CN107530398A

CN107530398A - 抗微生物肽

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Publication number: CN107530398A
Application number: CN201680018243.5A
Authority: CN
Inventors: 尼夫·巴克诺夫; 摩西·科恩-库特纳
Original assignee: Ohm Nicks Medical Ltd
Current assignee: Ohm Nicks Medical Ltd
Priority date: 2015-02-22
Filing date: 2016-02-17
Publication date: 2018-01-02
Anticipated expiration: 2036-02-17
Also published as: WO2016132359A3; CN107530398B; EP3197479A2; US20160362459A1; US20190292233A1; JP6900324B2; WO2016132359A2; JP2018507259A; ES2740273T3; EP3197479A4; AU2016221298A1; US10538559B2; EP3197479B1; US20190292234A1; AU2016221298B2; CA2975971C; US10308693B2; CA2975971A1

Abstract

本发明提供了一种肽，所述肽包括：核心氨基酸序列，所述核心氨基酸序列与天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列相同或相似。本发明还提供了编码所述肽的核酸序列和包含所述核酸的载体。本发明还提供了包括所述肽或所述核酸的药物组合物。本发明还提供了治疗感染的方法、克服微生物对抗生剂的固有的或获得性的耐药性的方法或消毒伤口的方法，所述方法包括将所述肽施用于对其有需要的受试者。

Description

抗微生物肽

发明领域

本发明包括用于治疗用途的抗微生物肽。这些肽是基于昆虫中作为有效抗细菌剂的天蚕杀菌肽(Cecropin)家族。

发明背景

抗生素是在稀释溶液中具有杀死或抑制微生物生长能力的化学物质。对宿主足够无毒的抗生素被用作化学治疗剂来治疗人类、动物和植物的感染性疾病。该术语最初仅限于由微生物产生的物质，但现在已被扩展到包括类似化学活性的合成和半合成化合物。

抗微生物药物的广泛和普遍使用导致微生物耐药性株的出现。这些微生物不再对目前可用的抗微生物药物敏感。为了降低或预防致命的传染病并维持公众健康，需要新的抗微生物剂。这迫使研究人员追求新型的尚未被细菌耐受的抗生素。抗微生物肽(AMP)是昆虫发展用于对抗病原体的武器的一部分。虽然通常是阳离子的，昆虫AMP的一级结构变化明显。最常见的AMP家族成员在膜模拟环境中采用α-螺旋构象(Bulet P.等，Protein andPeptide Letters，2005，12，3-11)。

昆虫产生被分泌到其血淋巴中的抗菌肽作为对病原体感染的先天防御(Boman，H.G.等，Annu.Rev.Microbial.，1987，41，103-126)。一些昆虫物种能够产生10-15种不同的抗生肽(Hoffman，J.A.等，FEBS Let.，1993，325，663-664)。每种肽具有完全不同的抗细菌作用范围(Bulet，P.Medicine Sciences 1999.15，23-29)。

天蚕杀菌肽(Cecropins)首先从Hyalophora cecropia的血淋巴中分离出。天蚕杀菌肽是由29-42个氨基酸残基组成的小的阳离子肽，被发现于双翅目(果蝇属(Drosophila)、麻蝇属(Sarcophaga))和鳞翅目(Hyalophora、Manduca、Bombyx、Antheraea)。应被提到的是，从猪肠中分离到一种天蚕杀菌肽(Boman,H.G.等，Eur.J.Biochem.1991，201，23-31；Morishima,I.等，Biochem.Physiol.1990.95B，551-554；Steiner,H.等，Nature 1981.292，246-248；Sun,D.等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1998.249(2)，410-415；Bulet,P.等，ImmunologicalReviews.2004.198，169-184)。主要天蚕杀菌肽的已知序列显示N-末端部分是强碱性的，而C-末端区域是中性的并且包含长疏水性链段。在所有情况下，天蚕杀菌肽具有酰胺化的C-末端残基(Boman,H.G.等，Annu.Rev.Microbial.，1987，41，103-126)。天蚕杀菌肽二级结构形成两个能够穿透细菌膜的两亲性α-螺旋。这种能力之后是膜失去离子梯度平衡，导致细菌死亡(Christensen，B.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988 83：1670-1674；Lockey，T.D.等Eur.J.Biochem.1996.236，263-271；Marassi，F.M.等，Biophys.J.1999.77，3152-3155；Wang，W.等，J.Biol.Chem.1998.273，(42)27438-27448)。

天蚕杀菌肽是非常相似的分子，因为一半的氨基酸取代是严格保守的。理论预测和圆二色性谱(circular dichroism spectra)表明，这些肽可以形成近乎完美的两亲性α-螺旋，其中带电基团在一个纵侧而疏水侧残基在另一侧。具有两亲性螺旋的蛋白质通常与膜缔合，并且该二级结构对天蚕杀菌肽的膜破坏活性可能有重要作用(Boman，H.G.等，Annu.Rev.Microbial.，1987，41，103-126)。

天蚕杀菌肽家族不同序列的肽的结构显示它们代表相似类型的分子。除了强碱性的N-末端区域和C-末端半部分的长疏水性链段外，还有其他典型的保守特征，例如：位置2处的色氨酸，位置5、8和9处的单赖氨酸和双赖氨酸，以及位置12处的精氨酸。可以得出结论：在进化过程中一定有强大的选择压力使得某些天蚕杀菌肽序列在不同类型昆虫中得以保留(Boman，H.G.等，Eur.J.Biochem.1991，201，23-31)。

膜活性肽在平面脂质双层体系以及脂质双层破坏中表现出通道样传导性(channel-like conductivities)。这些双层开口剥夺了受影响的生物体的跨膜电化学梯度，导致水流增加并伴随着细胞胀大、渗透裂解和细胞死亡。药理学应用特别感兴趣的抗微生物肽是那些显示出抗细菌活性但在相同条件下不显示针对健康脊椎动物细胞的溶血或细胞毒性作用的抗菌肽(B.Bechinger等，J.Membrane Biol.1997.156，197-211)。大多数抗细菌肽必须带正电才能与通常带负电的细菌表面结合。天蚕杀菌肽显示出对各种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的强烈的抗生活性(antibiotic activity)而不裂解哺乳动物细胞系或酵母(Agerberth，B.等，Eus.J.Biochem.1993，216，663-629)。

天蚕杀菌肽的细胞杀伤活性不是通过特异的手性受体相互作用来介导的。这些肽的细胞裂解活性与其在膜环境中形成α-螺旋二级结构的能力以及与其对脂质体的结合亲和力相关(B.Bechinger等，J.Membrane Biol.1997.156，197-211)。对各种细胞类型的毒性研究已经表明，虽然植物原生质体比动物细胞对天蚕杀菌肽更敏感，但是植物细胞比它们的细菌病原体对这些肽的敏感性低一到两个数量级(Jaynes，J.M.等，PeptideRes.1989.2，157-160；Nordeen，R.D.等，Plant Sci.1992.82，101-107)。

天蚕杀菌肽作为抗微生物剂的益处的一个强有力的例子可以见于天蚕杀菌肽A。天蚕杀菌肽A是37个残基的肽，完全由普通的L-氨基酸组成(Steiner H.等，Nature.1981，292：246-248)。天蚕杀菌肽A的二级结构包括具有与细菌质膜相同的长度的两个两亲性α-螺旋构成。这种毒素的主要目标被认为是微生物膜，其抗微生物作用可能是由于离子载体活性。当大肠杆菌(Escherichia coli)细菌被用天蚕杀菌肽A处理时，细胞内的K⁺离子迅速渗漏出，细胞的ATP库(ATP pool)迅速减小。这些结果表明，天蚕杀菌肽A的杀细菌作用是由于其离子载体活性，并且通过抑制氧化磷酸化所必需的质子梯度的形成来阻止ATP的产生(Natori，S.Nippon Rinsho.1995.53，1297-1304；Okada，M.等，Biochem.J.1985.229，453-458，Silvestro L等，Antimicrob Agents Chemother.2000Mar；44(3)：602-607)。

应当注意的是天蚕杀菌肽抑制人类肠道中有害细菌的生长，而不影响健康人群肠道中丰富的有益细菌的生长(Mitsuhara，I.等，Biotechnology Letters.2001.23，569-573)。

肽作为抗生素的使用由于其对蛋白酶活性的敏感性而不明显(Andrew，D.等，Biopolymers.1998.47，415-433)。大多数天蚕杀菌肽富含赖氨酸和精氨酸残基，这些残基部分通常包含大量蛋白酶的部分靶序列，蛋白酶例如胰蛋白酶、抑制剂A和蛋白酶K(GunnelDALHAMMAR等，Eur.J.Biochem.139，247-252(1984，Bland J.M.等，Journal ofagricultural and food chemistry 1998v.46no.12pp.5324-5327)。以前的研究表明，天蚕杀菌肽在植物的细胞内液中迅速降解(Owens，L.D.等，Mol.Plant MicrobeInteract.1997.10，525-528)。一些试图在植物中表达天蚕杀菌肽的实验可能由于天蚕杀菌肽对蛋白水解活性的敏感性而失败(Allefs，S.J.H.M等，Am.Potato J.1995.72，437-445；Florack，D.等，Transgenic Res.1995.4，132-141；Hightower，R.等，Plant CellRep.1994.13，295-299)。

稳定蛋白的工程化具有巨大的技术和经济重要性，因为蛋白质的有限稳定性通常严重限制其医疗和工业应用。因此，本发明的目的是提供新型稳定的基于肽的抗生素，例如AMCP。

发明概述

本发明提供遗传工程化的或合成的抗降解肽。在一些实施方案中，肽在其羧基和氨基末端包括至少一个半胱氨酸残基。在本发明的一些实施方案中，在氧化环境下，例如在各种感染中，本发明的肽的羧基和氨基末端的半胱氨酸是共价键合的，因此在本发明的实施方案中产生了环状形式的肽，其中所述环肽代表在维持其原始生物活性的同时更高的稳定性。

本发明涉及一种肽，其包含核心氨基酸序列，所述核心氨基酸序列与天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列相同或相似，其中所述核心氨基酸序列在N-末端通过N-末端基团延伸和/或在C-末端通过C-末端基团延伸；并且其中N-末端基团和/或C-末端基团相同或不同，且能够形成共价键以形成环肽或通过分子间共价连接(intermolecular covalentlinkage)形成同型多聚体组装物(homomultimer assembly)。

在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员属于以下的组：AMP CM_IV、天蚕杀菌肽A、天蚕杀菌肽B、天蚕杀菌肽B2、天蚕杀菌肽D、天蚕杀菌肽IA和天蚕杀菌肽P1。

在本发明的一些实施方案中，环肽具有拓扑结构，其中拓扑结构是头对尾(head-to-tail)、侧链对侧链(side-chain-to-side-chain)、头对侧链(head-to-side-chain)或侧链对尾(side-chain-to-tail)或主链对主链(backbone-to-backbone)或侧链对主链(side-chain-to-backbone)或头对主链(head-to-backbone)或尾对主链(tail-to-backbone)。

在本发明的一些实施方案中，共价连接在氧化和/或酸性生理条件下形成。

在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含17-144个氨基酸。

在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的核心氨基酸序列如SEQ IDNo.12-22所列。

在本发明的一些实施方案中，核心氨基酸序列与SEQ ID No.12-22所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。

在本发明的一些实施方案中，核心氨基酸序列包括在一个或更多个位置的取代、保守氨基酸取代、保守修饰的序列变体、缺失和/或插入。

在本发明的一些实施方案中，C-末端基团和/或N-末端基团包括以下的一个或更多个：半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的基团的氨基酸序列、或其任何组合。

在本发明的一些实施方案中，C-末端基团和/或N-末端基团各自选自由半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的任何其他基团的氨基酸序列组成的组。

在本发明的一些实施方案中，N-末端基团包括氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且C-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。

在本发明的一些实施方案中，C-末端基团包含氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且N-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。

在本发明的一些实施方案中，共价连接是二硫键。

在本发明的一些实施方案中，共价连接是酰胺、内酰胺或肽键。

在本发明的一些实施方案中，N-末端基团和C-末端基团共价结合以形成环肽。

在本发明的一些实施方案中，肽在生理膜内自组装，使得在肽的N-末端基团和另一相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价连接，或其中在肽的C-末端基团和另一相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价连接。

在本发明的一些实施方案中，肽如SEQ ID No.1-11中任一项所列。

在本发明的一些实施方案中，肽具有与SEQ ID No.1-11所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方案中，肽如SEQ ID NO：6所列。

在本发明的一些实施方案中，肽具有与SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

本发明涉及编码任何一种以上提到的肽的核酸序列。

本发明涉及包含以上提到的核酸的载体。

本发明涉及包含任何一种以上提到的肽或以上提到的核酸的药物组合物。

本发明涉及治疗感染的方法，该方法包括将以上提到的肽之一或以上提到的药物组合物施用于对其有需要的受试者。

本发明涉及以上提到的肽中的任何一种或以上提到的药物组合物在制备用于治疗受试者感染的药物中的用途。

在本发明的一些实施方案中，感染是细菌、病毒和/或真菌感染。

在本发明的一些实施方案中，药物组合物为液体、霜剂、凝胶、糊剂、粉末、乳剂、软膏、搽剂、洗剂、透皮系统、注射液、悬浮液、贴片剂(a patch film patch)或喷雾剂的形式。

在本发明的一些实施方案中，药物组合物为胶囊或片剂的形式。

在本发明的一些实施方案中，组合物或肽与一种或更多种另外的抗炎活性剂联合施用。

本发明涉及一种克服微生物对抗生剂的固有或者获得性耐药性的方法，所述方法包括：使微生物与以上提到的肽中的任一种或以上提到的药物组合物接触。

在本发明的一些实施方案中，微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella Pneumoniaea)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒血清型沙门氏菌(Salmonella serotype Typhi)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)spp.的成员、假单胞菌属(Pseudomonas)spp.的成员、沙门氏菌属(Salmonella)spp.的成员或不动杆菌属(Acinetobacter)spp.的成员，或其任何组合。

本发明涉及消毒伤口的方法，包括使伤口与以上提到的肽中的任一种或以上提到的药物组合物接触。

在本发明的一些实施方案中，伤口是水疱创伤、软组织创伤、皮肤脓肿、手术创伤、缝合撕裂、污染撕裂、烧伤、褥疮、郁积性溃疡、腿部溃疡、足部溃疡、静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、压迫性溃疡、口腔感染、牙周病、二度烧伤(partial thickness burn)或三度烧伤(full thickness burn)。

附图简述

图1A描绘了检测以下内容的考马斯亮蓝(Brilliant Blue R，Sigma ChemicalCompany，USA)染色凝胶：泳道1-3：经历浓度递增的蛋白酶-K(ProtK)蛋白水解的天然天蚕杀菌肽-A(CecA)：0/5/20ng/30μl，如所提及的。泳道4-6：经历浓度递增的ProtK蛋白水解的OMN6：0/5/20ng/30μl，如所提及的。泳道7-9：经历浓度递增的ProtK蛋白水解的牛血清白蛋白(BSA)：0/5/20ng/30μl，如所提及的。CecA和BSA的蛋白水解导致条带从凝胶上消失。ProtK的蛋白水解活性不影响OMN6，并且所有条带都存在。

图1B描绘了检测肽OMN2、OMN7和OMN11对ProtK活性的稳定性的考马斯蓝染色凝胶。与ProtK孵育或不与ProtK孵育时每种肽的稳定性被呈现(分别为右泳道和左泳道)。明显地，肽OMN2、OMN7和OMN11没有被ProtK的破坏活性降解。对于ProtK处理的肽和未处理的肽，条带具有相同的强度，即ProtK对这些肽没有破坏作用。

图2A：右图展示了通过600nm处吸光度监测大肠杆菌细菌在17.5小时中的生长。细菌生长或生长抑制呈现为随时间的OD600nm值。随着细菌的生长，OD值增加。OMN6的抗微生物作用由降低的OD值来证明，降低的OD值代表了在OMN6存在下的细菌死亡。左图，用大肠杆菌细菌和天然肽天蚕杀菌肽A(CecA)进行与以上描述同样的实验。如清楚看出的，10小时后CecA失去其抗微生物活性并变得无效。在这一点上，细菌克服了生长抑制并开始旺盛生长。在实验结束时，用CecA处理的细菌达到与对照(CTRL)组(用DDW处理)相似的密度和生长水平。这些结果强烈地指出以下事实：OMN6是比CecA更强的抗微生物剂。

图2B描绘了在CecA或本发明的肽之一OMN6的存在下作为对照组存活百分比的细菌存活(％/CTRL)。左侧柱显示在被20ng ProtK预处理的12.5μM的CecA的存在下的细菌存活。右侧柱显示在被20ng ProtK预处理的12.5μM的OMN6的存在下的细菌存活。CecA被ProtK降解，因此细菌存活超过了CRTL组的70％。OMN6是稳定的且有活性的，且因此细菌生长被抑制到小于CRTL组的10％。

图3：是显示绿色荧光蛋白(GFP)从裂解的细菌细胞中渗漏的照片。图3A显示用DDW处理的细菌作为对照(CTRL)。可以看出，细菌是活的、良好界定的、完整的并且GFP荧光只在细菌内部被检测到。图3B显示用OMN6处理的细菌。细菌死亡，并且经历了大规模的裂解，这使得GFP荧光在细菌细胞之外、在周围的培养基中被检测到。

图4A左图是显示经过或未经过OMN6处理时，在离心后，GFP从裂解的细菌渗漏到周围培养基的照片。左管中接受DDW假处理的细菌是活的、完整的、并且所有GFP荧光限于沉淀中的细菌细胞。右管中接受OMN6处理的细菌，已经历大规模的裂解，并且GFP荧光在死细菌细胞外和周围的培养基中清晰可见。

图4B显示了每组中荧光单位(FU)的图形定量。

图5：显示通过亚甲基蓝(Methylene-Blue)测定来定量的HEK293细胞的存活，并呈现为占CTRL的存活百分比(％/CTRL)。浓度递增的OMN2(图5A)、OMN6(图5B)、OMN7(图5D)和OMN11(图5C)的24小时处理未导致细胞死亡或存活分数的改变。

图6A：通过600nm处吸光度监测大肠杆菌细菌在17.5小时中的生长。细菌生长或生长抑制呈现为随时间的OD600nm值。随着细菌的生长，OD值增加。OMN6抗微生物作用的剂量反应表现为降低的OD值，这代表了与增加的以μM计的OMN6浓度相关联的细菌死亡。

图6B：应用与图6A所描述的相同的实验系统，并加入10％胎牛血清(FBS)。FBS的加入用于更好地代表体内存在的环境，并预测OMN肽在活动物中以及之后在人体中发挥其作用的能力。

图6C和6D：用大肠杆菌NDM-1细菌亚胺培南(IPM)耐药株进行相同的实验。IPM浓度以μg/ml表示。图6C清楚地表明IPM由于细菌耐药性而已经失去了其对细菌生长的抑制作用。在图6D中，OMN6对这种耐药株发挥强大的抗微生物作用。这些结果表明，OMN6对常规抗生素治疗失败的耐药性细菌是有效的抗微生物剂。

图7：是描绘OMN6对耐药性细菌的抗微生物作用的实例的图片。将多种药物耐药性鲍氏不动杆菌细菌铺板在合适的培养基上并孵育24-48小时以允许菌落生长。在铺板之前，将细菌与0-10μM递增浓度的OMN6一起孵育(另见图8)，并如前所述进行监测(图6和实施例5)。CTRL中的细菌在铺板时产生无数菌落，显示其生长未被抑制。当OMN6处理的细菌被铺板时，培养基保持清澈且没有看到菌落。没有菌落表明所有的细菌都由于OMN6处理而被杀死。

图8：是表9中详述的小鼠初步局部(topical)安全性实验的概述。呈现了所有组和处理以及进行的所有分析测定。该图描绘了进行的溶血测定的分析结果。该图描绘了每个实验组平均的游离血红蛋白的量化，并呈现为对照组的百分比(％/CTRL)。

图9：是表10中详述的小鼠初步腹膜内(IP)注射安全性实验的概述。呈现了所有组和处理以及进行的所有分析测定。该图描绘了进行的溶血测定的分析结果。该图描绘了每个实验组平均的游离血红蛋白的量化，并将其呈现为CTRL的％。

图10总结了为了评估OMN6在体内的效力而进行的实验的结果。将小鼠皮下(SC)注射10⁸菌落形成单位(CFU)/小鼠的耐药性菌株大肠杆菌ESBL。实验组用浓度为8mg/kg的OMN6处理，且CTRL组用盐水(0.9％NaCl)溶液处理作为假处理。四天后，处死小鼠并分析皮肤样品的细菌负荷(图10A)和脓肿大小(以mm²计)(图10B)。结果显示，在用OMN6处理的组中，细菌负荷降低了94％。在OMN6处理的组中，脓肿大小减少了80％。考虑到这些结果，很明显OMN6发挥很强的抗微生物作用并且在体内是高效的。

发明实施方式详述

本发明是基于来自天蚕杀菌肽家族的肽，其主要在鳞翅目和双翅目的昆虫中表达。

本发明提供可用作抗生药物的抗降解的肽。在一些实施方案中，肽在其羧基和氨基末端包含至少一个半胱氨酸残基。在本发明的一些实施方案中，在氧化环境下，例如在各种感染中，本发明的肽的羧基和氨基末端的半胱氨酸是共价键合的，因此产生了环状形式的肽，其中所述环肽代表在维持其原始生物活性的同时更高的稳定性。

在一些实施方案中，提供了一种肽，其包含：核心氨基酸序列，所述核心氨基酸序列与天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列相同或相似，其中所述核心氨基酸序列核心氨基酸序列在N-末端通过N-末端基团延伸和/或在C-末端通过C-末端基团延伸；并且其中N-末端基团和/或C-末端基团相同或不同或不存在(null)，且能够形成共价键以形成环肽或通过分子间共价键连接形成同型多聚体组装物。

如本文所用，在一个实施方案中，短语“同型多聚体组装物”是指包括相同分子的多于一个复制物(replica)的分子结构组织。相同分子的不同复制物的连接和结构组织可以通过共价键和/或非共价相互作用维持。

如本文所用，在一个实施方案中，短语“分子间共价连接”是指在两个相同或不同分子之间形成的共价键。

在本发明的一些示例性实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员属于以下的组：AMPCMIV、天蚕杀菌肽A、天蚕杀菌肽B、天蚕杀菌肽B2、天蚕杀菌肽D、天蚕杀菌肽IA和天蚕杀菌肽P1。

参考表1、2和3，其显示本发明的11个示例性抗微生物肽(序列1-11，表1)，来自天蚕杀菌肽家族的原始序列(序列12-22，表2)和编码如SEQ ID No.1-11所列的肽的核酸序列，表3)。

表1列出了经修饰的肽的氨基酸序列。插入的半胱氨酸和甲硫氨酸残基以粗体显示。

表1Omnix医用修饰肽

表2列出了来自于天蚕杀菌肽家族的示例性肽的氨基酸序列及其来源。

表2天蚕杀菌肽家族的肽

表3列出分别编码序列1-11的肽的核酸序列。

表3编码本发明修饰肽的核苷酸序列。

在本发明的一些实施方案中，环肽具有拓扑结构，其中拓扑结构是头对尾、侧链对侧链、头对侧链或侧链对尾或主链对主链或侧链对主链或头对主链或尾对主链。根据本发明的一些实施方案的环肽是均环肽(homodetic cyclic peptide)、环状异肽(cyclicisopeptide)、环状缩肽(cyclic depsipeptide)或双环肽(bicyclic peptide)。在一些实施方案中，共价连接在氧化和/或酸性生理条件下形成。在一些实施方案中，本发明的肽是装订肽(stapled peptide)。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“头对尾”是指通过肽的氨基末端和羧基末端之间的酰胺键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“侧链对侧链”是指通过两个侧链之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“头对侧链”是指通过肽的氨基末端和侧链之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“侧链对尾”是指通过肽的羧基末端和侧链之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“主链对主链”是指通过肽的两个不同主链原子之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑结构的一个实施方案中，短语“侧链对主链”是指通过肽的侧链和主链原子之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽的拓扑的一个实施方案中，短语“头对主链”是指通过肽的氨基末端和主链原子之间的共价键形成来使肽环化。

如本文所用，在涉及环肽拓扑的一个实施方案中，短语“尾对主链”是指通过肽的羧基末端和主链原子之间的共价键形成来使肽环化。

在一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的核心氨基酸序列如表2详述的SEQ IDNO:12-22所列。核心氨基酸序列可包含L或D立体异构体或其组合。在本发明的一些实施方案中，核心氨基酸序列与SEQ ID No:12-22所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。根据一些实施方案，核心氨基酸序列可包括在一个或更多个位置的取代、保守氨基酸取代、保守修饰的序列变体、缺失和/或插入，或者可以是以相反的顺序。

如本文所使用的，在一个实施方案中，短语“保守氨基酸取代”或短语“保守修饰的序列变体”是指氨基酸序列中不重要的变化，技术人员将认识到，在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对核酸、肽、多肽、蛋白质序列进行的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的序列变体”，包括其中改变导致氨基酸取代为化学上相似的氨基酸(保守氨基酸取代)。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指导也可以在Bowie等，1990，Science 247：1306 1310中找到。这种保守修饰的变体是多态性变体，种间同系物和等位基因之外的并且不排除保守修饰的变体。典型的保守取代包括但不限于：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。氨基酸可以基于与侧链相关的性质被取代，例如具有极性侧链的氨基酸可被取代，例如丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；基于侧链的电荷的氨基酸，例如精氨酸和组氨酸(H)；和具有疏水侧链的氨基酸，例如缬氨酸(V)和亮氨酸(L)。如所示的，变化通常是较小的性质，例如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代。

在本发明的一些实施方案中，形成本发明肽的核心氨基酸的天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含17-144个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含20-140个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含25-130个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含20-40个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含25-30个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含20-50个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含15-50个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含20-70个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包含20-100个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，肽包含C-末端基团和/或N-末端基团，其中C-末端基团和/或N-末端基团基团包括以下的一个或更多个：半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的基团的氨基酸序列、或其任何组合。

在本发明的一些实施方案中，C-末端基团和/或N-末端基团各自选自由半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的任何其他基团的氨基酸序列组成的组。在本发明的一些实施方案中，N-末端基团包括氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且C-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在本发明的一些实施方案中，C-末端基团包含氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且N-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。

在本发明的一些实施方案中，N-末端基团和C-末端基团共价结合以形成环肽。共价连接可以是二硫键，酰胺，内酰胺或肽键。

在本发明的一些实施方案中，C-末端基团和N-末端基团各自选自L-氨基酸、D-氨基酸、非天然氨基酸或氨基酸衍生物的组。

在本发明的一些实施方案中，肽在生理膜内自组装，使得在肽的N-末端基团和另一相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价键，或其中在肽的C-末端基团和另一相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价键。

在本发明的一些实施方案中，其中肽如SEQ ID No.1-11所列。在一些实施方案中，肽如SEQ ID.No.6所列，该肽在这里也被指定为OMN 6。

在一些实施方案中，本发明的肽通过添加到C末端基团中的酰胺基团和或通过添加到N-末端基团的乙酰基团来稳定。在一些实施方案中，本发明的肽通过本领域已知的任何技术来稳定，例如添加非蛋白质或蛋白质部分。

在本发明的实施方案中，非蛋白质是聚乙二醇(PEG)或其衍生物、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、白蛋白、二乙烯醚马来酸酐共聚物(DIVEMA)；和聚(苯乙烯马来酸酐)(SMA)、透明质酸(HA)、藻酸(AA)、聚甲基丙烯酸羟基乙酯(Poly-HEMA)、甘醇二甲醚(glyme)或聚异丙基丙烯酰胺或其任何组合。

在一个实施方案中，本发明提供了模拟本发明中提供的任何肽或肽变体的功能活性的功能等同分子(functionally equivalent molecule)。术语“功能等同分子”在本申请中指任何化合物，例如但不限于模拟肽(peptidomimetic)或装订肽。功能等同分子可以通过逆转肽(retro-inverso peptide)技术或D-逆-对映异构体肽(D-retro-enantiomerpeptide)技术获得，D-逆-对映异构体肽由D-氨基酸的反向序列组成。功能等同分子可以通过使用氨基酸衍生物来获得。

如本文所用，在一个实施方案中，术语“氨基酸衍生物”是指可衍生自天然或非天然存在的氨基酸的基团，如本文所述和例示的。氨基酸衍生物对于本领域技术人员是明显的，包括但不限于天然和非天然存在的氨基酸的酯、氨基醇、氨基醛、氨基内酯和N-甲基衍生物。在实施方案中，提供氨基酸衍生物作为本文所述化合物的取代基，其中取代基是-NH-G(Sc)-C(0)-Q或-OC(0)G(Sc)-Q，其中Q是-SR、-NRR或烷氧基，R是氢或烷基(alkyl)，Sc是天然存在或非天然存在的氨基酸的侧链，并且G是C1-C2烷基。在某些实施方案中，G是Ci烷基，Sc选自氢、烷基、杂烷基、芳基烷基和杂芳基烷基。

如本文所用，在一个实施方案中，术语“肽”可以从天然生物来源获得、合成、或通过重组技术产生。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。一个或更多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加化学实体，如碳水化合物基团、磷酸基、法呢基、异法呢基()、脂肪酸基、酰基(例如，乙酰基)、缀合接头(a linker for conjugation)、官能化(functionalization)、或其它已知的保护基团/封闭基团。

如本文所用，在一个实施方案中，术语“肽”可以是前述肽的片段、衍生物、类似物、或变体，及其任何组合。如本文所用的术语或短语“肽的片段”包括蛋白水解片段以及缺失片段。“肽的变体”包括具有由于氨基酸取代、缺失或插入而改变的氨基酸序列的片段和肽。

变体可以天然存在或者是非天然存在的。实例包括融合蛋白、具有通过与功能侧基反应而化学衍生的一个或更多个残基的肽、和含有二十种标准氨基酸的一个或更多个天然存在的氨基酸衍生物的肽。这些修饰还可以包括并入D-氨基酸或其他非编码氨基酸。在一个实施方案中，修饰不应明显干扰肽及其片段的期望生物活性。在另一个实施方案中，修饰可以改变肽及其片段的特征，例如稳定性或半衰期，基本上都不干扰肽及其片段的期望生物活性。在一个实施方案中，如本文所用，术语“肽”和“蛋白质”可以互换使用，具有完全相同的含义和品质(qualities)。

在一个实施方案中，使用多种标准蛋白纯化技术纯化本发明的肽，例如但不限于亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、伴刀豆球蛋白A层析、层析聚焦和差异溶解(differential solubilization)。

在一个实施方案中，为了促进回收，所表达的编码序列可以被工程化为编码本发明的肽和融合的可切割部分。在一个实施方案中，融合蛋白可以被设计为使肽可以通过亲和层析容易地分离；例如通过固定在对可切割部分特异的柱上。在一个实施方案中，切割位点被工程化在肽和可切割部分之间，并且肽可以通过在该点特异性切割融合蛋白的合适的酶或试剂处理而从色谱柱中释放[例如，参见Booth等，Immunol.Lett.19：65-70(1988)；和Gardella等，J.Biol.Chem.265：15854-15859(1990)]。

在一个实施方案中，本发明的肽以基本上纯净的形式被回收。

在一个实施方案中，短语“基本上纯”是指允许在本文所述的应用中有效使用蛋白质的纯度。

在一个实施方案中，本发明的肽也可以使用体外表达系统来合成。在一个实施方案中，体外合成方法是本领域熟知的，并且该系统的组件(component)是可商购的。

在一个实施方案中，本发明的肽是通过合成方法产生的。在一些实施方案中，使用重组DNA技术产生肽。“重组”肽或蛋白质是指通过重组DNA技术产生的肽或蛋白质；即通过由编码所期望的肽或蛋白质的外源DNA构建体转化的细胞产生的肽或蛋白质。

在一些实施方案中，重组肽、其片段或肽被合成和纯化；它们的治疗效力可以在体内或体外测定。在一个实施方案中，本发明的肽的活性可以使用各种测定来确定，测定尤其包括细胞活力、小鼠的存活和伤口的恢复。

在一个实施方案中，本发明的肽包含至少20个氨基酸。在另一个实施方案中，肽包含至少25个氨基酸。在其它实施方案中，肽包含至少30个氨基酸或至少50个氨基酸或75个氨基酸，或100个氨基酸，或125个氨基酸，或150个氨基酸，或200个氨基酸，或250个氨基酸或300个氨基酸或350个氨基酸或400个氨基酸。

如本文所用，在一个实施方案中，术语“肽”和“片段”可以互换使用，具有全部相同的含义和品质。如本文所用，在一个实施方案中，术语“肽”包括天然肽(降解产物、合成地合成的肽(synthetically synthesized peptides)或重组肽)和肽模拟物(peptidomimetics)(通常为合成地合成的肽)，例如为肽类似物的类肽(peptoid)或半类肽(semipeptoid)，其可能具有比如致使肽在身体内更稳定或更能够渗透细菌细胞的修饰。这些修饰包括但不限于N末端修饰、C末端修饰、肽键修饰(包括但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH)、主链修饰和残基修饰。制备肽模拟物化合物的方法是本领域熟知的，并且例如在Quantitative Drug Design，C.A.RamsdenGd.，Chapter 17.2，F.Choplin Pergamon Press(1992)中被详细说明，其通过引用并入，如同在此完全阐述。这方面的进一步细节在以下提供。

肽内的肽键(-CO-NH-)可以被取代，例如N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)、酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)、酮亚甲基(ketomethylen)键(-CO-CH2-)、α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)、羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)、硫代酰胺键(-CS-NH-)、烯双键(-CH＝CH-)、逆酰胺键(retro amide bond)(-NH-CO-)、肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。

这些修饰可以发生在沿肽链的任何一个键处，甚至在几个位置(2-3)同时发生。

天然芳香族氨基酸Trp、Tyr和Phe可以被取代为合成的非天然酸，例如TIC、萘乙腈(Nol)、Phe的环甲基化衍生物、Phe或o-甲基-Tyr的卤代衍生物。

如本文所用，在一个实施方案中，术语“氨基酸”是指天然存在和合成的α、β、γ或δ氨基酸，并且包括但不限于在蛋白质中发现的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在某些实施方案中，氨基酸处于L-构型。可选择地，氨基酸可以是丙氨酰、缬氨酰、亮氨酰、异亮氨酰、脯氨酰、苯丙氨酰、色氨酰、甲硫氨酰、甘氨酰、丝氨酰、苏氨酰、半胱氨酰、酪氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰胺酰、天冬氨酰、谷氨酰、赖氨酰、精氨酰、组氨酰、β-丙氨酰、β-缬氨酰、β-亮氨酰、β-异亮氨酰、β-脯氨酰、β-苯丙氨酰、β-色氨酰、β-甲硫氨酰、β-甘氨酰、β-丝氨酰、β-苏氨酰、β-半胱氨酰、β-酪氨酰、β-天冬酰胺酰、β-谷氨酰胺酰、β-天冬氨酰、β-谷氨酰、β-赖氨酰、β-精氨酰或β-组氨酰的衍生物。如本文所用，在一个实施方案中，短语“保守修饰的变体”适用于氨基酸序列和核酸序列两者。“氨基酸变体”是指氨基酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰的变体是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列，或当核酸不编码氨基酸序列时，是指基本上相同或相关(associated)(例如，天然连续)的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如，密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定丙氨酸的每个位置，密码子可以改变为所描述的另一个相应密码子，而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，它们是保守修饰变异的一种。本文每个编码多肽的核酸序列也描述了核酸的沉默变化。技术人员将认识到，在某些情况下，可以修饰核酸的每个密码子(AUG和TGG除外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)以产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的沉默变异隐含在所述的表达产物的序列中。

对于氨基酸序列，本领域技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽、蛋白质序列进行的改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比氨基酸的个别取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，包括其中改变导致氨基酸取代为化学上相似的氨基酸。提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。关于哪些氨基酸变化可能是表型沉默的指导也可以在Bowie等，1990，Science 247：1306 1310中找到。这种保守修饰的变体是多态性变体、种间同系物和等位基因之外的并且不排除多态性变体、种间同系物和等位基因。典型的保守取代包括但不限于：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。氨基酸可以基于与侧链相关的性质被取代，例如具有极性侧链的氨基酸可被取代，例如丝氨酸(S)和苏氨酸(T)；基于侧链的电荷的氨基酸，例如精氨酸和组氨酸(H)；和具有疏水侧链的氨基酸，例如缬氨酸(V)和亮氨酸(L)。如所示的，变化通常是较小的性质，例如不显著影响蛋白质折叠或活性的保守氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的肽是分离的肽。如本文所使用，在一个实施方案中，术语“分离的”指“由人的手”从其天然状态改变；即，如果它在自然界中发生，它将被从其原始环境改变或移除或改变并移除。

本发明的肽的测定可以通过例如琼脂糖稀释MIC测定(agarose dilution MICassay)、肉汤稀释法(broth dilution)、时间杀伤测定(time-kill assay)或等效方法。抗生素活性通过对微生物(例如细菌、真菌)的生长抑制或杀伤来测量。

根据本发明的另一个实施方案，在氧化环境下，例如，在感染中，本发明的肽的羧基末端和氨基末端的半胱氨酸彼此共价连接，因此在一些实施方案中产生了肽的环状形式，该环状形式代表更高的稳定性同时保持肽的原始生物活性或者甚至与原始形式相比改善的活性。在一些实施方案中，这些肽用作抗生药物。

本发明还提供了用于在单细胞异源表达系统(heterologous expressionsystem)中表达新型来自天蚕杀菌肽家族的含有半胱氨酸的肽的方法。该方法能够大规模表达，同时避免被蛋白水解活性快速降解。

根据本发明的一些实施方案，提供了编码具有SEQ ID No.1-11所列的序列中任何一个序列的肽的核酸序列，或包含编码具有SEQ ID No.1-11所列的序列中任何一个序列的肽的核酸序列的载体。

异源表达系统例如酵母菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)/巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)或相容的细菌菌株中AMCP的大规模生产在本发明的一些实施方案中起作用，以产生对大范围的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有效并克服了抗生素耐药性的问题的1类试剂。

根据本发明的一种方法，所需基因(例如但不限于表1中所列的任何肽的基因，例如AMCP6基因(SEQ ID NO：25))被鉴定、分离并在将半胱氨酸密码子加入到基因的羧基和氨基末端的每一个之后克隆到适合的载体中。该载体适合于大量表达目标肽，例如，pPIC9K和pET28质粒，并转化入可接受的靶表达系统，例如，BL21，巴斯德毕赤酵母，酿酒酵母细胞等。

编码来自天蚕杀菌肽家族的蛋白质的所需基因被遗传工程化为具有位于其羧基和氨基末端的偶数数量的半胱氨酸。表1提供了天蚕杀菌肽家族的几种肽的详细列表，包括其天然氨基酸序列和添加的半胱氨酸和甲硫氨酸残基。

本发明的一种方法是将ATG密码子(编码甲硫氨酸氨基酸)插入到成熟的天蚕杀菌肽基因的5’端。当未修饰的肽被工程化时，半胱氨酸残基插入到天然ATG密码子的下游。

在本发明的另一个实施方案中，提供了所需AMCP基因向编码6个组氨酸残基(His-Tag)的区域下游的插入。适合于此目的的许多相容载体是本领域技术人员已知的。本发明的一个实例是pET28a载体，用于在相容的细菌表达系统中表达肽。使用6个组氨酸残基His-标签是用于从表达系统细胞中分离和纯化蛋白质的众所周知的技术。

真核表达系统的使用通常用于产生外源蛋白质。这种系统的一个实例是甲醇营养的巴斯德毕赤酵母酵母株。巴斯德毕赤酵母已被开发成用于大规模生产所需蛋白质的优异宿主系统。使用巴斯德毕赤酵母超过大肠杆菌细菌细胞的优点之一是感兴趣的蛋白质通常被正确地折叠并分泌到生长培养基中。此外，巴斯德毕赤酵母不具有与细菌相关的内毒素问题，特别是当涉及本发明所要求的抗微生物肽时。因此，本发明的一个实施方案是将AMCP基因插入pPIC9K，pPIC9K是用于多拷贝整合和分泌表达的毕赤酵母载体(Invitrogen)。所选择的AMCP基因被克隆到所述表达载体中，得到pPIC9K-AMCP(9.5Kb)。克隆AMCP基因到AOX1启动子下游验证了AMCP基因表达是否受AOX1调控。例如，在其原始起源的5'处含有ATG-TGC密码子(分别编码甲硫氨酸和半胱氨酸)；并且在其3'端处含有TGC-密码子(编码半胱氨酸)的AMCP基因导致本发明所需的环肽的表达。

根据本发明的一些实施方案，提供了克服微生物对抗生剂固有的或者获得性的耐药性的方法，所述方法包括：使微生物与本文所述的本发明的肽接触。在一些实施方案中，微生物是微生物是大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌、伤寒血清型沙门氏菌、鲍氏不动杆菌、肠杆菌科spp.的成员、假单胞菌属spp.的成员、沙门氏菌属spp.的成员或不动杆菌属spp.的成员，或其任何组合。

如本文所用，微生物对抗生剂的“固有耐药性”是指即使在之前不暴露于抗生剂的情况下，对抗生剂作用的天然耐药性。(R.C.Moellering Jr.，Principles of Anti-infective Therapy；In：Principles and Practice of Infectious Diseases，4.sup.thEdition，Eds.；G.L.Mandell，J.E.Bennett，R.Dolin.Churchill Livingstone，New YorkUSA，1995，第200页)。

如本文所用，微生物对抗生剂的“获得性耐药性”是指不被基于推荐剂量的推荐抗生剂的通常可实现血药浓度抑制的耐药性。(NCCLS指南)。

如本文所用，微生物对抗生剂的“耐受性”是指抗生剂具有抑微生物(microstatic)而不是杀微生物(microcidal)作用的情况。耐受性由MBC:MIC比大于或等于32来测量。(Textbook of Diagnostic Microbiology，Eds.，C.R.Mahon和G.Manuselis，W.B.Saunders Co.，Toronto Canada，1995，第92页)。

如上所述，本发明提供了治疗由微生物引起的感染的方法、杀死微生物的方法和增强抗生剂的活性的方法。特别地，当微生物对抗生剂具有耐药性时，通过诸如耐受性、固有耐药性或获得性耐药性的机制，这些方法尤其适用。在本发明中，感染治疗是通过将有效剂量的阳离子肽单独或与抗生剂组合施用于感染患者。类似地，组合可以与微生物接触以达到杀死作用。

在本发明的一些实施方案中，提供了消毒伤口的方法，包括使伤口与本发明的肽或药物组合物接触。在一些实施方案中，伤口可能是水疱创伤、软组织创伤、皮肤脓肿、手术创伤、缝合撕裂、污染撕裂、烧伤、褥疮、郁积性溃疡、腿部溃疡、足部溃疡，静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、压迫性溃疡、口腔感染、牙周病、二度烧伤或三度烧伤。

在本发明的一些实施方案中，提供了治疗感染的方法，方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者。

在本发明的一些实施方案中，本发明提供本文所述的肽，或包含其的药物组合物在制备用于治疗受试者感染的药物中的用途。感染可能是细菌、病毒和/或真菌感染。

如本文在说明书和下面权利要求部分中所使用的，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”及其衍生词汇包括基本上抑制或减缓病原体生长或杀死它们。病原体可以选自细菌、病毒、寄生虫和病理真菌。

根据本发明的方法，本发明的肽应以治疗哺乳动物感染的有效量使用。如本文所用，“有效量”是指实现期望结果所需的量。例如，本发明肽的有效量在3天、4天、5天、7天或10天内从哺乳动物中除去细菌感染。用于本文目的的“有效量”是由本领域已知的这些考虑确定的。有效剂量可以从源自体外或动物模型试验系统的剂量-反应曲线推断。应当理解，“有效量”取决于待治疗的细菌、受试者的身体状况等。测定活性成分的有效量的最佳范围是在本领域技术范围内。

在本发明的一些实施方案中，提供了包含本发明的肽的药物组合物。药物组合物的形式可能为液体、霜剂、凝胶、糊剂、粉末、乳剂、软膏、搽剂、洗剂、透皮系统(transdermalsystem)、注射液、悬浮液、贴片剂或喷雾剂。在一些实施方案中，制剂是胶囊或片剂的形式或被设计为用于注射。组合物可以与一种或更多种另外的抗炎活性剂联合施用。

根据实施方案，本发明的组合物可以配制用于局部、口部、眼部或肺部(例如吸入)施用。其他制剂在下文中描述并且在本发明的范围内。

如本文所用，“药物组合物”是指本文所述的活性成分与其它化学成分如生理学上合适的载体和赋形剂的制剂。组合物的目的是促进活性成分(例如，本发明的肽)对受试者的施用。

如本文所用，术语“活性成分”是指负责预期生物效果(即用于治疗或预防感染)的肽组合物。

在下文中，可以互换使用的术语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”指不对受试者造成显著刺激，并且不消除所施用的活性成分的生物活性和属性的载体或稀释剂。这些短语包括佐剂(adjuvant)。

本文中，术语“赋形剂”是指添加到组合物(药物组合物或化妆品组合物)中以进一步促进本发明的活性成分的施用的惰性物质。

药物的制剂和施用技术可以在“Remington's Pharmaceutical Sciences”MackPublishing Co.，Easton，PA，最新版本中找到，其通过引用并入本文。

用于制剂和施用的技术可以在“Remington：The Science and Practice ofPharmacy”Twentieth Edition，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.(1995)中找到。对于人类或动物施用，制剂应符合与FDA要求相当的无菌性、致热原性(pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。药物制剂的施用可以以各种方式进行，如本文所述。

本发明的另一方面涉及药物组合物，包含药学上可接受的载体和为本发明的肽的活性成分。短语“活性成分”是指根据本发明的实施方案的任何肽、其片段、模拟肽的功能活性的功能等同分子、或编码肽的多核苷酸。药物组合物可以含有一种或更多种本发明的上述活性成分。通常，本发明的药物组合物将包括本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指任何合适的佐剂、载体、赋形剂或稳定剂，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊、粉末、溶液、悬浮液或乳液。

通常，组合物将含有从约0.01％至99％的活性成分。在一些实施方案中，组合物将含有从约20％至75％的活性成分，并且还将含有佐剂、载体和/或赋形剂。确定活性成分的有效量的最佳范围在本领域的技术范围内。在一些实施方案中，药物组合物可以包含约0.01至约100mg/kg体重的肽。在一些实施方案中，药物组合物可以包含约0.5至约100mg/kg体重的肽。在一些实施方案中，药物组合物可以包含约100至约500mg/kg体重的肽。在一些实施方案中，药物组合物可以包含约100至约300mg/kg体重的肽。施用本发明肽的治疗方案也可以由本领域普通技术人员容易地确定。也就是说，可以通过常规优化来建立施用的频率和剂量的大小。

在一些实施方案中，药物组合物为固体单位剂型(例如胶囊、片剂等)，例如含有以下的普通明胶类型：本发明的活性成分，以及载体，例如润滑剂和惰性填料如乳糖、蔗糖或玉米淀粉。在另一个实施方案中，活性成分用以下制成片剂(tabulated)：常规片剂基质例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉，以及联合粘合剂如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶，崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸，和润滑剂如硬脂酸或硬脂酸镁。片剂、胶囊等也可以含有粘合剂如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂如磷酸二钙；崩解剂如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；以及甜味剂如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时，它除了上述类型的材料之外还可以含有诸如脂肪油的液体载体。

各种其它材料可以作为包衣存在或改变剂量单位的物理形式。例如，片剂可以用虫胶、糖或两者包衣。除了活性成分之外，糖浆可以含有作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂如樱桃或橙子味道。

对于口服治疗性施用，活性成分可与赋形剂一起掺入，并以片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆等形式使用。

本发明的活性成分可以口服施用，例如用惰性稀释剂或可吸收的可食用载体，或者它们可以包封在硬壳或软壳胶囊中，或者它们可以压制成片剂，或者它们可以直接掺入饮食的食物中。

适合于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，形式应该是无菌的，并且应该就存在易于注射性来说是液体的。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且应该防止微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇)、其合适的混合物和植物油的溶剂或分散介质。

对于作为气雾剂使用，溶液或悬浮液中的本发明的活性成分可与合适的推进剂一起包装在加压气雾剂容器中，合适的推进剂例如烃类推进剂如丙烷、丁烷或异丁烷与常规佐剂。本发明的材料也可以以非加压形式施用，例如在喷雾器(nebulizer)或雾化器(atomizer)中。

当施用本发明的活性成分及其药物组合物时，它们可以被全身施用，或者可选地，它们可以被直接施用于特定部位。因此，施用可以以对于将其活性成分或药物组合物递送到特定靶细胞有效的任何方式来完成。示例性施用方式包括但不限于将其活性成分及组合物口服、局部、透皮、胃肠外、皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内滴注、腔内或膀胱内滴注、眼内、动脉内、病灶内或通过应用于粘膜，例如鼻、喉和支气管的粘膜。

本文所述的肽的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如通过测定IC50(提供50％抑制的浓度)和LD50(致死剂量引起50％的被测动物死亡)。通过这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。剂量可以根据使用的剂型和使用的施用途径而变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医师鉴于患者状况选择。(参见例如Fingl等，1975，The Pharmacological Basis ofTherapeutics，Ch.1p.1，其内容通过引用整体并入本文)。

取决于要治疗的状况的严重性和反应性，施用也可以是单次施用缓释组合物，治疗过程持续数天至数周或直到实现治愈或达到疾病状态的减退。

待施用的组合物的量当然将取决于所治疗的受试者、痛苦(affliction)的严重性、施用方式、处方医师的判断以及所有其它相关因素。通过本领域技术人员已知的方法确定待施用的确切剂量。

还应当理解，本发明的活性成分可以根据需要与另外的活性成分一起配制或施用以治疗患者的状况。

可选地，技术人员可以以局部而非全身方式施用组合物，例如通过将包含活性成分(和生理上可接受的载体)的组合物直接注射到患者的组织区域(例如，感染皮肤或感染皮肤周围的健康皮肤)。

组合物的合适施用途径可以包括例如眼部(例如到眼睛)，局部(例如到角质组织，例如皮肤、头发、指甲、头皮)、透皮、皮下、肺和口服(例如嘴部)施用。

根据实施方案，本发明的组合物以局部、肺部(例如通过吸入)、口服或眼部施用。

如本文所用，短语“皮肤施用”是指将本发明的组合物施用或扩散到身体的表面，即皮肤、头皮、头发、指甲等，优选地在受感染影响的表面上。

如本文所用，短语“透皮施用”是指将本发明组合物透过皮肤施用以进行全身施用(例如通过透皮贴剂或通过透皮植入物)。透皮施用通常在感染部位附近进行，然而，透皮施用可以在本领域普通技术人员认为合适的任何解剖学位置进行。

如本文所用，短语“皮下施用”是指将本发明的组合物施用于皮肤下(即完全埋在皮肤中，例如通过皮下植入物)。皮下施用通常在感染部位附近进行，然而，皮下施用可以在本领域普通技术人员认为合适的任何解剖学位置进行。

本发明的组合物可以通过本领域熟知的方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或冻干方法。

因此，根据本发明的一些实施方案使用的组合物可以使用包含赋形剂和辅助剂(auxiliaries)的一种或更多种生理上可接受的载体以常规方式配制，赋形剂和辅助剂有助于将活性成分加工成可用于化妆品或药学上的制品。适当的制剂取决于所选择的施用途径。

此外，剂量可以配制为在组织培养系统(例如离体系统)或动物模型中实现所需的浓度或滴度。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。例如，可以通过确定受炎症状态影响的受试者中施用组合物之前和之后的炎症水平来评估治疗有效量[例如，通过使用血液检查例如全血细胞计数(CBC)，通过观察皮肤伤口等]。

本文所述的活性成分的毒性和治疗效力可以通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药物程序来确定。从这些体外和细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。剂量可以根据使用的剂型和使用的施用途径而变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医师鉴于患者的状况，选择。(参见例如Fingl，E.等(1975)，“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1，p.1)

取决于情况的严重性(例如，感染的面积、深度和程度)和受试者对治疗的反应，给药可以是单次或多次施用，治疗过程持续数天至数周、数月或数年，或直至实现治愈或达到感染减退。可选择地，施用组合物以防止处于发生感染风险的受试者(例如患有慢性炎性疾病的受试者)中感染的发生。组合物可以长时间施用(例如几天、几周、几个月或几年)以防止感染的发生。

根据本发明的实施方案，本发明的组合物每天至少施用一次。根据另一个实施方案，组合物每天施用两次、每天施用三次或更多次。

根据本发明的实施方案，施用是长期进行的。

根据另一个实施方案，施用至少约10天、12天、14天、16天、18天、21天、24天、27天、30天、60天、90天或更久。

待施用的组合物的量当然将取决于所治疗的受试者、痛苦的严重程度、施用方式、处方医师的判断等。

本发明的组合物可以配制成单位剂型。以这种形式，制剂被细分为含有适量的活性成分的单位剂量，例如用于单一施用。单位剂型可以是包装的制剂，包装包含分散量的制剂，例如安瓿、分配器(dispender)、粘合绷带、非粘性绷带、擦巾、婴儿擦巾、纱布、垫和卫生巾(sanitary pad)。

另外的因子可以并入本发明的组合物中(即如上所述的植物提取物)。这些包括但不限于细胞外基质组分(例如玻连蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白)、生长因子(例如FGF1、FGF2、IGF1、IGF2、PDGF、EGF、KGF、HGF、VEGF、SDF-1、GM-CSF、CSF、G-CSF、TGFα、TGFβ、NGF和ECGF)、生长因子[例如促红细胞生成素、成纤维细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)]、激素(例如胰岛素、生长激素(GH)、CRH、瘦蛋白、催乳素和TSH)、血管生成因子(例如血管生成蛋白(angiogenin)和血管生成素(angiopoietin))，凝血和抗凝因子[例如因子I、因子XIII、组织因子、钙、vWF、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤连蛋白、抗凝血酶、肝素、纤溶酶原、低分子量肝素(Clixan)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)、纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)、尿激酶、血栓调节素、组织纤溶酶原激活物(tPA)、α2-抗纤维蛋白溶酶和蛋白Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)]、细胞因子抑制剂(例如环孢菌素A；α-2-巨球蛋白、戊烷脒、己酮可可碱、地塞米松)、趋化因子抑制剂(例如肽3(Peptide 3)、NR58.3-14-3)、酶(例如内切糖苷酶、外切糖苷酶、内切核酸酶、外切核酸酶、肽酶、脂肪酶、氧化酶、脱羧酶、水化酶、软骨素酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、透明质酸酶、角质素酶、乙酰肝素酶(heparanase)、乙酰肝素酶剪接变异(heparanase splice variance)、胶原酶、胰蛋白酶、过氧化氢酶)，神经递质、神经肽(如P物质)、维生素(例如D-生物素、氯化胆碱、叶酸、肌醇、烟酰胺、D-泛酸、钙盐、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、维生素E、维生素C、维生素D、维生素B1-6、维生素K、维生素A和维生素PP)、碳水化合物(如单糖/双糖/多糖，包括葡萄糖、甘露糖、麦芽糖和果糖)、离子、螯合剂(如Fe螯合剂、Ca螯合剂)、抗氧化剂(例如维生素E、槲皮素(Quarcetin)、超氧化物清除剂、超氧化物歧化酶、H2O2清除剂、自由基清除剂、Fe清除剂)、脂肪酸(例如甘油三酯、磷脂、胆固醇、游离脂肪酸和非游离脂肪酸、脂肪醇、亚油酸、油酸和硫辛酸)、抗生素(例如青霉素、头孢菌素和四环素)、氨基酸(例如必需和非必需的(从A-Z)，特别是谷氨酰胺和精氨酸)、盐(例如丙酮酸盐(prurivat)和硫酸盐)、硫酸盐(如硫酸钙)、类固醇(例如雄激素、雌激素、孕激素、糖皮质激素和盐皮质激素)、止痛剂、麻醉剂、抗细菌剂、抗酵母剂、抗真菌剂、抗病毒剂、益生剂(pro-biotic agents)、抗原虫剂、抗瘙痒剂(anti-pruritic agents)、抗皮炎剂(anti-dermatitis agents)、抗呕剂(anti-emeticsagents)、抗炎剂、抗过度角化剂(anti-hyperkeratolyic agents)、止汗剂(antiperspirants)、抗脂溢性剂(anti-seborrheic agents)、抗组胺剂、缺氧诱导因子(例如HIF-1α和β和HIF-2)、儿茶酚胺(例如肾上腺素和去甲肾上腺素)、核苷类和核苷酸(例如嘌呤和嘧啶)、前列腺素(例如前列腺素E2)、白三烯(Leucotriens)、红细胞生成素(例如血小板生成素)、蛋白多糖(例如硫酸肝素、硫酸角质素)、羟基磷灰石[如羟磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)]、触珠蛋白(Hp1-1、Hp2-2和Hp1-2)、超氧化物歧化酶(例如SOD 1/2/3)、一氧化氮、一氧化氮供体(如硝普盐(nitroprusside)，Sigma Aldrich，St.Louis，MO，USA、谷胱甘肽过氧化物酶、水合化合物(例如血管升压素)、细胞(例如血小板)、细胞培养基(例如M199、DMEM/F12、RPMI，Iscovs)、血清(例如人血清、胎儿小牛血清(fetal calf serum)、胎牛血清(fetal bovine serum))、缓冲液(例如HEPES、碳酸氢钠)、洗涤剂(例如Tween)、消毒剂、草药、水果提取物、植物提取物(例如卷心菜、黄瓜)，花提取物、另外的植物提取物、类黄酮类(flavinoids)(例如石榴汁)、香料(spices)、叶子(如绿茶、洋甘菊)、多酚(例如红葡萄酒)、蜂蜜、凝集素、微粒、纳米颗粒(lyposomes)、胶束、碳酸钙(CaCO3，如沉淀碳酸钙、研磨/粉碎碳酸钙、albacar、PCC、GCC)、方解石、石灰石、粉碎的大理石、磨碎的石灰石、石灰和白垩(例如增白白垩(whiting chalk)、香槟白垩、法国白垩)。

本发明的制剂还可以含有包括以下的成分、物质、元素和材料：氢、烷基基团、芳基基团、卤素基团、羟基基团、烷氧基基团、烷基氨基基团、二烷基氨基基团、酰基基团、羧基基团、碳酰氨基基团、磺酰胺基基团、氨基酰基基团、酰胺基团、胺基团、硝基基团、有机硒化合物、烃和环状烃。

本发明的制剂可以与诸如过氧化苯甲酰、血管收缩剂、血管扩张剂、水杨酸、视黄酸、壬二酸、乳酸、乙醇酸、丙酮酸(pyreuric acid)、单宁、benzlidenecamphor和其衍生物、α羟基、表面活性剂的物质组合。

本发明的一些实施方案的组合物可以生物缀合到聚乙二醇(例如PEG、SE-PEG)以保持活性成分(即本发明的植物提取物组合物)的稳定性(例如，抗蛋白酶活性)和/或溶解度(例如，在生物液体例如血液、消化液内)，同时保持其生物活性并延长其半衰期。

用于本发明组合物中的载体可以是各种各样的形式。这些包括乳液载体，包括但不限于水包油、油包水、水包油包水(water-in-oil-in-water)、和硅酮包水包油(oil-in-water-in-silicone)乳液、霜剂、软膏、水溶液、洗剂、肥皂、糊剂、乳液、凝胶、喷雾剂或气雾剂。

用于制备具有这种性质的组合物的方法是本领域技术人员公知的，并详细描述于Remington's Pharmaceutical Sciences，1990(同上)中；和Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems，第6版，Williams&Wilkins(1995)。

实施例

实施例1

OMN6与天然天蚕杀菌肽A和BSA相比增强的稳定性。

使用蛋白酶K(ProtK)评估OMN6对比天然天蚕杀菌肽A(CecA)和牛血清白蛋白(BSA)的稳定性(参见图1A)。将10μg的每种蛋白质的指定的5-20ng递增浓度的ProtK在37℃下孵育2小时。样品在100℃煮沸5分钟，并在15％丙烯酰胺凝胶上分离。然后将凝胶用考马斯蓝染色，过夜除去多余的染料。结果清楚地表明20ng的ProtK足以完全降解CecA和BSA(泳道：分别为3、9)。可以看出，OMN6被保护免于ProtK蛋白水解并且没有被降解(泳道：6)。结果还表明，低浓度5ng的ProtK足以部分降解CecA和BSA(泳道：分别为2和8)。在泳道2中，CecA带弱于在泳道1中未处理的样品带。在泳道8中，检测到降解的BSA的片段，是部分降解的证据。OMN6根本没有被ProtK降解。这些结果证明遗传工程化之后的OMN6比其天然形式天蚕杀菌肽A更为稳定。使用与上述相同的实验系统来评估OMN2、OMN7和OMN11对ProtK蛋白水解降解的稳定性(参见图1B)。在每种情况下，如所指出的，结果显示OMN肽没有被ProtK降解。如从对每个肽呈现的条带的相等强度可以看出的，这些肽是稳定的。

实施例2

图2A：OMN6比天然肽天蚕杀菌肽A发挥更强大的抗微生物作用。

进行测定以比较天然肽天蚕杀菌肽A(CecA)与本发明的肽OMN6的抗微生物活性。将大肠杆菌细菌与浓度为12.5μM的CecA或OMN6一起孵育17-20小时。通过分光光度法在600nm处连续监测细菌的生长。随着细菌生长的进展，OD600nm值上升，而当生长受抑制时，OD600nm值保持不变。结果清楚地表明，在浓度为12.5μM的情况下，基因工程肽OMN6具有强大的抗微生物作用，并在实验的整个持续时间内完全抑制细菌生长17小时以上。在较高浓度下，细菌生长也被完全抑制(数据未显示)。相比之下，当细菌在相同的实验条件下与12.5μM的CecA孵育时，对生长没有显著的抑制作用。细菌在10小时后完全克服了CecA的抑制作用。然后，细菌继续繁荣并生长至与对照组相似的密度。这些结果一起有力地表明，OMN6是一种新的并且比天然对应物CecA更强的抗微生物剂。

图2B：OMN6在蛋白酶K存在下是稳定的并保持其有效的抗微生物活性。

评估OMN6/CecA对蛋白水解降解的易感性，并确定稳定性对活性的影响。将天然肽-CecA和工程肽-OMN6与20ng蛋白酶-K(ProtK)在37℃下孵育2小时(分别为左侧柱和右侧柱)。以500,000CFU/ml的大肠杆菌与用ProtK预处理的CecA或OMN6孵育18小时。孵育后，通过OD600nm处的吸光度和通过琼脂平板上的CFU计数确定细菌存活。

如图2A所示的结果表明，遗传工程化的肽OMN6是比天然形式CecA更强的抗微生物剂。CecA对细菌生长的抑制在10个小时后被克服，而OMN6抑制生长持续超过17小时。此外，OMN6的作用具有杀细菌性质，因为当将在本实施例中详述的实验组铺板时没有菌落存在。最重要的是，CecA容易受到ProtK的蛋白水解，并由于这种降解而丧失其抗细菌活性。很明显，用ProtK处理2小时的CecA已经丧失了其杀死细菌的能力。在12.5μM的CecA中，细菌能够生长到超过CTRL-对照组(未处理的细菌组)(左侧柱)的70％。当用20ng的ProtK处理OMN6时，OMN6没有降解；相反，OMN6是稳定的并且没有失去其抗细菌活性。在12.5μM的OMN6下，细菌生长被抑制到小于CTRL组的10％(右侧柱)。

实施例1和2强调了OMN6是稳定的肽。即使在与强力蛋白酶(如ProtK)一起孵育后，OMN6也是有效的抗微生物剂。相比之下，易于蛋白水解的天然肽CecA在与ProtK孵育后被蛋白酶降解并且丧失其抑制生长或杀死细菌的能力。

实施例3

OMN6处理导致细菌细胞溶解和GFP从细胞向周围培养基的渗漏。

为了确定和评估多肽达到显著抗微生物效果的作用机理(MOA)，进行了以下实验：GFPuv大肠杆菌细菌是诱导后表达绿色荧光蛋白(GFP)的菌株。GFP荧光可以在395/509nm处检测，而活细菌可以通过600nm的吸光度(OD600)检测。

GFPuv大肠杆菌细菌诱导后在其细胞质中普遍表达GFP，并且该荧光蛋白可被检测和可视化。细菌生长并被诱导表达GFP 3小时，然后用双蒸水(DDW)或OMN6处理细菌并孵育30分钟(分别为图3A和图3B)。此时，通过显微镜(x60Olympus透镜)在紫外光下成像细菌。在使用DDW处理的CTRL组中，细菌显然没有受到伤害。所有的细菌都是活的、完整的、且没有GFP从细胞内部渗漏到外部培养基的证据(图3A)。当大肠杆菌GFPuv细菌用50μM OMN6 50处理30分钟时，GFP从细胞的细胞质大量渗漏到外部培养基(图3B)。由于GFP是238个氨基酸残基的蛋白质(26.9kDa)，因此该蛋白质是一种大的蛋白质，当质膜完整时，它不能从细胞中渗漏出。显然，OMN6穿透膜并导致形成孔，GFP能通过这些孔渗漏。这些孔的形成构成了导致细菌死亡的物理损伤。与小分子抗生素相比，细菌不能对其质膜中孔形成的物理干扰产生耐药性。

在另一个实验中，细菌生长并诱导表达GFP。用DDW(用于CTRL)或用OMN6处理细菌。然后将细菌离心(5000RPM，持续5分钟)，将沉淀物与生长培养基上清液分离(参见图4A)。将两个实验组CTRL和OMN6的上清液(sup)与沉淀物分离，并分析荧光单位(FU)的水平(参见图4B)。结果清楚地表明，在CTRL组中，细菌仍然不受伤害，完整的细菌细胞保留所有的GFP。仅在浓缩在管底部沉淀物中的细菌的内部检测到荧光。在用OMN6 50μM处理30分钟的组中，细菌经历了大量的裂解，结果是GFP从细胞中渗漏出来，因此在周围的培养基中发现。通过600nm处的吸光度探测两个上清液是否存在细菌，并且两个上清液都完全没有细菌细胞(数据未显示)。该实验背后的理由是，在上清液不含细菌细胞的情况下，如果肽引起细菌细胞裂解，则会导致GFP从细胞中渗漏到生长培养基。因此，在对照组中，在细菌完整的情况下，在上清液中没有检测到荧光，而在用OMN6处理的组的上清液中，检测到从裂解的细胞中渗漏出的GFP。

实施例4

OMN2、OMN6、OMN7和OMN11对HEK293细胞不存在细胞毒性作用。

人类胚肾293细胞(HEK293)是广泛接受的用于评估潜在有害物质不良反应的模型细胞系的人源细胞。将HEK293细胞培养至80％汇合，并引入浓度递增的OMN2、OMN6、OMN7和OMN11。CTRL组用DDW处理。

24小时后，对所有实验组进行亚甲蓝测定，以评估和测定细胞存活。在所有组中没有观察到细胞形态或存活的显著变化(图5A-D)。

实施例5

OMN6对人原代红细胞(Human Primary Erythrocyte)不存在细胞毒性作用。

由于本发明的肽意图特别用于在伤口或其他受损组织中操作，因此可能发生与患者血液的直接接触。因此，进行实验以评估OMN6是否对人原代红细胞具有细胞毒性作用。这些细胞缺乏任何防御机制来保护它们免受对质膜的损伤，因此是用于评价对真核细胞的细胞毒性作用的标准模型。测量的参数是OMN6在人类红细胞中引起溶血、红细胞死亡的能力。使用医院人员常规用来进行此类测试的ABX PENTRA DF120仪器对人体血液样品进行实验。结果表明，细胞溶血没有发生。红细胞没有由于与OMN6接触而死亡。在任何实验组中，实验开始时的细胞数量在实验的整个持续时间内未发生变化，并且细胞数/mm1在CTRL组和实验组之间没有变化(表4)。

红细胞的平均红细胞体积(Mean Corpuscular Volume，MCV)是细胞健康和膜完整性的公认指标。进行实验以评估在细菌膜中形成孔的OMN6是否具有损伤人类细胞质膜的能力。如从表5所示的结果可以看出的，OMN6在实验的整个时间内没有引起细胞体积的任何降低。这些结果强烈地表明该肽不会损害真核细胞膜。(表5)。

OMN6肽不靶向人原代红细胞膜和HEK293细胞膜。对于任何肽都没有观察到细胞计数的显著降低或其他副作用。这些结果显示了肽的安全性及其对细菌细胞的高选择靶向性。

表4和表5：用OMN6处理后评估人原代红细胞的溶血和平均红细胞体积(MCV)。用OMN6处理不会引起红细胞溶血。在实验的整个持续时间内，进行细胞计数，对照组和实验组之间的细胞数/ml不变(表4)。

红细胞的平均红细胞体积(MCV)也被确定，MCV值在实验的整个持续时间内没有改变，实验组的MCV值与CTRL组的MCV值没有差异(表5)。

表4：活红细胞数量(细胞*10⁶/ml)

表5：红细胞平均红细胞体积(MCV)

实施例6

OMN肽体外对敏感性和耐药性细菌的最小抑制浓度(MIC)值。

为了测定肽的MIC值，用本发明的肽处理后监测各种细菌的生长和抑制(表6)。大肠杆菌与或不与在0.8-200μM的递增浓度的OMN6，以及有或没有10％胎牛血清下培养17-20小时。通过分光光度法在600nm处监测细菌的生长。随着细菌生长的进展，OD600nm值升高，并且当生长受抑制时，OD600nm值保持不变。

结果清楚地表明在12.5μM的最小抑制浓度(MIC)，基因工程化肽OMN6发挥强大的抗微生物作用，抑制细菌生长17小时，在较高浓度下细菌生长也被完全抑制。当培养基补充10％FBS时，OMN6的MIC值为6.25μM(图6B)。

大肠杆菌NDM1是碳青霉烯耐药性细菌菌株。使用上述实验系统来测定OMN6对这种细菌的抗微生物作用，与碳青霉烯抗生素家族成员的抗生素药物亚胺培南(IPM)对比。敏感大肠杆菌对IPM的MIC值为4μg/ml，MIC高于8μg/ml时细菌被认为是耐药性的。图6C清楚地表明，即使IPM浓度增加至64μg/ml，16倍于MIC的值，耐药细菌的生长根本不受抑制。此外，并且该菌株也暴露于128μg/ml，并且生长根本没有受到抑制(数据未显示)。当OMN6 12.5μM被引入系统时，它完全抑制细菌生长(图6D)。

这些结果表明，当细菌对特定药物发展耐药性时，即使在高浓度下，该药物也不再有效。这种药物不能再用于治疗目的，因为它已经失去了杀死耐药性细菌的能力。针对特定抗生素药物或针对多种抗生素药物的细菌耐药性不影响其对本发明的抗微生物肽的易感性。

使用本文所述的实验系统和参数来确定OMN2、OMN6、OMN7和OMN11对各种细菌菌株的MIC值(表7和表8)。

表6细菌菌株

表7 MIC值(μM)的总结

实施例7

OMN肽体外对敏感性和耐药性细菌的最小杀细菌浓度(MBC)值。

为了确定肽的最小杀细菌浓度(MBC)值，监测并确定用本发明的肽处理后各种细菌菌株的菌落形成。如图6和实施例6详述的，多药耐药鲍氏不动杆菌与或不与递增浓度的OMN6培养。随后，每个实验组的样品根据需要稀释至1×10⁴至1×10⁶，将样品铺板在合适的培养基琼脂平板上。将所有的板在37℃下孵育24-48小时。计数菌落数，并计算和测定铺板前原始样品中的CFU/ml。孵育后的一个板的实例示于图7中，其中图像左侧的板是用DDW处理的CTRL样品，并且在图像右侧呈现OMN6的递增浓度，如其中所指出的。结果显示，CTRL组中细菌大量生长，在CTRL以及OMN6浓度为0.62μM和1.25μM组时均未检测到生长抑制。在用2.5μM、5μM和10μM OMN6处理的组中，平板是透明的，即没有菌落。

这些结果清楚地表明了OMN6的抗微生物作用。此外，MIC值(图6和实施例6)与MBC值非常相似(图7和实施例7)的事实指出了本发明的OMN肽的杀细菌作用。细菌的生长不仅被抑制，而且细菌在与肽接触后被杀死。

使用这里描述的实验系统和参数来确定在有和没有补充10％FBS下OMN2、OMN6、OMN7和OMN11对各种细菌菌株的MBC值(表6和表8)。

表8 MBC值(μM)的总结

上面详细描述的MIC实验和MBC实验的组合结果表明本发明的OMN肽是高效抗微生物剂。用OMN肽处理直接导致抗性细菌菌株的死亡。MIC和MBC值相同的事实表明强烈而快速的杀细菌效果。这种杀细菌作用降低了抗性发展的发生以及耐受性的几率。

实施例8

OMN6抗微生物肽在小鼠模型中的初步安全性。

向小鼠施用抗微生物肽OMN6，以评估和定量是否存在毒性作用。OMN6肽(C₁₉₅H₃₃₂N₅₆O₄₉S₃)根据表9中详述的浓度和组进行局部施用。

表9 OMN6小鼠初步局部安全实验概述

批准用于本实验的小鼠：远交Hsd:ICR()-重量18-20g。在剃毛后，将作为假处理的盐溶液(0.9％NaCl)或溶解于盐水中的OMN6直接施用于小鼠皮肤上。每只动物施用总体积16μ1。在本实验中，本发明的肽OMN6以四种不同浓度(mg/kg)的单次剂量施用。与假处理(对照)组相比，监测所有实验组中小鼠的死亡。处理后的食物和水消耗量通过每两天一次的个体体重测量监测。在实验结束时，从所有动物采血并分离出200μl血液，分析血浆中的红细胞溶血。

实验图：

1.根据组的说明(表9)，在第1天对小鼠(每组6只)给予单剂量施用。在处理后持续4天监测所有组中小鼠的食物和水消耗(体重分析)以及死亡率。在5天试验结束时，处死动物。

2.在第5天对所有组的所有样品进行游离Hgb(血红蛋白)测定，用于红细胞溶血分析。

3.整个5天试验期间，各组水/食物供应、温度及其他条件保持不变。

4.通过血红蛋白测定试剂盒(Sigma-Aldrich，3Plaut St.Rhovot，Israel)进行红细胞溶血分析。

局部施用实验的结果清楚地表明，OMN6在局部施用时没有发挥任何毒性或其它副作用。在整个5天的实验中，在任何组中没有观察到死亡。在整个5天的实验中，在任何组中没有观察到诸如腹泻、血性腹泻、毛发竖立(stand-on-end hair)、冷漠或不安的临床症状。在整个5天的实验中，在任何组中没有观察到体重减轻，此外，在所有的笼中，动物以正常速率增加体重。

在任何实验组中没有观察到红细胞溶血的证据。结果强烈地表明肽是高度特异性的并且仅靶向细菌细胞而根本不损害真核细胞膜。

OMN6的IP施用：OMN6对小鼠IP施用，以评估和定量任何毒性作用(如果存在)。OMN6肽根据表10中详述的浓度和组进行腹膜内注射。

表10 OMN6小鼠实验初步IP安全性概述

用于本实验的小鼠：远交Hsd:ICR()-重量18-20g。将作为假处理的补充4mM C₂H₃NaO₂(醋酸钠)的盐溶液(0.9％NaCl)或溶解于盐水中的OMN6按表9所述施用。每只动物施用100μl的总体积。与假处理(CTRL)组相比，监测实验组中小鼠的死亡。处理后的食物和水消耗量通过每两天一次的个体体重测量监测。在实验结束时，从所有动物采血，并分离出200μl全血，分析血浆中的红细胞溶血。

实验图：

1.根据组的说明(表10)，在第1天对小鼠(每组6只)给予单剂量施用。在处理后持续3天监测所有组中小鼠的食物和水消耗(体重分析)以及死亡。在4天试验结束时，处死动物。

2.在第4天对所有组的所有样品进行游离Hgb(血红蛋白)测定，用于红细胞溶血分析。

3.整个4天试验期间，各组水/食物供应、温度及其他条件保持不变。

结果清楚地表明OMN6在IP施用到小鼠中时没有发挥任何毒性或其它副作用。在整个4天的实验中，在任何组中没有观察到死亡。在整个4天的实验中，在任何组中没有观察到诸如腹泻、血性腹泻、毛发竖立(stand-on-end hair)、冷漠或不安的临床症状。在整个4天的实验中，在任何组中没有观察到体重减轻，此外，在所有的笼中，动物以正常速率增加体重。

结果说明本发明的肽是安全的。在任何实验组中没有观察到红细胞溶血的证据。进行组织学分析(数据未显示)。在任何实验组中没有观察到病理变化或异常的证据。

实施例9

OMN6对小鼠模型的皮下大肠杆菌感染的效力。

动物：使用体重16-20g的健康成年雌性小鼠。所有实验都使用了CD-I远交系(Harlan Breeding Labs，Jerusalem，Israel)。动物以5-10只一组在笼中饲养，并随意取用食物(Ralston Purina)和水。

细菌：大肠杆菌(ATCC BAA-198)是广谱β-内酰胺酶(ESBL)TEM-26多药耐药菌株。贮存培养物在胰酶大豆液体培养基(Tryptic Soy Broth,TSB)(Becton，Dickinson andBD.Maryland，USA)中在37℃生长。在TSB-琼脂(BD)上孵育24小时后，对菌落进行计数，并且结果以菌落形成单位(CFU/ml)表示。

接种物：将所有培养液通过加入TSB至50μl的最终体积调节至1×10⁸CFU/动物的攻击剂量(challenge dose)。细菌通过29号针头封盖的结核菌素注射器皮下(SC)注射施用。受体动物右肋被剃毛并通过脱毛膏(ORNA19，Isreal)脱毛。为了注射接种物，将针插入胸椎侧向并且刚好在右后肢的皮下1cm处。针在皮下1cm向前移动；然后注射50μl的接种物。在1小时后，OMN6肽以8mg/kg、总体积为80μ1注射到同一区域。所有动物在该操作后2-4小时内显示良好且完全活跃。监测所有动物在实验的整个5天持续时间内的食物和水消耗、死亡和任何其他不良反应。

细菌负荷评估：切开2cm²的皮肤区域，用无菌手术刀刮去脓肿所在的内侧。刮去的组织通过40μm细胞过滤器过滤。收集过滤的物质，以500RPM离心2分钟，并将来自上清液的样品铺板于TBS-琼脂平板上，37℃下持续24小时。然后计数菌落，并且结果以CFU/脓肿呈现(参见图10A)。

评估脓肿：在第5天评估动物的脓肿的存在和大小。将动物麻醉(氯胺酮225mg/kg/赛拉嗪6mg/kg BW IP)，通过无菌技术轻轻暴露右后肋区域。记录脓肿，然后用卡尺测量：将最长直径(D)和相应垂直直径(d)的乘积确定为以mm²表示的“脓肿大小”(D×d)结果(见图10B)。

结果：图10A：在接种细菌并用盐水假处理的动物组中发现的细菌负荷为：300CFU/小鼠

在接种细菌并用8mg/kg的OMN6处理的动物组中发现的细菌负荷为20CFU/小鼠。

结果显示细菌负荷减少了93.3％，表明OMN6在体内具有很强的抗微生物作用。5天之后进行测量的事实表明OMN6具有强大和快速的杀细菌作用，导致几乎所有被引入小鼠的细菌直接死亡。总之，单剂量的OMN6足以消除细菌，显著减少细菌负荷和脓肿的形成。因此，很明显，OMN6在体内是有效的，并具有长期的杀细菌性质的效果。

图10B：在接种细菌并用盐水假处理处理的动物组中发现的脓肿的平均大小为35.25mm²

在接种细菌并用8mg/kg的OMN6处理的动物组中发现的脓肿的平均大小为7.25mm²

结果显示脓肿大小减少了80％，表明OMN6在体内具有很强的抗微生物作用。此外，5天之后进行测量的事实表明OMN6具有强大且快速的杀细菌效果，导致所有引入小鼠的细菌的直接死亡。

序列表

<110> 欧姆尼克斯医疗有限公司

尼夫·巴克诺夫

摩西·科恩-库特纳

<120> 抗微生物肽

<130> P-79517-PC

<150> 62/119,186

<151> 2015-02-22

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

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<212> PRT

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<213> Manduca sexta

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<213> Hyalophora cecropia

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<213> Antheraea pernyi

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<213> Hyalophora cecropia

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<212> PRT

<213> Bombyx mori

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<212> PRT

<213> Bombyx mori

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<212> PRT

<213> Antheraea pernyi

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Asn Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Leu Gly Glu Ala

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<213> Drosophila melanogaster

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<213> Sus scrofa domesticus

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<211> 129

<212> DNA

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atgtgcggct ggctgaaaaa aattggcaaa aaaattgaac gcgtgggcca gcatacccgc 60

gatgcgacca ttcagggcct gggcattgcg cagcaggcgg cgaacgtggc ggcgaccgcg 120

cgcggctgc 129

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<212> DNA

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atgtgcaaat ggaaagtgtt taaaaaaatt gaaaaaatgg gccgcaacat tcgcaacggc 60

attgtgaaag cgggcccggc gattgcggtg ctgggcgaag cgaaagcgct gggctgc 117

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atgtgctgga acccgtttaa agaactggaa cgcgcgggcc agcgcgtgcg cgatgcggtg 60

attagcgcgg cgccggcggt ggcgaccgtg ggccaggcgg cggcgattgc gcgcggctgc 120

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atgtgctgga acccgtttaa agaactggaa aaagtgggcc agcgcgtgcg cgatgcggtg 60

attagcgcgg gcccggcggt ggcgaccgtg gcgcaggcga ccgcgctggc gaaaggcaaa 120

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atgtgctgga acccgtttaa agaactggaa cgcgcgggcc agcgcgtgcg cgatgcgatt 60

attagcgcgg gcccggcggt ggcgaccgtg gcgcaggcga ccgcgctggc gaaatgc 117

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atgtgcaaat ggaaactgtt taaaaaaatt gaaaaagtgg gccagaacat tcgcgatggc 60

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tgc 123

<210> 29

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<212> DNA

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attgtgaaag cgggcccggc ggtggcggtg gtgggccagg cggcgaccat ttgc 114

<210> 30

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attgtgaaag cgggcccggc gattgaagtg ctgggcagcg cgaaagcgat tggcaaatgc 120

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atgtgcaaat ggaaaatttt taaaaaaatt gaaaaagtgg gccgcaacat tcgcaacggc 60

attattaaag cgggcccggc ggtggcggtg ctgggcgaag cgaaagcgct gtgc 114

<210> 32

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<212> DNA

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<223> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgtgcagcg aagcgggctg gctgaaaaaa attggcaaaa aaattgaacg cgtgggccag 60

catacccgcg atgcgaccat tcagggcctg ggcattgcgc agcaggcggc gaacgtggcg 120

gcgaccgcgc gcggctgc 138

<210> 33

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

atgtgcagct ggctgagcaa aaccgcgaaa aaactggaaa acagcgcgaa aaaacgcatt 60

agcgaaggca ttgcgattgc gattcagggc ggcccgcgct gc 102

Claims

1.一种肽，包含：核心氨基酸序列，所述核心氨基酸序列与天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列相同或相似，其中所述核心氨基酸序列在N-末端通过N-末端基团延伸和/或在C-末端通过C-末端基团延伸；并且其中所述N-末端基团和/或所述C-末端基团相同或不同或不存在，且能够形成共价键以经由分子间共价连接形成环肽或同型多聚体组装物。

2.根据权利要求1所述的肽，其中所述天蚕杀菌肽家族成员属于AMP CM_IV、天蚕杀菌肽A、天蚕杀菌肽B、天蚕杀菌肽B2、天蚕杀菌肽D、天蚕杀菌肽IA和天蚕杀菌肽P1的组。

3.根据权利要求1所述的肽，其中所述环肽具有拓扑结构，其中所述拓扑结构是头对尾、侧链对侧链、头对侧链或侧链对尾或主链对主链或侧链对主链或头对主链或尾对主链。

4.根据权利要求1所述的肽，其中所述共价键在氧化和/或酸性生理条件下形成。

5.根据权利要求1所述的肽，其中所述天蚕杀菌肽家族成员的氨基酸序列包括17-144个氨基酸。

6.根据权利要求1所述的肽，其中所述天蚕杀菌肽家族成员的核心氨基酸序列如SEQID No.12-22所列。

7.根据权利要求1所述的肽，其中所述核心氨基酸序列与SEQ ID No.12-22所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性。

8.根据权利要求1所述的肽，其中所述核心氨基酸序列包括在一个或更多个位置的取代、保守氨基酸取代、保守修饰的序列变体、缺失和/或插入。

9.根据权利要求1所述的肽，其中所述C-末端基团和/或所述N-末端基团包括以下的一个或更多个：半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的基团的氨基酸序列、或其任何组合。

10.根据权利要求1所述的肽，其中所述C-末端基团和/或所述N-末端基团各自选自由半胱氨酸、半胱氨酸衍生物、含有半胱氨酸或包括硫醇部分的任何其他基团的氨基酸序列组成的组。

11.根据权利要求1所述的肽，其中所述N-末端基团包括氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且所述C-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。

12.根据权利要求1所述的肽，其中所述C-末端基团包含氨基酸序列甲硫氨酸-半胱氨酸、甲硫氨酸-半胱氨酸衍生物、甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸或甲硫氨酸衍生物-半胱氨酸衍生物，并且所述N-末端基团是半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。

13.根据权利要求1所述的肽，其中所述共价连接是二硫键。

14.根据权利要求1所述的肽，其中所述共价连接是酰胺、内酰胺或肽键。

15.根据权利要求1所述的肽，其中所述N-末端基团和所述C-末端基团共价结合以形成环肽。

16.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽在生理膜内自组装，使得在所述肽的N-末端基团和另外的相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价连接，或其中所述肽的C-末端基团和另外的相同肽的N-末端或C-末端基团之间形成分子间共价连接。

17.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽如SEQ ID No.1-11中任一项所列。

18.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽具有与SEQ ID No.1-11所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性的氨基酸序列。

19.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽如SEQ ID NO：6所列。

20.根据权利要求1所述的肽，其中所述肽具有与SEQ ID NO：6所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性的氨基酸序列。

21.一种核酸序列，所述核酸序列编码权利要求1-20中任一项所述的肽。

22.一种载体，所述载体包含权利要求21所述的核酸。

23.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-20中任一项所述的肽或权利要求21所述的核酸。

24.一种治疗感染的方法，所述方法包括将权利要求1-20中任一项所述的肽或权利要求23所述的药物组合物施用于对其有需要的受试者。

25.利用根据权利要求1-20所述的肽或权利要求23所述的药物组合物在制备用于治疗受试者感染的药物中的用途。

26.根据权利要求24所述的方法或权利要求25所述的用途，其中所述感染是细菌、病毒和/或真菌感染。

27.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物为液体、霜剂、凝胶、糊剂、粉末、乳剂、软膏、搽剂、洗剂、透皮系统、注射液、悬浮液、贴片剂或喷雾剂的形式。

28.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述药物组合物为胶囊或片剂的形式。

29.根据权利要求21所述的组合物或权利要求1-18所述的肽，其中所述组合物或所述肽与一种或更多种另外的抗炎活性剂联合施用。

30.一种克服微生物对抗生剂的固有的或者获得性的耐药性的方法，包括：使所述微生物与权利要求1-20中任一项所述的肽或权利要求23所述的药物组合物接触。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella Pneumoniaea)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、伤寒血清型沙门氏菌(Salmonella serotype Typhi)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)spp.的成员、假单胞菌属(Pseudomonas)spp.的成员、沙门氏菌属(Salmonella)spp.的成员或不动杆菌属(Acinetobacter)spp.的成员，或其任何组合。

32.一种消毒伤口的方法，包括使伤口与根据权利要求1-20所述的肽或权利要求23所述的药物组合物接触。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述伤口是水疱创伤、软组织创伤、皮肤脓肿、手术创伤、缝合撕裂、污染撕裂、烧伤、褥疮、郁积性溃疡、腿部溃疡、足部溃疡，静脉性溃疡、糖尿病性溃疡、缺血性溃疡、压迫性溃疡、口腔感染、牙周病、二度烧伤或三度烧伤。