CN115581773B - 一种聚乙二醇化短肽增容剂及其在制备抗菌制剂中的应用 - Google Patents
一种聚乙二醇化短肽增容剂及其在制备抗菌制剂中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种聚乙二醇化短肽增容剂，由硫辛酸修饰的短肽和聚乙二醇修饰的硫辛酸组成，应用时，先将抗菌肽通过静电作用与硫辛酸修饰的短肽复合，再将硫辛酸修饰的短肽与聚乙二醇修饰的硫辛酸在紫外光照射下形成S‑S共价键。本发明还公开了上述增容剂在制备抗菌制剂中的应用，基于本发明增容剂的抗菌制剂的制备方法为：先采用碳二亚胺法偶联短肽和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽；再采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；接着将制得的硫辛酸修饰的短肽加入水中，配制成硫辛酸‑短肽水溶液，将抗菌肽加入到硫辛酸‑短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸‑短肽‑抗菌肽混合液；最后将制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇‑硫辛酸水溶液，将聚乙二醇‑硫辛酸水溶液与混合液充分混合，在紫外光照射后得到抗菌制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇化短肽增容剂，还涉及上述增容剂在制备抗菌制剂中的应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是生物体先天免疫系统的内在组成部分，与传统抗生素不同，不容易产生细菌耐药性。天然抗菌肽具有独特的膜活性抗菌机制，能够选择性地杀死细菌，并对宿主的毒性降至最低。AMPs的抗菌机制为：由于细菌细胞膜上富含负电荷，而哺乳动物细胞膜主要由零净电荷脂质组成，因此阳离子AMPs可通过静电吸附有效地靶向带负电荷的细菌膜，其疏水域插入细胞膜，破坏膜的完整性，导致细菌死亡。
抗菌肽是应用潜力很大的生物活性物质，但部分抗菌肽水溶性差，修饰较困难，半衰期极短，在修饰处理后数分钟内便会析出，还可能被蛋白酶降解。而今，通过将抗菌肽与聚乙二醇(PEG)偶联可以解决这一问题。PEG是平均分子量约在200到6000的乙二醇高聚物的总称，分子或长或短、呈直线型或分叉状。聚乙二醇化不仅可以提高交联物整体的水溶性，还增加了肽的尺寸大小。一方面，较大的PEG会阻碍或完全阻止小肽的肾小球过滤，从而减弱药物的肾消除率，延长药物在血浆中的半衰期，增加药物的生物利用率；另一方面，球型的聚乙二醇结构对肽起到一种保护罩的作用，免受蛋白酶的降解，并通过降低对树突状细胞的接收来减少外来肽的免疫原性。PEG本身既无免疫原性也无毒性。聚乙二醇化能够延长肽的循环半衰期，有时可达100倍之多，由此便可采用较低的剂量或减少一般的修饰处理。聚乙二醇化借此改善了肽生物活性物质在体内的药代动力学和药效学性质。虽然将抗菌肽与聚乙二醇(PEG)偶联能够解决抗菌肽水溶性差、生物相容性差以及蛋白酶稳定性的问题，但是现有方法得到的抗菌肽与聚乙二醇(PEG)复合菌剂会抑制抗菌肽的抗菌效果。
发明内容
发明目的：本发明目的旨在提供一种既能够提高抗菌肽生物相容性和蛋白酶稳定性，又不会抑制抗菌肽抗菌活性的增容剂；本发明另一目的旨在提供上述增容剂在制备抗菌制剂中的应用。
技术方案：本发明所述的聚乙二醇化短肽增容剂，由硫辛酸修饰的短肽和聚乙二醇修饰的硫辛酸组成，应用时，先将抗菌肽通过静电作用与硫辛酸修饰的短肽复合，再将硫辛酸修饰的短肽与聚乙二醇修饰的硫辛酸在紫外光照射下形成S-S共价键。
硫辛酸修饰的短肽与聚乙二醇修饰的硫辛酸经紫外光交联而成，硫辛酸双硫五元环结构在紫外光照射下打开，通过共价键连接，结构稳定。
其中，所述短肽为阴离子型短肽分子；包括三肽分子或四肽分子。
其中，所述聚乙二醇的平均分子量为500～5000。
上述聚乙二醇化短肽增容剂在制备抗菌制剂中的应用。
其中，所述抗菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用碳二亚胺法偶联短肽和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，将抗菌肽加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；因结构相似性，阴离子短肽与阳离子抗菌肽具有良好的相容性，它们之间的良好相容性使聚乙二醇化短肽比单一的聚乙二醇链更容易与阳离子抗菌肽结合；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，在紫外光照射后得到抗菌制剂。
其中，步骤(1)中，短肽和硫辛酸的质量比为2:1～1:5。
其中，步骤(2)中，聚乙二醇和硫辛酸的质量比为5:1～2:1。
其中，步骤(3)中，所述硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的质量浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；混合液中，硫辛酸-短肽-抗菌肽的质量浓度为0.15mg/mL～1.5mg/mL。
其中，步骤(4)中，所述聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.05mg/mL～0.5mg/mL；
其中，步骤(4)中，硫辛酸-短肽-抗菌肽与聚乙二醇-硫辛酸的混合摩尔比为1:9～9:1。
其中，步骤(4)中，紫外光辐照强度为1～50mW/cm2，照射时间为5～30分钟。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)增容剂中聚乙二醇链段及阴离子型短肽能大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血率以及对正常细胞的毒性，具有更好的生物相容性，从而能够提高制得的抗菌制剂的使用剂量，提高抗菌效果；(2)增容剂中硫辛酸修饰的短肽和聚乙二醇修饰的硫辛酸通过紫外光照即可获得稳定的共价结构，不需要额外加入化学试剂去反应交联；(3)基于本发明增容剂得到的抗菌制剂进入生物体后，阴离子型短肽与抗菌肽是采用静电吸附作用结合，易于分离，且无生物毒性；并且聚乙二醇化短肽能够有效减缓抗菌肽被肾脏清除过程，提高抗菌肽的生物利用率；最后，聚乙二醇链段能有效调节抗菌肽的水溶性，同时基于空间屏障减少抗菌肽的酶解，避免被免疫系统的细胞识别，从而提高抗菌肽的蛋白酶稳定性。
具体实施方式
实施例1
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过9-芴甲氧羰基Fmoc固相合成法合成短肽DGD(按照国际统一命名规则：短肽的氨基端在最左边，羧基端在最右边，按照从左到右的顺序，使用氨基酸英文缩写的第一个字母代表一个氨基酸，例如D表示L-天冬氨酸(Aspartic acid)、G表示L-甘氨酸(Glycine)，DGD表示天冬氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，实施例2～6中短肽的命名规则均与实施例1相同)；再采用碳二亚胺法偶联短肽DGD和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽DGD；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇500和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽DGD加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.05mg/mL；将抗菌肽Bactenecin加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液中，硫辛酸-短肽-抗菌肽的浓度为0.15mg/mL～1.5mg/mL；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.05mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为9:1，在辐照强度为1mW/cm2的紫外光下照射5min后得到抗菌制剂。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表1，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表1，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表1抗菌肽Bactenecin添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表1可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bactenecin，实施例1制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。这是由于聚乙二醇链段及阴离子型短肽能提高抗菌肽的生物相容性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表1可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bactenecin，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Bactenecin对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。这是由于聚乙二醇的加入不仅改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例2
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过Fmoc固相合成法合成短肽DLLD；再采用碳二亚胺法偶联短肽DLLD和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽DLLD；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇1000和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽DLLD加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.05mg/mL；将抗菌肽Protonectin加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.5mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为1:9，在辐照强度为50mW/cm2的紫外光下照射30min后得到抗菌制剂。
通过双倍稀释法，检验实施例2制得的抗菌制剂的最小抑菌浓度。以Luria-Bertani肉汤培养基增殖培养大肠杆菌，以胰蛋白胨大豆肉汤培养基增殖培养金黄色葡萄球菌，以沙氏葡萄糖液体培养基增殖培养白色念珠菌。结果显示，实施例2制得的抗菌制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2μg/mL，对白色念珠菌的最小抑菌浓度为1μg/mL。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表2，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表2，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表2抗菌肽Protonectin添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表2可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Protonectin，实施例2制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。聚乙二醇链段及阴离子型短肽能提高抗菌肽的生物相容性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表2可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Protonectin，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Protonectin对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。聚乙二醇的加入不仅改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例3
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过Boc固相合成法合成短肽EEA；再采用碳二亚胺法偶联短肽EEA和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽EEA；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇2000和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽EEA加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.1mg/mL；将抗菌肽Drosomysin加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.1mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为5:1，在辐照强度为10mW/cm2的紫外光下照射10min后得到抗菌制剂。
通过平板涂布法，评价实施例3制得的抗菌制剂的抗菌性能。结果显示，制得的抗菌制剂与细菌作用20min后，大肠杆菌浓度由3*107±0.05*107CFU/mL降至1.26*102±0.02*102CFU/mL，金黄色葡萄球菌浓度由5.6*107±0.07*107CFU/mL降至1.5*102±0.03*102CFU/mL，白色念珠菌浓度由3.1*106±0.08*106CFU/mL降至2.6*102±0.01*102CFU/mL。本发明抗菌制剂与细菌接触时，抗菌肽疏水域插入细菌膜，破坏细胞膜的通透性/完整性，导致菌体破裂死亡，从而达到抗菌效果。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表3，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表3，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表3抗菌肽Drosomysin添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表3可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Drosomysin，实施例3制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。这是因为聚乙二醇链段及阴离子型短肽可以提高抗菌肽的生物相容性，从而降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表3可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Drosomysin，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Drosomysin对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。这是由于聚乙二醇的加入不仅改善了抗菌肽的水溶性，而且大大减小了其对正常细胞的毒性作用。
实施例4
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过9-芴甲氧羰基Fmoc固相合成法合成短肽LLEE；再采用碳二亚胺法偶联短肽LLEE和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LLEE；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇3000和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽LLEE加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.15mg/mL；将抗菌肽Bac8c加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；浓度为0.15mg/mL；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.15mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为1:5，在辐照强度为20mW/cm2的紫外光下照射15min后得到抗菌制剂。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表4，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表4，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表4抗菌肽Bac8c添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表4可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bac8c，实施例4制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。这是由于聚乙二醇链段及阴离子型短肽能提高了抗菌肽的生物相容性，从而降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表4可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bac8c，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Bac8c对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。这是由于聚乙二醇的加入改善了抗菌肽的水溶性，而且大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例5
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过Boc固相合成法合成短肽DDI；再采用碳二亚胺法偶联短肽DDI和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽DDI；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇4000和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽DDI加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.2mg/mL；将抗菌肽Cecropin加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；浓度为0.2mg/mL；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.2mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为3:1，在辐照强度为30mW/cm2的紫外光下照射20min后得到抗菌制剂。
通过双倍稀释法，检验实施例5制得的抗菌制剂对多重耐药菌的最小抑菌浓度。以胰蛋白胨大豆肉汤培养基增殖培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)。结果显示，实施例5制得的抗菌制剂对MRSA的最小抑菌浓度为2μg/mL，对MRSE的最小抑菌浓度为4μg/mL。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表5，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表5，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表5抗菌肽Cecropin添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表5可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Cecropin，实施例5制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。这是因为聚乙二醇链段及阴离子型短肽能提高抗菌肽的生物相容性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表5可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Cecropin，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Cecropin对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。这是因为聚乙二醇的加入不仅改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例6
本发明增容剂在制备抗菌制剂中的应用，具体为：
(1)通过Fmoc固相合成法合成短肽EVEV；再采用碳二亚胺法偶联短肽EVEV和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽EVEV；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇5000和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽EVEV加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.3mg/mL；将抗菌肽Melittinc加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；浓度为0.3mg/mL；
(4)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.3mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤(3)的混合液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽-抗菌肽的摩尔比为1：3，在辐照强度为40mW/cm2的紫外光下照射25min后得到抗菌制剂。
通过平板涂布法，评价实施例6制得的抗菌制剂对多重耐药菌的抗菌性能。结果显示，实施例6制得的抗菌制剂与MRSA作用20min后，细菌浓度由6.24*107±0.03*107CFU/mL降至2.9*102±0.01*102CFU/mL，与MRSE作用20min后，细菌浓度由7.51*107±0.05*107CFU/mL降至1.25*102±0.04*102CFU/mL。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表6，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表6，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表6抗菌肽Melittinc添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表6可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Melittinc，实施例6制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于5％，判定为不溶血。这是由于聚乙二醇链段及阴离子型短肽降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用，提高了抗菌肽的生物相容性。
由表6可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Melittinc，聚乙二醇化短肽增容修饰后的抗菌肽Melittinc对正常纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。这是由于聚乙二醇的加入改善了抗菌肽的水溶性，减小了对正常细胞的毒性作用，同样提高了抗菌肽的生物相容性。
实施例7
将聚乙二醇修饰的硫辛酸与硫辛酸修饰的短肽经紫外光交联后再与抗菌肽复合，具体为：
(1)通过9-芴甲氧羰基Fmoc固相合成法合成短肽DGD；再采用碳二亚胺法偶联短肽DGD和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽DGD；
(2)采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇500和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
(3)将步骤(2)制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.05mg/mL；将步骤(1)制得的硫辛酸修饰的短肽DGD加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的浓度为0.05mg/mL；将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与硫辛酸-短肽水溶液充分混合，其中，聚乙二醇-硫辛酸与硫辛酸-短肽的摩尔比为9:1，在辐照强度为1mW/cm2的紫外光下照射5min后得到聚乙二醇-硫辛酸-短肽混合液。
(4)将抗菌肽Bactenecin加入(抗菌肽Bactenecin的加入量与实施例1中相同)到步骤(3)制得的聚乙二醇-硫辛酸-短肽混合液中，充分混合后得到抗菌制剂。
通过双倍稀释法，检验实施例7制得的抗菌制剂的最小抑菌浓度。以Luria-Bertani肉汤培养基增殖培养大肠杆菌，以胰蛋白胨大豆肉汤培养基增殖培养金黄色葡萄球菌，以沙氏葡萄糖液体培养基增殖培养白色念珠菌。结果显示，实施例7制得的抗菌制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为4μg/mL，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为8μg/mL，对白色念珠菌的最小抑菌浓度为8μg/mL。
以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率，结果见表7，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽添加聚乙二醇化短肽增容前后的细胞存活率，结果见表7，以未进行增容修饰的阳离子抗菌肽为对照组。
表7抗菌肽Bactenecin添加聚乙二醇化短肽增容前后的溶血率和细胞存活率
由表7可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bactenecin，实施例7制得的抗菌制剂对血红细胞的溶血作用并没有改善。
由表7可知，相比于未进行增容修饰的抗菌肽Bactenecin，交联后再与抗菌肽复合的抗菌制剂对正常纤维细胞L929的细胞毒性同样没有改善。这是由于交联后再与抗菌肽复合不能提高抗菌肽的生物相容性。
Claims (7)
1.一种基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：由硫辛酸修饰的短肽和聚乙二醇修饰的硫辛酸组成，应用时，先将抗菌肽通过静电作用与硫辛酸修饰的短肽复合，再将硫辛酸修饰的短肽与聚乙二醇修饰的硫辛酸在紫外光照射下形成S-S共价键；所述短肽为DGD、DLLD、EEA、LLEE、DDI或EVEV；所述聚乙二醇的平均分子量为500~5000；
所述抗菌制剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）采用碳二亚胺法偶联短肽和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽；
（2）采用碳二亚胺法偶联聚乙二醇和硫辛酸，得到聚乙二醇修饰的硫辛酸；
（3）将步骤（1）制得的硫辛酸修饰的短肽加入水中，配制成硫辛酸-短肽水溶液，将抗菌肽加入到硫辛酸-短肽水溶液中，充分混合后得到硫辛酸-短肽-抗菌肽混合液；
（4）将步骤（2）制得的聚乙二醇修饰的硫辛酸加入水中，配制成聚乙二醇-硫辛酸水溶液，将聚乙二醇-硫辛酸水溶液与步骤（3）的混合液充分混合，在紫外光照射后得到抗菌制剂；硫辛酸-短肽-抗菌肽与聚乙二醇-硫辛酸的混合摩尔比为1:9~9:1。
2.权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂在制备抗菌制剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：步骤（1）中，短肽和硫辛酸的质量比为2:1～1:5。
4.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：步骤（2）中，聚乙二醇和硫辛酸的质量比为5:1～2:1。
5.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：步骤（3）中，硫辛酸-短肽水溶液中，硫辛酸-短肽的质量浓度为0.05mg/mL~0.5mg/mL。
6.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：步骤（4）中，聚乙二醇-硫辛酸水溶液中，聚乙二醇-硫辛酸的质量浓度为0.05mg/mL~0.5mg/mL。
7.根据权利要求1所述的基于聚乙二醇化短肽增容剂的抗菌制剂，其特征在于：步骤（4）中，紫外光辐照强度为1~50mW/cm2，照射时间为5~30分钟。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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