽孢杆菌，其它均与实施例1相同。
实施例4
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述益生菌为丁酸梭菌，其它均与实施例1相同。
实施例5
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述多粘菌素类抗生素为多粘菌素B，其它均与实施例1相同。
实施例6
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述芽孢冻干粉与超纯水质量体积比为0.1mg/mL，其它均与实施例1相同。
实施例7
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，所述芽孢冻干粉与超纯水质量体积比为5mg/mL，其它均与实施例1相同。
实施例8
一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，与实施例1的区别在于，HAuCl4与多粘菌素E摩尔浓度比为15:1，其它均与实施例1相同。
试验例
1.BCs@PME-Au的形貌表征测定
取本发明实施例1制备得到的BCs@PME-Au，滴加到铜网超薄膜上，干燥后，使用透射电子显微镜对其形貌进行观察，结果如图1和图2所示，BCs和BCs@PME-Au的直径为1-2μm。BCs@PME-Au表面附着有芝麻粒大小的金纳米粒子，其表面生长的金纳米粒子的大小为10-15nm，小尺寸保证了纳米粒优良的抗菌疗效。
2.BCs@PME-Au的包封率测定
采用实施例1所述方法制备BCs@PME-Au时，收集离心得到的上清液，通过高效液相测定上清液中PME峰面积，带入提前建立的标曲，计算出上清中PME的药物含量。经计算BCs@PME-Au的产率为72.1％。
3.BCs修饰前后生长活性的测定
分别称取适量的BCs、实施例1所述方法制备得到的BCs@PME-Au于EP管中，用酶标仪分别测定BCs、BCs@PME-Au在波长600nm处的的吸光度值，然后进行梯度稀释，使每组初始OD600为0.1，设置5个复孔，每组取100μL，混合在100μL的BC液体培养基中，在37℃恒温震荡摇床中培养24小时，测定其OD600用以评估修饰前后BCs的生长活性。
结果如图3所示，看出BCs和BCs@PME-Au之间无显著性差异，说明经PME-Au NPs修饰的益生菌芽孢仍具有活性。
4.BCs@PME-Au体外生物相容性考察
运用CCK-8试剂盒考察不同制剂组的细胞生物相容性。首先，配制不同浓度的PME、BCs、PME-Au NPs和采用实施例1所述方法制备得到的BCs@PME-Au的溶液。然后，将处于对数生长期的Caco-2细胞以6×103/孔的密度接种于96孔板内，在96孔板边缘一周每孔加入200μL的PBS。然后，将96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％ CO2)孵育24h，除去旧的培养基，加入不同浓度的PME、BCs、PME-Au NPs和BCs@PME-Au的含药培养基。每组分别做六个平行复孔。作用24h后，之后每个孔避光加入10μL的CCK-8溶液，现用现配，细胞培养箱中继续培养4h，将每孔中的培养基去除，注意避光操作。然后，在恒温摇床中(100rpm、37℃)进行孵育10min后，使用酶标仪在450nm处测各组的吸光度值，根据：存活率(％)＝(OD实验组/OD对照组)×100％计算各组细胞的存活率。
结果如图4所示，将Caco-2细胞与的PME、BCs共同孵育，随着的浓度不断增加，Caco-2的细胞的增殖率均在90％以上。此外，将Caco-2细胞与PME-Au NPs和BCs@PME-Au的共同孵育，随着的浓度不断增加，Caco-2的细胞的增殖率均在90％以上，证明合成的PME-AuNPs和BCs@PME-Au具有良好的生物安全性。
5.BCs@PME-Au对细菌性肠炎的体内药效研究
本实验以健康Balb/c雌性小鼠(北京斯贝福生物有限公司)为动物模型，探究实施例1制备得到的BCs@PME-Au对细菌性肠炎的治疗作用。模型构建：本研究中采用S.Tm诱导结肠炎小鼠来构建模型。将48只6周龄的雌性Balb/C中饲养在相同标准环境中，正常饲养7天后，随机分为对照组(normal，n＝8)和模型组(S.Tm，n＝40)。模型组先给予2天硫酸链霉素(200mg/kg)，用来提高机体对S.Tm的敏感度。预处理24h后，给小鼠灌服200μL的S.typhimurium SL1344悬液(1×109CFU/mL)。若观察到小鼠精神萎靡，体重骤降，活力明显减弱，初步证明S.Tm诱导的结肠炎小鼠模型建立成功。
构建成功后随机将小鼠分别6组，每组8只，设置健康对照组。分组为：1)正常组(NC组)；2)S.Tm小鼠灌胃生理盐水(S.Tm组)；3)S.Tm诱导的结肠炎小鼠灌胃BCs(BCs组)；4)S.Tm诱导的结肠炎小鼠灌胃PME(PME组)；5)S.Tm诱导的结肠炎小鼠灌胃PME-Au NPs(PME-Au NPs组)；6)S.Tm诱导的结肠炎小鼠灌胃BCs@PME-Au(BCs@PME-Au组)；采用灌胃的方式连续给药(PME：1mg/kg，200μL；BCs：1×109CFUs/mL，200μL)，总共给药5天，每日给药1次。在治疗期间保证小鼠正常生活，密切观察小鼠生活状态，在此期间对小鼠体重监测。给药周期结束后，将小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下收集各组的结肠组织。分别取结肠组织的悬液，在生物安全柜内用沙门氏菌选择性培养基进行滴板计数。
小鼠体重变化如图5所示，体重的变化是直观反映S.Tm诱导的结肠炎程度的指标。1～5天为灌胃给药过程中的体重变化。在治疗过程中，NC组的体重呈缓慢增加的趋势，而S.Tm组的体重呈持续下降的趋势。与S.Tm组相对比，治疗组的小鼠体重下降的情况发生了不同程度的改变。其在BCs@PME-Au组干预之后，S.Tm小鼠体重下降的状况得到最大程度的改善，与NC组仍有一定的差距，但与S.Tm组有显著的差异。
组织研磨计数的结果如图6所示，组织研磨计数是最直观地评估各组制剂治疗的S.Tm诱导的结肠炎的指标。S.Tm组中结肠的S.Tm丰度最高。其中，PME-Au NPs的菌落丰度少于PME。推测是PME-Au NPs表面浓集的PME促使其蓄积于S.Tm表面，比PME具有更强的抗菌作用。与S.Tm组相比，BCs@PME-Au最大程度的降低S.Tm的丰度，表现出对S.Tm最显著的抑制作用，且P<0.001。以上结果表明，所研究的基于益生菌芽孢的口服纳米抗菌递药系统具备良好的抗菌性能，是一种有前景的口服纳米抗菌新策略。
按上述方法，对本发明实施例2-6所得纳米抗菌递药系统进行了实验，均取得了相同或相近似的结果，这里不再一一列举。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统，其特征在于，所述系统由益生菌芽孢和多粘菌素类抗生素修饰的金纳米颗粒组成；所述金纳米颗粒负载在益生菌芽孢表面。
2.根据权利要求1所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统，其特征在于，所述金纳米颗粒粒径为10-15nm。
3.根据权利要求1所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统，其特征在于，所述益生菌芽孢为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及丁酸梭菌中的一种或几种。
4.权利要求1-3任一项所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将处于对数生长期的益生菌以2％-5％的比例接种于产孢培养基中进行培养，收集菌液进行加热以去除未形成芽孢的菌体，进行冷却、离心、沉淀、洗涤、冻干，得芽孢冻干粉；
将芽孢冻干粉与超纯水混匀，加入HAuCl4溶液，进行搅拌、预热，加入多粘菌素类抗生素溶液，混合搅拌，调节溶液pH值，得到白色混悬状的混合物溶液；将所得混合物溶液在30-37℃温度条件下进行加热搅拌，待混合物溶液变为紫红色，停止加热，冷却至室温，即得。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述芽孢冻干粉与超纯水质量体积比为0.1-5mg/mL。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，混合物溶液中，HAuCl4与多粘菌素类抗生素摩尔浓度比为3-15:1。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，采用NaOH溶液调节溶液pH值至6-7。
8.权利要求1-3任一项所述基于益生菌芽孢的纳米抗菌递药系统、权利要求4-7任一项所述方法制备得到的纳米抗菌递药系统在制备治疗细菌性肠炎药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和丸剂中的任意一种。
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