CN115814106A - 一种高亲和性包合肽制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高亲和性包合肽制剂，先采用硫辛酸修饰短肽，再基于环糊精与硫辛酸的主客体作用形成环糊精‑短肽超分子包合物；其中，短肽序列包含精氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或谷氨酸中的一种或几种的组合。本发明还公开了上述高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体为：先制备硫辛酸修饰的短肽；再将制得的短肽加入溶剂中，配制成短肽溶液；配制环糊精水溶液，将环糊精水溶液与短肽溶液混合，超声3～8小时，得到包合肽制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种高亲和性包合肽制剂，还涉及上述包合肽制剂的制备方法。
背景技术
环糊精(cyclodextrins，CDs)是通过淀粉酶促转化获得的天然化合物，是无毒的环状寡糖。它们看起来像截短的锥体，由六个、七个或八个吡喃葡萄糖单元组成，它们分别对应于α-、β-和γ-环糊精。天然的CDs通过分子间氢键形成纳米和微米聚集体，聚集体尺寸大小随着CDs的浓度增加而增大。环糊精的疏水内腔允许通过主客体对疏水和几何相容分子进行分子包合，形成包合物(inclusion compounds，ICs)；另一方面，环糊精的外部有许多羟基基团具有高度亲水性。环糊精的这些结构几何形状和特性为包合化合物提供了耐氧、防光保护以及控释性能。范德华相互作用，静电相互作用以及氢键，是形成ICs的主要驱动力。形成包合物的各种主客体包合方法有很多，例如共结晶、共沉淀、共研磨、共蒸发、喷雾干燥、冷冻干燥、密封加热、使用超临界二氧化碳或超声的方法包合，以获得基于固体环糊精的主客体包合物。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)通常由10到大约50个氨基酸残基组成，总体带正电荷。AMPs杀死细菌的能力通常取决于它们与细菌膜或细胞壁相互作用的能力，AMPs表现出净正电荷和高比例的疏水氨基酸，使它们能够选择性地与带负电荷的细菌膜结合，从而杀死细菌，同时大多数抗菌肽主要是通过影响细菌的细胞膜来发挥作用，细菌必须要改变其细胞膜的组成和结构，这会对菌体本身造成严重损害，因此抗菌肽独特的抗菌机制使其不易引起细菌的耐药性，可单独使用或与抗生素联合使用来杀死病原体。基于阳离子结构的工程化短肽往往含有双亲性结构，其疏水区域会与脂质结合，这也会导致溶血的产生。现有方法在对抗菌肽进行亲和性和生物相容性改善时，其水溶性、亲和性和生物相容性的提升并不明显。
发明内容
发明目的：本发明目的旨在提供一种亲和性和生物相容性良好的包合肽制剂，本发明另一目的旨在提供上述包合肽制剂制备方法。
技术方案：本发明所述的高亲和性包合肽制剂，先采用硫辛酸修饰短肽，再基于环糊精与硫辛酸的主客体作用形成环糊精-短肽超分子包合物；其中，短肽序列包含精氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或谷氨酸中的一种或几种的组合。
其中，硫辛酸嵌入环糊精疏水内腔中形成的环糊精-短肽超分子包合物的粒径为20～70nm。
其中，所述短肽序列至少包含精氨酸、赖氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸或谷氨酸中的一种或几种的组合。
其中，所述环糊精为β-环糊精、甲基-β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或其衍生物中的一种或几种的组合。
其中，所述包合肽制剂在水中的溶解度大于6mg/mL。
上述高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)制备硫辛酸修饰的短肽；
(2)将步骤(1)制得的短肽加入溶剂中，配制成短肽溶液；
(3)配制环糊精水溶液，将环糊精水溶液与短肽溶液混合，超声3～8小时，得到包合肽制剂。
其中，步骤(1)中，硫辛酸修饰的短肽采用如下方法制备而成，具体为：先采用Fmoc固相合成法合成短肽，再采用碳二亚胺法偶联短肽和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽。
其中，步骤(2)中，溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇或DMSO中的一种。
其中，步骤(2)中，短肽溶液中，短肽的质量浓度为0.01mg/mL～2mg/mL。
其中，步骤(3)中，环糊精水溶液中，环糊精的质量浓度为0.05mg/mL～2mg/mL；短肽与环糊精的混合质量比为2:1～1:10。
硫辛酸是一种由人体产生的天然抗氧化剂，具有良好的生物相容性、安全性，用硫辛酸修饰阳离子短肽，可以制得两亲性抗菌短肽制剂，
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)本发明基于环糊精与硫辛酸的主客体作用，在水相体系下制备的环糊精-短肽超分子包合物，能够极大的改善抗菌短肽的水溶性和生物相容性，大大降低对正常细胞的毒性，使抗菌肽的应用得到进一步推广；(2)本发明方法制得的环糊精-短肽超分子包合物是基于硫辛酸片段形成的超分子包合物，不会影响短肽本体的生物活性，在不影响生物活性的基础上大大降低短肽制剂对血红细胞的溶血作用，提高血液相容性和细胞相容性。
附图说明
图1为本发明制得的环糊精-短肽超分子包合物的分子结构示意图。
具体实施方式
实施例1
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过9-芴甲氧羰基Fmoc固相合成法合成抗菌短肽RWIVR(按照国际统一命名规则：短肽的氨基端在最左边，羧基端在最右边，按照从左到右的顺序，使用氨基酸英文缩写的第一个字母代表一个氨基酸，例如R表示精氨酸、W表示色氨酸，I代表异亮氨酸，V代表缬氨酸，RWIVR表示精氨酸-色氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-精氨酸，实施例2～6中短肽的命名规则均与实施例1相同)；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽RWIVR和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-RWIVR；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入水中，配制成短肽质量浓度为0.01mg/mL的短肽水溶液；
(4)配制质量浓度为0.05mg/mL的β-环糊精水溶液，并将β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与β-环糊精的质量比2:1进行混合，超声3小时，制得超分子包合肽制剂β-环糊精/LA-RWIVR。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例1的包合肽制剂β-环糊精/LA-RWIVR的溶解度，测得其在水中的溶解度为6.4mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽LA-RWIVR经β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表1，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽LA-RWIVR经β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表1，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表1抗菌肽LA-RWIVR经β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表1可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-RWIVR，实施例1制得的包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％，判定为不溶血。β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表1可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-RWIVR，β-环糊精包合过后的抗菌肽β-环糊精/LA-RWIVR对正常动物纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。β-环糊精的包合处理不仅极大改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
通过双倍稀释法，检验本发明包合肽制剂对多重耐药菌的最小抑菌浓度。以胰蛋白胨大豆肉汤培养基增殖培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。结果显示，RWIVR对MRSA的最小抑菌浓度为32μg/mL，经硫辛酸修饰后，LA-RWIVR的抗菌性能得到改善，最小抑菌浓度为16μg/mL，进一步经β-环糊精包合后最小抑菌浓度不变，为16μg/mL。β-环糊精直接包合RWIVR的抗菌性能最差，最小抑菌浓度为64μg/mL。
本发明中短肽的抗菌性能与其序列结构有关，在不同实施例中存在差别。
实施例2
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过Fmoc固相合成法合成抗菌短肽KKLLKK；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽KKLLKK和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-KKLLKK；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入甲醇中，配制成短肽质量浓度为0.05mg/mL的短肽甲醇溶液；
(4)配制质量浓度为0.05mg/mL的甲基-β-环糊精水溶液，并将甲基-β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与甲基-β-环糊精的质量比1:1进行混合，超声4小时，制得超分子包合肽制剂甲基-β-环糊精/LA-KKLLKK。
通过浊度法和平板涂布法，检验实施例2制得的包合肽制剂的最小抑菌浓度。以Luria-Bertani肉汤培养基增殖培养大肠杆菌，以胰蛋白胨大豆肉汤培养基增殖培养耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。结果显示，实施例2制得的包合肽制剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度为1μg/mL，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为2μg/mL。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例2的包合肽制剂甲基-β-环糊精/LA-KKLLKK的溶解度，测得其在水中的溶解度为7.5mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽经甲基-β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表2，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽经甲基-β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表2，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表2抗菌肽LA-KKLLKK经甲基-β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表2可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-KKLLKK，实施例2制得的包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％。甲基-β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表2可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-KKLLKK，甲基-β-环糊精包合过后的抗菌肽甲基-β-环糊精/LA-KKLLKK对正常动物纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。甲基-β-环糊精的包合处理不仅极大改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例3
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过Boc固相合成法合成抗菌短肽EILLE；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽EILLE和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-EILLE；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入乙醇中，配制成短肽质量浓度为0.1mg/mL的短肽乙醇溶液；
(4)配制质量浓度为0.1mg/mL的羟丙基-β-环糊精水溶液，并将羟丙基-β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与羟丙基-β-环糊精的质量比1:2进行混合，超声5小时，制得超分子包合肽制剂羟丙基-β-环糊精/LA-EILLE。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例3的包合肽制剂羟丙基-β-环糊精/LA-EILLE的溶解度，测得其在水中的溶解度为6.7mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽经羟丙基-β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表3，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽经羟丙基-β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表3，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表3抗菌肽LA-EILLE经羟丙基-β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表3可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-EILLE，实施例3制得的包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％，判定为不溶血。羟丙基-β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表3可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-EILLE，羟丙基-β-环糊精包合过后的抗菌肽羟丙基-β-环糊精/LA-EILLE对正常动物纤维细胞L929的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。羟丙基-β-环糊精的包合处理不仅极大改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例4
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过Boc固相合成法合成抗菌短肽KGGAVV；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽KGGAVV和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-KGGAVV；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入异丙醇中，配制成短肽质量浓度为0.5mg/mL的短肽溶液；
(4)配制质量浓度为0.5mg/mL的β-环糊精水溶液，并将β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与β-环糊精的质量比1:4进行混合，超声6小时，制得超分子包合肽制剂β-环糊精/LA-KGGAVV。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例4的包合肽制剂β-环糊精/LA-KGGAVV的溶解度，测得其在水中的溶解度为6.9mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽经β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表4，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽经β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表4，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表4 抗菌肽LA-KGGAVV经β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表4可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-KGGAVV，包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％，判定为不溶血。β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
实施例5
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过9-芴甲氧羰基Fmoc固相合成法合成抗菌短肽EGWWIVE；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽EGWWIVE和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-EGWWIVE；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入DMSO(二甲基亚砜)中，配制成短肽质量浓度为1.0mg/mL的短肽溶液；
(4)配制质量浓度为1.0mg/mL的甲基-β-环糊精水溶液，并将甲基-β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与甲基-β-环糊精的质量比1:6进行混合，超声3小时，制得超分子包合肽制剂甲基-β-环糊精/LA-EGWWIVE。
通过平板涂布法，检验实施例5制得的包合肽制剂的抗菌性能。结果显示，制得的包合肽制剂与细菌作用30min后，大肠杆菌浓度由5*107±0.04*107CFU/mL降至1.74*102±0.02*102CFU/mL，金黄色葡萄球菌浓度由6.4*107±0.05*107CFU/mL降至1.65*102±0.02*102CFU/mL，白色念珠菌浓度由4.8*106±0.06*106CFU/mL降至2.37*102±0.02*102CFU/mL。本发明的包合肽制剂与细菌接触时，抗菌肽的疏水域插入细菌膜，破坏细胞膜的通透性/完整性，导致菌体破裂死亡，从而达到抗菌效果。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例5的包合肽制剂甲基-β-环糊精/LA-EGWWIVE的溶解度，测得其在水中的溶解度为7.1mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽经甲基-β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表5，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽经甲基-β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表5，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表5抗菌肽LA-ELLE经甲基-β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表5可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-EGWWIVE，实施例5制得的包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％。甲基-β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表5可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-EGWWIVE，甲基-β-环糊精包合过后的抗菌肽甲基-β-环糊精/LA-EGWWIVE对正常动物纤维细胞BHK-21的细胞毒性大幅减小，细胞存活率显著提高。甲基-β-环糊精的包合处理不仅极大改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
实施例6
本发明高亲和性包合肽制剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)通过Boc固相合成法合成抗菌短肽RRIV；
(2)采用碳二亚胺法偶联抗菌短肽RRIV和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽LA-RRIV；
(3)将步骤(2)制得的短肽加入水中，配制成短肽质量浓度为2.0mg/mL的短肽溶液；
(4)配制质量浓度为2.0mg/mL的羟丙基-β-环糊精水溶液，并将羟丙基-β-环糊精水溶液与步骤(3)的短肽溶液按短肽与羟丙基-β-环糊精的质量比1:10进行混合，超声8小时，制得超分子包合肽制剂羟丙基-β-环糊精/LA-RRIV。
通过冷冻干燥与溶解度动态法测量实施例6的包合肽制剂羟丙基-β-环糊精/LA-RRIV的溶解度，测得其在水中的溶解度为7.4mg/mL，表现出高的水溶性。并以血红细胞的溶血实验评价抗菌肽经羟丙基-β-环糊精包合前后的溶血率，结果见表6，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。通过对正常细胞的细胞毒性实验来评价抗菌肽经羟丙基-β-环糊精包合前后的细胞存活率，结果见表6，以未进行包合处理的阳离子抗菌肽为对照组。
表6抗菌肽LA-RRIV经羟丙基-β-环糊精包合前后的溶血率和细胞存活率
由表6可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-RRIV，实施例6制得的包合肽制剂对血红细胞的溶血率大大降低，均小于3％。羟丙基-β-环糊精的外部有许多羟基具有高度亲水性能提高抗菌肽的亲和性，从而大大降低抗菌肽对血红细胞的溶血作用。
由表6可知，相比于未进行包合处理的抗菌肽LA-RRIV，羟丙基-β-环糊精包合过后的抗菌肽羟丙基-β-环糊精/LA-RRIV对正常动物纤维细胞BHK-21的细胞毒性大幅减小，细胞存活率提高。羟丙基-β-环糊精的包合处理不仅极大改善了抗菌肽的水溶性，而且提高了抗菌肽的生物相容性，大大减小了对正常细胞的毒性作用。
Claims (9)
1.一种高亲和性包合肽制剂，其特征在于：先采用硫辛酸修饰短肽，再基于环糊精与硫辛酸的主客体作用形成环糊精-短肽超分子包合物；其中，短肽序列包含精氨酸、赖氨酸、色氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸或谷氨酸中的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述的高亲和性包合肽制剂，其特征在于：硫辛酸嵌入环糊精疏水内腔中形成的环糊精-短肽超分子包合物的粒径为20～70nm。
3.根据权利要求1所述的高亲和性包合肽制剂，其特征在于：所述环糊精为β-环糊精、甲基-β-环糊精或羟丙基-β-环糊精或其衍生物中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的高亲和性包合肽制剂，其特征在于：所述包合肽制剂在水中的溶解度大于6mg/mL。
5.权利要求1所述的高亲和性包合肽制剂的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)制备硫辛酸修饰的短肽；
(2)将步骤(1)制得的短肽加入溶剂中，配制成短肽溶液；
(3)配制环糊精水溶液，将环糊精水溶液与短肽溶液混合，超声3～8小时，得到包合肽制剂。
6.根据权利要求5所述的高亲和性包合肽制剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，硫辛酸修饰的短肽采用如下方法制备而成，具体为：先采用Fmoc固相合成法合成短肽，再采用碳二亚胺法偶联短肽和硫辛酸，得到硫辛酸修饰的短肽。
7.根据权利要求5所述的高亲和性包合肽制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，溶剂为水、甲醇、乙醇、异丙醇或DMSO中的一种。
8.根据权利要求5所述的高亲和性包合肽制剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，短肽溶液中，短肽的质量浓度为0.01mg/mL～2mg/mL。
9.根据权利要求5所述的高亲和性包合肽制剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，环糊精水溶液中，环糊精的质量浓度为0.05mg/mL～2mg/mL；短肽与环糊精的混合质量比为2:1～1:10。
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| CN115814106B (zh) | 2024-03-22 |
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