CN107875401A

CN107875401A - 一种光交联抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107875401A
Application number: CN201711347517.8A
Authority: CN
Inventors: 姚琛; 李新松; 范东晓; 杜亚伟; 凌龙兵; 夏青
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2017-12-15
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2037-12-15
Also published as: CN107875401B

Abstract

本发明公开了一种光交联抗菌纳米颗粒，将N端经硫辛酸修饰的阳离子三肽在一定强度的紫外光下照射一段时间后，得到抗菌纳米颗粒；所述抗菌纳米颗粒由相互交联的硫辛酸分子形成的纳米内核以及覆盖在纳米内核表面的阳离子三肽组成；阳离子三肽的序列包含有两个精氨酸和色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸中的任一种。本发明还公开了上述光交联抗菌纳米颗粒的制备方法和应用。本发明光交联抗菌纳米颗粒先制得阳离子三肽，再以硫辛酸修饰阳离子三肽，制得的两亲性短肽在较高浓度下仍无溶血，最后将硫辛酸修饰后的阳离子三肽置于紫外光下照射，得到具有纳米内核以及在纳米内核表面覆盖大量阳离子三肽的抗菌纳米颗粒；本发明的抗菌纳米颗粒具有抗菌谱广、活性高、安全性好、不易产生耐药性的特点，并且其制备工艺简单、成本低，便于推广应用。

Description

一种光交联抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种光交联抗菌纳米颗粒，还涉及上述光交联抗菌纳米颗粒的制备方法和应用，属于生物医用材料技术领域。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是大部分生物抵御病原微生物侵袭过程中的天然防御系统的重要组成部分。传统的抗生素通常针对特定的酶来控制代谢途径(如脱氧核糖核酸的合成，蛋白质和细胞壁的合成)，容易导致细菌的耐药性。而大多数抗菌肽主要是通过影响细胞膜来发挥作用，细菌必须要改变其膜的组成和结构对抗菌肽产生抗药性，这会对菌体本身造成严重损害。因此，抗菌肽独特的抗菌机制使其不易引起细菌的耐药性，可单独使用或与抗生素联合使用来杀死病原体。细菌细胞膜外层富含阴离子磷脂，哺乳动物细胞膜的两性离子脂质比较丰富，这也是抗菌肽可以抗菌而对哺乳类细胞不造成损害的主要原因。

天然抗菌肽的组成序列复杂，制备成本极高，Bactenecin(牛溶菌肽，含有12个氨基酸残基)是自然界中最小的天然阳离子抗菌肽。设计工程化抗菌肽时，常常以天然抗菌肽构效关系为基础，对肽序列的氨基酸进行替换、缩短肽链的长度、将不同序列的抗菌肽进行片段组合形成杂合肽，或将脂肪链引入抗菌肽，或通过抗菌肽骨架环化或分子内侧链环化等方式，得到抗菌谱广、活性高的工程化抗菌肽。

对已知抗菌肽进行长链烷基化/酰化修饰，即对多肽N端或C端修饰疏水烷基链，是制备工程化抗菌脂肽的常用方法之一。Fields等研究了几种两亲性多肽，以单烷基烃链为最小脂化部分，对其N端进行修饰，得到稳定的类似蛋白质的分子结构(Biopolymers,2000,54,531-546)。Lowik等证明，通过单个C18烷基链修饰多肽序列的N端和C端，在其组装脂质体膜时能有效控制其二级结构(Organic&Biomolecular Chemistry,2003,1,1827-1829)。一些研究表明在短肽序列中引入烃链可能是一种有效的诱导和形成稳定的蛋白样二级和三级结构的方法，也可以用于对多肽折叠机制的研究和开发新的生物材料(ChemicalSociety Reviews,2010,39:241-263)。通过将多肽与脂肪酸偶联，可以增强其与细菌膜相互作用时形成二级结构的能力，提高其抗菌性能。脂肽的抗菌活性可以通过肽参数之间复杂敏感的平衡来调节，所述参数包括长度、净电荷、疏水性、二级结构倾向、两亲性、螺旋极性/非极性区段的大小和深度、柔性和抗降解性，并且每种参数对不同多肽的作用都有所不同(Biochemistry,2009,48,313-327)。Tirrell等将三种肽YGAA[KKAAKAA]₂(AKK)、KLFKRHLKWKII(SC₄)和YG[AKAKAAKA]₂(KAK)，与月桂酸偶联并测试其对结构、抗菌活性和真核细胞毒性的影响，修饰后的AKK和SC₄肽相对于未修饰的肽显示出更强的抗菌活性(Bioconjugate Chemistry,2004,15,530-535)。然而，这类具有疏水烷基尾部的工程化抗菌肽往往由于其表面活性剂类似的结构，在较低浓度下溶血率就大于5％，极大地限制了其临床应用的可能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种光交联抗菌纳米颗粒，该抗菌纳米颗粒先制得超短的阳离子多肽序列，再用硫辛酸修饰该阳离子多肽序列，最后将硫辛酸修饰后的阳离子多肽序列置于紫外光下照射，得到具有纳米内核以及在纳米内核表面覆盖大量阳离子多肽序列的抗菌纳米颗粒，该抗菌纳米颗粒在较高浓度下仍无溶血。

本发明还要解决的技术问题是提供上述光交联抗菌纳米颗粒的制备方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述光交联抗菌纳米颗粒在制备抗菌材料或抗菌药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

一种光交联抗菌纳米颗粒，将N端经硫辛酸修饰的阳离子三肽在一定强度的紫外光下照射一段时间后，得到抗菌纳米颗粒；所述抗菌纳米颗粒由相互交联的硫辛酸分子形成的纳米内核以及覆盖在纳米内核表面的阳离子三肽组成。

进一步优选，所述阳离子三肽的序列包含有两个精氨酸和色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸中的任一种。

进一步优选，所述阳离子三肽的序列为WRR、RWR、IRR、RIR、VRR、RVR、ARR、RAR、GRR、RGR、LRR、RLR、ERR或RER中的一种。

进一步优选，所述抗菌纳米颗粒的直径为10～50nm。

上述光交联抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，通过Fmoc固相多肽合成法合成阳离子三肽；

步骤2，将步骤1制得的阳离子三肽采用碳二亚胺法与硫辛酸进行偶联，得到N端由硫辛酸修饰的阳离子三肽；

步骤3，将步骤2制得的N端由硫辛酸修饰的阳离子三肽配成一定浓度的水溶液，于一定强度的紫外光下照射一段时间后，得到抗菌纳米颗粒悬液。

其中，步骤1中，所述阳离子三肽的序列包含有两个精氨酸和色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸中的任一种。

其中，步骤3中，所述N端由硫辛酸修饰的阳离子三肽溶液的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL。

其中，步骤3中，所述紫外光的辐照强度为1～50mW/cm²，照射时间为5～60分钟。

上述光交联抗菌纳米颗粒在制备抗菌材料或抗菌药物中的应用。

其中，所述光交联抗菌纳米颗粒制备的抗菌药物的剂型为喷剂、膏剂或凝胶中的一种。

本发明首先对天然抗菌肽序列的氨基酸进行替换、缩短肽链的长度，得到一种抗菌谱广、活性高的工程化抗菌超短肽，然后再用硫辛酸对该工程化抗菌超短肽进行疏水尾部的改性，从而解决了具有疏水尾部的工程化抗菌短肽的溶血问题，最后将硫辛酸修饰的抗菌超短肽进行紫外光照射，得到具有纳米内核以及纳米内核表面覆盖大量阳离子抗菌超短肽的抗菌纳米颗粒，纳米内核为相互交联的硫辛酸分子。硫辛酸修饰的抗菌超短肽中硫辛酰基环在紫外光作用下环链打开彼此交联形成线性的二硫结构，硫辛酸分子彼此交联形成的纳米内核粒径有大有小，纳米结构有利于抗菌颗粒在细菌细胞膜表面的聚集、作用，并进一步穿透细胞膜，导致细菌细胞内容物泄漏，造成菌体破裂死亡。

相比于现有技术，本发明的技术方案所具有的有益效果为：

本发明光交联抗菌纳米颗粒先制得阳离子三肽，再以硫辛酸修饰阳离子三肽，制得的两亲性短肽(脂溶性与水溶性)在较高浓度下仍无溶血，最后将硫辛酸修饰后的阳离子三肽置于紫外光下照射，得到具有纳米内核以及在纳米内核表面覆盖大量阳离子三肽的抗菌纳米颗粒；本发明的抗菌纳米颗粒具有抗菌谱广、活性高、安全性好、不易产生耐药性的特点，采用以光交联方法制备抗菌纳米颗粒，工艺简单、无污染、成本低，便于推广应用。

附图说明

图1为本发明光交联抗菌纳米颗粒的结构示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的技术方案做进一步说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于此。

如图1所示，本发明光交联抗菌纳米颗粒由相互交联的硫辛酸分子形成的纳米内核以及覆盖在纳米内核表面的阳离子三肽组成。

实施例1

本发明光交联抗菌纳米颗粒先通过9-芴甲氧羰基(Fmoc)固相合成法合成阳离子三肽(WRR)；再采用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联阳离子三肽(WRR)和硫辛酸(lipoic acid)，得到产物Lipo-WRR；配制质量体积百分比浓度为0.256mg/mL的Lipo-WRR水溶液，经紫外光(辐照强度为10mW/cm²)照射40分钟后得到Lipo-WRR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计本发明光交联抗菌纳米颗粒的直径及分布，结果显示，Lipo-WRR纳米颗粒的平均直径为45nm。

溶血实验结果显示，0.256mg/mL Lipo-WRR交联前后溶液的溶血率分别为1.28％、1.43％，均小于5％，判定为不溶血。

以浊度法和平板涂布法评价Lipo-WRR抗菌纳米颗粒对不同菌种的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，结果见表1，以未交联Lipo-WRR(硫辛酸修饰三肽)为对照组。

表1光交联前后Lipo-WRR对不同菌种的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)

由表1可知，相比于未交联的Lipo-WRR，交联后的Lipo-WRR最小抑菌浓度和最小杀菌浓度大大降低；这是由于未交联的Lipo-WRR分子其两亲性结构中疏水部分(硫辛酸)的亲脂性一般，从而其穿透细菌细胞膜的能力较弱；而Lipo-WRR分子经紫外光交联后形成纳米颗粒，其纳米结构有利于颗粒在细菌细胞膜表面的聚集、作用，并进一步穿透细胞膜，导致细菌细胞内容物泄漏，造成菌体破裂死亡。

实施例2

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(RIR)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-RIR；配制质量体积百分比浓度为1mg/mL的Lipo-RIR水溶液，经紫外光(辐照强度为4.5mW/cm²)照射10分钟后得到Lipo-RIR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-RIR纳米颗粒的平均直径为42nm。

选用美罗培南、多西环素、环丙沙星分别对鲍曼不动杆菌进行体外诱导试验。每个药物设置3个处理浓度(1/4、1/2、l、2或4倍最小抑菌浓度中选取)，传代第5～10次后检测最小抑菌浓度变化。选取体外诱导最小抑菌浓度升高大于16倍的处理组，在含l/2倍诱导后药物最小抑菌浓度的MH平板上37℃培养，挑选单菌落于MH肉汤培养，VITEK-2细菌鉴定仪菌种鉴定无误。

将实施例2制得的Lipo-RIR纳米颗粒悬液、多西环素以双倍稀释法检验多重耐药鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度，试验结果显示，Lipo-RIR纳米颗粒悬液对多重耐药鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度2μg/mL，对照组多西环素对该菌种的最小抑菌浓度始终大于512μg/mL。

实施例3

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(VRR)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-VRR；配制质量体积百分比浓度为1mg/mL的Lipo-VRR水溶液，经紫外光(辐照强度为50mW/cm²)照射30分钟后得到Lipo-VRR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-VRR纳米颗粒的平均直径为50nm。

以沙氏培养基增殖白色念珠菌至对数生长期，取200μL 10⁴CFU/mL菌液涂布琼脂板，中心滴加2μL浓度为0.5μg/mL的Lipo-VRR纳米颗粒悬液(新鲜制备的样品、放置一个月的样品)，37℃培养16～18h。用游标卡尺测量两种样品的抑菌圈直径均大于14mm，结果表明，样品对白色念珠菌具有抑菌作用(根据抑菌作用评定标准，抑菌圈直径大于14mm，则样品具有抑菌作用)。

实施例4

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(RAR)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-RAR；配制质量体积百分比浓度为0.512mg/mL的Lipo-RAR水溶液，经紫外光(辐照强度为1mW/cm²)照射5分钟后得到Lipo-RAR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-RAR纳米颗粒的平均直径为28nm。

制备油相成分(十八醇7.5g、单硬脂酸甘油酯3g、白凡士林5g、液态石蜡10.3g)，混合加热熔融，并继续加热至混合液体完全透明；另取十二烷基硫酸钠1g、甘油7.5g加入少量热蒸馏水搅拌溶解，并继续加热至90℃左右保温，此溶液作为水相。将油相溶液缓缓加入水相中，同时沿一个方向不断搅拌，得乳膏基质，冷却至室温后加入Lipo-RAR纳米颗粒悬液(Lipo-RAR终浓度为20μg/mL)，继续搅拌至完全乳化冷凝，制得抗菌纳米膏剂。以上各步骤所加蒸馏水总量为65.39g。

以含苯唑西林和氯化钠的MH肉汤分别增殖培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，取上述抗菌纳米膏剂0.5g与5mL MRSA悬液作用10min后，经平板涂布法结果显示，细菌浓度由2.26*10⁷±0.03*10⁷CFU/mL降至178±3CFU/mL。

实施例5

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(RGR)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-RGR；配制质量体积百分比浓度为0.128mg/mL的Lipo-RGR水溶液，经紫外光(辐照强度为10mW/cm²)照射25分钟后得到Lipo-RGR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-RGR纳米颗粒的平均直径为36nm。

0.6g卡波姆940分散在50mL蒸馏水中，放置12h使其充分溶胀，用自动真空均质机乳化搅拌，缓慢加入10mL1.6％的食用氢氧化钠水溶液，搅拌乳化，调节pH值，得到卡波姆凝胶基质。将10mL浓度为100μg/mL Lipo-RGR纳米颗粒悬液缓慢加入凝胶基质中，随后加入10g甘油、30mL蒸馏水，混合搅拌均匀，即得Lipo-RGR抗菌纳米凝胶。

采用平板涂布法，以不同作用时间下细菌悬浮液中活细菌的浓度的对数值与作用时间关系评价上述Lipo-RGR抗菌纳米凝胶对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的抗菌性能，结果见表2。

表2不同作用时间下Lipo-RGR抗菌纳米凝胶的杀菌率

由表2可知，由本发明光交联抗菌纳米颗粒制得的Lipo-RGR抗菌纳米凝胶对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)能够迅速起效，达到在短时间内即可起到抑制细菌生长的效果。

实施例6

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(LRR)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-LRR；配制质量体积百分比浓度为0.1mg/mL的Lipo-LRR水溶液，经紫外光(辐照强度为3mW/cm²)照射10分钟后得到Lipo-LRR纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-LRR纳米颗粒的平均直径为10nm。

以含苯唑西林和氯化钠的MH肉汤分别增殖培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，将Lipo-LRR纳米颗粒悬液、红霉素以双倍稀释法检验最小抑菌浓度，试验结果显示，Lipo-LRR纳米颗粒悬液对MRSA的最小抑菌浓度为2μg/mL；对照组红霉素对该MRSA菌种的最小抑菌浓度为32μg/mL。

实施例7

通过Fmoc固相合成法合成阳离子三肽(RER)，采用EDC、NHS偶联阳离子三肽和硫辛酸得到产物Lipo-RER；配制质量体积百分比浓度为0.512mg/mL的Lipo-RER水溶液，经紫外光(辐照强度为15mW/cm²)照射60分钟后得到Lipo-RER纳米颗粒悬液。

经透射电子显微镜观察并统计纳米颗粒直径及分布，结果显示，Lipo-RER纳米颗粒的平均直径为44nm。

以含苯唑西林和氯化钠的MH肉汤增殖培养耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)，将Lipo-RER纳米颗粒悬液以双倍稀释法检验最小抑菌浓度，试验结果显示，Lipo-RER纳米颗粒悬液对MRSE的最小抑菌浓度为8μg/mL。

序列表

<110> 东南大学

<120> 一种光交联抗菌纳米颗粒及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Trp Arg Arg

1

<210> 2

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Trp Arg

1

<210> 3

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Arg Arg

1

<210> 4

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Ile Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Val Arg Arg

1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Arg Val Arg

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Arg Ala Arg

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Gly Arg Arg

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Arg Gly Arg

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Arg Leu Arg

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Glu Arg Arg

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Arg Glu Arg

1

Claims

1.一种光交联抗菌纳米颗粒，其特征在于：将N端经硫辛酸修饰的阳离子三肽在一定强度的紫外光下照射一段时间后，得到抗菌纳米颗粒；所述抗菌纳米颗粒由相互交联的硫辛酸分子形成的纳米内核以及覆盖在纳米内核表面的阳离子三肽组成。

2.根据权利要求1所述的光交联抗菌纳米颗粒，其特征在于：所述阳离子三肽的序列包含有两个精氨酸和色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸中的任一种。

3.根据权利要求2所述的光交联抗菌纳米颗粒，其特征在于：所述阳离子三肽的序列为WRR、RWR、IRR、RIR、VRR、RVR、ARR、RAR、GRR、RGR、LRR、RLR、ERR或RER中的一种。

4.根据权利要求1所述的光交联抗菌纳米颗粒，其特征在于：所述抗菌纳米颗粒的直径为10～50nm。

5.一种权利要求1～4任一所述的光交联抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1，通过Fmoc固相多肽合成法合成阳离子三肽；

6.根据权利要求5所述的光交联抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤1中，所述阳离子三肽的序列包含有两个精氨酸和色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸、谷氨酸中的任一种。

7.根据权利要求5所述的光交联抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述N端由硫辛酸修饰的阳离子三肽溶液的浓度为0.1mg/mL～1mg/mL。

8.根据权利要求5所述的光交联抗菌纳米颗粒的制备方法，其特征在于：步骤3中，所述紫外光的辐照强度为1～50mW/cm²，照射时间为5～60分钟。

9.权利要求1～4任一所述的光交联抗菌纳米颗粒在制备抗菌材料或抗菌药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的光交联抗菌纳米颗粒在制备抗菌材料或抗菌药物中的应用，其特征在于：所述光交联抗菌纳米颗粒制备的抗菌药物的剂型为喷剂、膏剂或凝胶。