CN110711182A - 表面修饰的微生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物技术领域，涉及利用生物膜包裹微生物，所述微生物为细菌或真菌；所述的生物膜用于阻隔表面的免疫源性或其他毒副作用物质。

Description

表面修饰的微生物及其制备方法和应用

技术领域

本申请属于生物技术领域，涉及利用生物膜进行微生物表面修饰的方法、制备的细菌及应用，具体地，涉及一种利用生物膜进行微生物表面修饰的方法、通过该方法制备的表面修饰的微生物及其应用。

背景技术

细菌是一种普遍存在的微生物，扮演着维持生态稳定的重要角色，特别是在维持哺乳动物体内稳态和健康。由于细菌的独特优势，例如，可基因编辑，快速繁殖以及疾病部位特别是肿瘤部位易于富集的特点，细菌有潜力成为生物成像、诊断及治疗工具或药物。

目前，在工程改造口服益生菌及细菌介导的疾病治疗方面，本领域技术人员以投入很多研究，但细菌在生物医学上的应用仍然面临一系列问题。首先，在细菌介导的肿瘤治疗方面，虽然有一系列工程细菌已进入I/II期临床试验，但是由于细菌所带来的剂量依赖型毒副作用及较低的治疗效果却是细菌治疗肿瘤道路中无法逾越的绊脚石。再者，在口服益生菌治疗和预防疾病方面，关于肠道微生物对宿主的免疫调节，稳态和健康维持起着极其重要的作用，其紊乱常常与一些疾病相关，例如肥胖症、糖尿病、肠炎以及某些癌症。肠道微生物，特别是益生菌的移植是一种能够预防和治疗相关疾病的有效方法。益生菌能在肠道部位富集，抑制致病菌的定植，正向调节肠道菌群稳态，从而使宿主恢复健康状态。目前口服益生菌制剂主要包括液态，片状、肠溶性包裹、聚合物凝胶以及干粉。尽管这些方法或剂型均能提高口服益生菌的递送效率，但是，由于低生物利用度和肠道停留时间不足所导致的治疗效率低在很大程度上限制肠道微生物向口服治疗药物的临床转化。

一方面，广泛知晓的表面修饰是当前用于提高移植生物材料医疗器械及生物药物在体内应用效果的重要方法之一。大量研究表明，多种合成聚合物、脂质体和生物膜都被用于对无生命力的纳米药物进行表面修饰，以提高其生物相容性、靶向性以及血液循环时间。然而，对于有生命力的细菌型药物，目前的表面修饰主要是依赖各种金属纳米颗粒和靶向分子。然而，遗憾的是这一类表面修饰不能降低细菌所产生的免疫原性，特别是大量细菌静脉注射时所引起的细胞因子风暴，同时也无法避免细菌被网状内皮系统大量吞噬与清除，从而导致生物利用度不足和治疗效果不理想这些固有缺陷。

另一方面，基因改造或者化学修饰拓宽了益生菌的应用，例如，通过基因改造的工程益生菌能够增强细菌的压力耐性，调节疫苗或者药物的递送，直接杀死特异致病菌或者抑制其毒性。而且，利用合成材料的化学表面修饰提高口服益生菌在肠道里面的稳定性。但是，目前，大部分益生菌是多个细菌同时被包裹，只有少数一部分是单细菌包裹，例如层层包裹(layer-by-layer)。这些方法虽然在不同程度上提高了口服益生菌的口服效率，但仍存在无法提高这些细菌在体内的预防和治疗效果，例如，复杂的胃肠环境(包括肠道微生物、药物、饮食、强酸、胆汁酸等)引起的益生菌存活量不足，以及包裹对益生菌在肠道定植的抑制，导致其在肠道停留时间短。此外，繁琐的制备方法和严苛的分离程序也不利于工业上扩大生产。因此，发明人亟需研究一种新的方法克服细菌药物(例如，口服细菌)发展和应用道路上的这些障碍。

考虑到上述细菌介导的治疗体系和纳米药物所存在的不足和缺陷，本申请的发明人创造性地提出利用生物膜对细菌进行表面修饰，以降低细菌产生的毒副作用，增加细菌在血液中的保有量，以及提高细菌在疾病部位的富集，由此提高细菌在成像、诊断或预防或治疗疾病方面的效果。

而且，针对上述目前细菌口服药物发展和应用所存在的问题，本申请的发明人创造性地利用生物膜，例如非天然的生物界面超分子自组装(BiointerfacialSupramolecular Self-Assembly)或天然的细胞膜对微生物细胞表面进行修饰，尤其是细菌或真菌细胞表面，从而获得一种经修饰的微生物，该种简单、方便、快速且安全的方法使微生物(如细菌或真菌)能躲避免疫系统的清除、增强细菌或真菌在肠胃系统恶劣条件下的生存能力和存活率、并延长细菌或真菌在肠道部位的停留时间及提高其定植能力，进而提高细菌或真菌药物对各种疾病预防和/或治疗的效率和效果。

发明内容

为弥补本领域上述缺陷或不足并达到上述期望的效果，第一方面，本发明提供了一种表面修饰的微生物，所述微生物为细菌或真菌，所述微生物细胞由生物膜包裹；所述的生物膜用于阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质。

所述生物膜为具有类似生物膜结构的外源性、非天然的膜例如脂质膜，或者所述的生物膜为外源性、天然的生物膜，例如为细胞膜，或者细菌生物被膜，其由细菌在特定培养条件或环境下产生。

所述细菌为大肠杆菌Nissle、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和放线菌中的一种或多种组合；优选为大肠杆菌Nissle 1917、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一种或多种组合。

本发明另一方面表面修饰的微生物(如细菌或真菌)用于制备微生物介导的诊断和\或成像试剂或口服药物的应用，所述微生物由生物膜包裹以阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质；优选地，所述的表面修饰微生物用于制备微生物介导的肿瘤疾病成像试剂和\或肿瘤疾病治疗药物的应用；所述的表面修饰微生物用于制备口服药物和\或药物呈递中间体的应用；所述表面修饰微生物用于制备治疗肠道炎症或改善肠道功能药物的应用。

本发明涉及了一种药盒，包括如上所述的表面修饰的微生物；所述药盒用于微生物介导的肿瘤疾病成像和\或肿瘤疾病治疗，或用于治疗肠道炎症或改善肠道功能。

有益效果

与现有技术相比较，本申请的技术方案提供了一种新的利用生物膜进行细菌或真菌表面修饰的方法。该方法安全、简单、快速，显著减少了细菌或真菌被免疫系统的清除，提高了细菌或真菌到达疾病部位的量；而且细菌在被包裹细胞膜之后，其表面能引起机体免疫反应的物质(例如LPS)将暂时被隔绝，同时细菌产生分泌的物质也将暂时被膜包裹住，因此，可以显著减轻细菌所带的毒副作用。

本申请提供了一种经表面修饰的微生物，尤其是细菌，其中，所述表面修饰是利用生物膜对微生物细胞表面(尤其是细菌细胞)进行包裹。该微生物具有生命力更强，通过其天然靶向性靶向疾病部位，并具有在疾病部位迅速繁殖且持续12d以上的能力，相比纳米颗粒那样很快被代谢，修饰后的细菌在生物医药应用和诊断方面优势显著。

本申请还提供了用于进行表面修饰的生物膜，其中包括合成细胞膜-脂质体、然细胞膜及细菌自身产生的生物膜，这提高了在被包裹的细菌或药物在恶劣条件下的存活率和耐受力。例如强酸强碱条件、抗生素、酒精、胆汁酸等；增加了益生菌在肠道的定植和富集能力，提高了肠炎治疗和预防的效果。

基于上述优点，本申请所述表面修饰的微生物，例如细菌，在制备微生物介导的诊断及成像方面的应用，其中，所述经表面修饰的微生物被用作诊断试剂或药物成分。还提供了所述表面修饰的微生物在用于制备预防和/或治疗肠炎、糖尿病、肥胖症以及癌症等疾病的药物方面的用途。

附图说明

为了更清晰地了解本发明，参照以下附图对本申请的技术方案做非限制性的示例性说明，以对本申请的特征、目的和优点做全面的说明：

图1为本发明具体实施方式中制备细胞膜包裹的细菌的方法示意图。

图2A-2B为本发明具体实施方式中红细胞(2A)和制备的细胞膜图像(2B)。

图3A为根据本发明具体实施方式中大肠杆菌EcN的TEM图像。

图3B为根据本发明具体实施方式制备细胞膜包裹的EcN的TEM图像。

图4A-4C为本发明具体实施方式中大肠杆菌(E.coli)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的TEM图像

图4D-4F为根据本发明具体实施方式中制备细胞膜包裹的大肠杆菌(E.coli)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的TEM图像。

图5A-5F为本发明具体实施方式中EcN和细胞膜包裹细菌(CMCB)的激光共聚焦显微镜图像。

图6为根据本发明具体实施方式中EcN和CMCB的流式细胞仪检测图像

图7为根据本发明具体实施方式中利用抗-CD47抗体的western blot图像，其中Bac为未包裹的细菌(EcN)，RBC为红细胞，CMCB为细胞膜包裹细菌。

图8A为根据本发明具体实施方式制备的CMCB和EcN的生长曲线。

图8B为利用CCK-8试剂盒检测制备CMCB和EcN的活力数据。

图9为根据利用碘化丙啶(PI)检测本发明实施方式制备的CMCB和EcN的激光共聚焦显微镜图像。

图10和图11A为本发明具体实施方式中EcN和CMCB在小鼠血液中的预留时间结果。

图11B-11C为本发明具体实施方式中EcN和CMCB被巨噬细胞吞噬的结果。

图12A为本发明具体实施方式中吞噬EcN、CMCB、PLCB(LCB)的巨噬细胞数量结果。

图12B为本发明具体实施方式中被吞噬EcN、CMCB、PLCB(LCB)的荧光强度。

图13为本发明具体实施方式中吞噬EcN和CMCB的激光共聚焦显微镜图像。

图14为本发明具体实施方式中正常小鼠血常规检测结果，白细胞为WBC、红细胞为RBC和血小板为PLT。

图15为本发明具体实施方式中经EcN和CMCB处理的小鼠血常规中WBC、RBC和PLT计数。

图16为本发明具体实施方式中EcN、CMCB、PLCB(LCB)对沙门氏菌菌STm的抑制。

图17A-17C为本发明具体实施方式中注射EcN和CMCB的正常小鼠中白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。

图17D-17F为本发明具体实施方式中注射EcN和CMCB的乳腺癌4T1模型小鼠中IFN-γ(干扰素)、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的水平。

图18为本发明具体实施中注射PBS后的小鼠的细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。

图19A-19B为本发明具体实施方式中注射EcN、CMCB和空白组的小鼠细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的在7天和14天时水平。

图20A-20F为本发明具体实施方式中注射CMCB和EcN的小鼠在1h、2h、3d、5d、8d和12d后，CMCB和EcN在肝脏、脾、肺、脑、肾、心和肿瘤的分布。

图21A为本发明具体实施方式中CMCB和EcN在小鼠肿瘤部位聚集的图像。

图21B为本发明具体实施方式中CMCB和EcN在小鼠肿瘤部位的荧光强度。

图22A为本发明具体实施方式中采用LB和血清培养CMCB和EcN的数量变化。

图22B为本发明具体实施方式中采用冰PBS保存的CMCB的数量变化。

图22C为本发明具体实施方式中采用包含SMX的血清培养CMCB时的CMCB的数量变化。

图23A-23D为本发明具体实施方式中CMCB脱除细胞膜的流式细胞仪分析结果。

图24A为本发明具体实施方式中CMCB脱除细胞膜的激光共聚焦显微镜图像。

图24B为本发明具体实施方式中脱除细胞膜的CMCB的TEM图像。

图24C为本发明具体实施方式中CMCB脱除细胞膜的示意图。

图25A-25D为本发明具体实施方式中CMCB脱除细胞膜的激光共聚焦显微镜图像。

图26A-26B为本发明具体实施方式中采用脂质膜包裹细菌的示意图。

图26C为本发明具体实施方式中脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的透射电子显微镜观察图。

图26D为本发明具体实施方式中利用动态光扫描检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的脂质膜尺寸和zeta电位结果。

图26E为本发明具体实施方式中利用流式细胞仪检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、椭圆形粪肠球菌的脂质膜的荧光显示结果。

图27A-C为本发明具体实施方式中检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌的生长曲线。

图27D为本发明具体实施方式中检测检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌暴露于苄青霉素和安普霉素的生长情况对比。

图27E-F为本发明具体实施方式中检测检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌暴露于强酸和强碱下1h和4h的生长情况。

图27G-H为本发明具体实施方式中检测检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌暴露30％和50％浓度乙醇下的生长情况。

图27I-J为本发明具体实施方式中检测脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌暴露于含有胃蛋白酶(pH 1.2)的模拟胃液(SGF)和含有胰蛋白酶的模拟肠液(SIF)下的生长情况。

图28A-F为本发明具体实施方式中脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌暴露于SGF、SIF、抗生素、乙醇、强酸、强碱之后的TEM图。

图29A和29B为发明具体实施方式中将脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌移植到小鼠体内后的体内成像图。

图29C-F为本发明具体实施方式中移植到小鼠体内后不同时间点脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌在胃、肠的存活情况。

图29G为本发明具体实施方式中移植到小鼠体内后脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌在肠内的存活情况。

图29H为本发明具体实施方式中移植到小鼠体内后脂质膜包裹(LCB)大肠杆菌在SGF和SIF稳定情况的流式细胞仪检测数据。

图30A为本发明具体实施方式中利用LCB治疗STm感染导致的结肠炎的过程示意图。

图30B为本发明具体实施方式中利用LCB治疗结肠炎中的STm菌(Salmonellatyphimurium)的数量变化情况；以未包裹的EcN和PBS作为对照。

图30C本发明具体实施方式中利用LCB治疗结肠炎中的STm菌(Salmonellatyphimurium)的在盲肠中数量变化情况。

图30D本发明具体实施方式中利用LCB治疗结肠炎中的小鼠模型体重变化情况。

图30E-F为发明具体实施方式中利用LCB治疗结肠炎中的小鼠模型中细胞因子IL-6、TNF-γ变化情况和髓过氧化物酶(MPO)染色阳性细胞数量。

图30G为发明具体实施方式中利用LCB治疗结肠炎中的小鼠模型髓过氧化物酶染色的病理图。

图30H为本发明具体实施方式中利用LCB预防STm感染导致的结肠炎的示意图。

图30I为本发明具体实施方式中利用LCB预防STm感染导致的结肠炎使用的小鼠模型中STm的存活情况。

图30J为本发明具体实施方式中利用LCB预防STm感染导致的结肠炎使用小鼠模型粪便中EcN/STm比例。

图30K为本发明具体实施方式中利用LCB预防STm感染导致的结肠炎使用小鼠模型的细胞因子IL-6和TNF-γ水平变化图。

图30L为本发明具体实施方式中LCB预防STm感染导致的结肠炎使用小鼠模型的髓过氧化物酶(MPO)染色阳性细胞变化图和

图30M为本发明具体实施方式中LCB预防STm感染导致的结肠炎使用小鼠模型的髓过氧化物酶(MPO)染色的病理图。

图31A为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌治疗DSS诱导小鼠结肠炎的流程示意图。

图31B为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌治疗DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠肠重量和长度结果图。

图31C为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌治疗DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠盲肠疾病严重程度结果图。

图31D为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌治疗DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠盲肠病理图。

图31E和F为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌治疗DSS诱导小鼠结肠炎的MPO染色盲肠病理图和MPO阳性细胞数量结果图。

图31G为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌预防DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠试验流程示意图。

图31H为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌预防DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠盲肠疾病严重程度结果图。

图31J为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌预防DSS诱导小鼠结肠炎的小鼠盲肠病理图。

图31I和K为本发明具体实施方式中利用脂质膜包裹(LCB)和未包裹的大肠杆菌预防DSS诱导小鼠结肠炎的MPO染色盲肠病理图和MPO阳性细胞数量结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本申请作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明的技术方案、发明构思，而非对本发明所做的限制性说明。另外需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与发明相关的部分。其它未明确示出或未明确说明的部分均应理解为现有技术常规手段或方案，其结合本发明示出的技术特征可以实现本发明的技术效果。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施方式及实施例中的具体的附加技术特征可以相互组合或替换。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本申请。

生物膜

生物膜能够分隔细胞器或外界的膜系统，一般生物膜主要由脂质组成，或进一步包含蛋白质或糖类等，用于隔绝外界周围环境，能够让细胞独立于环境存在，本发明涉及的生物膜用于修饰细菌，用于将细菌与外界周围环境隔绝，同时能够掩盖其致病源性。本发明具体实施方式中，利用生物膜隔离细菌表面的免疫源性或其他毒副作用物质，比如细菌表面的免疫源蛋白、LPS等。

本发明具体实施方式中，生物膜为具有类似生物膜结构的外源性、非天然(如人工合成)的膜。其中，所述生物膜可以为生物界面超分子自组装膜，其基本结构能自发形成有序的膜结构，其组成可以由多糖、蛋白、聚合物、脂类一种或多种。例如，本发明某些实施方式中，采用的生物界面超分子自组装膜为具有类似生物膜结果的自组装单层膜，或者磷脂双分子层构成的膜。本发明具体实施方式中，生物界面超分子自组装膜为脂质膜，其中脂质膜的组成包含磷脂和胆固醇。例如，本发明具体实施方式中，脂质膜由二油酰磷脂酸DOPA(dioleoylphosphatydic acid)和胆固醇组成，其中二油酰磷脂酸DOPA(dioleoylphosphatydic acid)和胆固醇的摩尔比例为4:1。所述表面修饰细菌的制备，是通过生物界面超分子自组装膜(优选脂质膜)和细菌反复涡旋。

本发明具体实施方式中，生物膜为(细菌)外源性、天然的生物膜。生物膜为天然存在的，来自原核生物或真核生物，比如细菌细胞、真菌细胞或植物或动物细胞，优选为哺乳动物细胞，即生物膜为细胞膜。本发明具体实施方式中，生物膜来自具有迁移能力或侵袭能力的细胞，例如本发明优选实施方式中，生物膜为红细胞细胞膜、巨噬细胞细胞膜、肿瘤细胞细胞膜等。本发明具体实施方式中，生物膜为红细胞细胞膜。所述表面修饰的细菌，通过生物膜和细菌挤出的方法制备；优选地，使用Avavti Polar Lipids挤出仪，并通过孔径为1μm聚碳酸酯多孔膜挤出。

本发明的另外具体实施方式中，生物膜为细菌生物被膜(bio-film)，所述细菌生物被膜由所述细菌或真菌自身分泌，具体包括多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等成分；本发明的具体实施方式，生物被膜包裹枯草芽孢杆菌，具体地，枯草芽孢杆菌在含有生物被膜培养基(如LB或MSgg培养基)上培养，形成生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌。本可选的具体实施方式中，采用其自身分泌的细菌生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌。

微生物

本发明涉及的表面修饰的微生物，由生物膜包裹以用于阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质，其中微生物微为细菌或真菌。

本申请某些实施方式中，生物膜用于阻隔细菌表面的LPS和其表达分泌的产生免疫源性或其他毒副作用的物质。本发明具体实施方式中，本申请涉及的表面修饰的微生物为外源性、天然的生物膜包被的细菌，例如细胞膜包裹的细菌(cell membrane coatedbacteria,下称CMCB)；本发明具体实施方式中，利用红细胞膜包裹细菌，即利用提取分离的细胞膜包裹细菌，方法包括但不限于细胞膜和细菌一同挤出。本发明另外具体实施方式中，涉及的表面修饰细菌为脂质膜包裹细菌(lipid membrane coated bacteria,LCB)，方法包括但不限于将脂质膜与细菌反复混合涡旋、重悬等。

细菌可以为医疗使用的细菌种，例如用于肿瘤治疗或肠道菌群改善等细菌。本发明的实施例中，细菌为大肠杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和放线菌中一种或多种细菌；优选地，大肠杆菌Nissle 1917(E.coli Nissle 1917，EcN)，枯草芽孢杆菌，粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)。细菌可以包含外源性质粒以用于成像、药物呈递或外源药物等。本发明的一个具体实施方式中采用的外源性质粒表达荧光标记用于成像，本发明具体实施方式中选择pBBR1MCS2-Tac-mCherry、pBBR1MCS2-Tac-GFP或pMD18-luxCDABE。类似地，本发明的其他具体实施方式中，基于类似的技术方案，所述真菌为酵母菌。

根据表面修饰微生物，具体是细菌或真菌，能够在病患处(尤其是肿瘤疾病)聚集并且在正常器官组织存在较少的优点，本发明实施方式中，表面修饰的细菌用于制备细菌介导的诊断和\或成像试剂或口服药物的应用；本发明的具体实施方式中，利用表面修饰细菌用于肿瘤疾病成像试剂，本发明的另外实施方式中，利用表面修饰细菌用于肿瘤疾病治疗的药物；更具体实施方式中，表面修饰细菌能够表达外源性标记物质，比如荧光物质，或者携带能够表达外源性物质的载体(比如质粒或外源基因整合到基因组中)，其中，外源性物质可以为荧光标记、外源性或内源性毒素物质、或者分泌型抗菌物质，比如细菌素多肽、抗菌分子等。

本发明所涉及的表面修饰微生物，具体实施例涉及细菌由生物膜包裹，在肠道中具有优秀的存活率，并也能够抑制肠道有害菌的生长，减轻肠道炎症，本发明某些实施方式中，采用表面修饰的细菌，比如细胞膜包裹的细菌、脂质膜包裹的细菌，用于治疗肠道炎症或改善肠道功能的药物，优选用作改善肠道炎症的口服药物；所述细菌来自益生菌，即生物膜包裹的益生菌，本发明具体实施方式中，益生菌为益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌的一种或多种；更具体实施方式中，所述细菌包括外源性标记物质或者携带能够表达外源性物质的载体(比如质粒或外源基因整合到基因组中)，其中，外源性物质可以为荧光标记、外源性或内源性毒素物质、或者分泌型抗菌物质，比如细菌素多肽、抗菌分子等。本发明的其他具体实施方式中，类似的技术方案适用于酵母菌。

本发明的具体实施方式中，利用表面修饰的细菌用于医疗成像；某些实施方式中，本发明涉及医疗成像方法，利用表面修饰的细菌以特异性标记病患处；具体实施方式中，将表面修饰细菌注射到待检测目标，表面修饰的细菌会在病患处聚集，其中所述表面修饰的细菌可以包含外源性标记物或携带有用于表达外源性物质的载体，比如外源性标记。

本发明的具体实施方式涉及了一种药盒，包含上述的表面修饰的细菌；所述药盒用于细菌介导的肿瘤疾病成像和\或肿瘤疾病治疗，或者用于治疗肠道炎症或者改善肠道功能。

本发明具体实施例如下：

实施例中采用的实验方法为生物化学、分子生物学或医药检测等领域常规的研究方法。其中，本发明使用的大肠杆菌Nissle 1917(下称EcN)、粪肠球菌(E.faecalis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)购自中国通用微生物培养物采集中心。

细胞系(Hela、CT26和4T1)来自美国种属培养保藏中心(ATCC)。

质粒pBBR1MCS2-Tac-mCherry、pBBR1MCS2-Tac-GFP和pMD18-luxCDABE购自国内供应商。

细胞膜包裹的细菌

实施例1

将携带pBBR1MCS2-Tac-mCherry、pBBR1MCS2-Tac-GFP或pMD18-luxCDABE的EcN(大肠杆菌Nissle)在37℃下在含有抗生素的LB培养基中生长过夜。粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌在37℃下在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基中生长。将过夜培养物1:50稀释至新鲜LB培养基并在37℃下生长3小时。通过以4200rpm离心10分钟收集细菌，并重悬于冰冷的PBS中。通过稀释细菌悬浮液，在LB琼脂平板上于37℃培养过夜并计数菌落形成单位(CFU)来确定细菌计数。

实施例2

红细胞膜按照参考文献1报道的方法制备。简言之，通过眼窝从杰思捷(jiesijie)实验动物中心(中国上海)购买的麻醉的雄性ICR小鼠(6-8周)中提取全血，然后在4℃下以800g离心5分钟以除去血清和血沉棕黄层。在冷的1×PBS中洗涤三次后，将获得的包装的RBC在冰上悬浮于0.25×PBS中30分钟，然后以10000rpm离心5分钟以除去血红蛋白。用冷的1×PBS洗涤粉红色沉淀，并在-20℃下储存以备进一步使用。其制得的细胞膜如图2B所示，其中图2A显示(未处理)红细胞。

所有动物程序均符合上海医学实验动物护理指南。动物方案经上海交通大学医学院动物护理与使用委员会批准。

实施例3

收集在37℃下传代3小时的1.5ml细菌，用冰冷的PBS洗涤两次，并重悬于1ml冰冷的PBS中。然后将细菌与来自雄性ICR小鼠或雌性BALB/C裸鼠的1ml血液制备的红细胞膜混合，并通过使用小型挤出机(Avavti Polar Lipids挤出仪，美国)通过聚碳酸酯多孔膜(孔径：1μm)挤出11次。未挤出的EcN作为对照。

实施例4

使用透射电子显微镜(HITACH，Japan)使CMCB的结构可视化。将一滴CMCB溶液沉积在碳涂覆的铜网格上。然后将样品用ddH₂O洗涤两次，每次持续5分钟。随后，在观察之前将样品在空气中完全干燥。

透射电子显微镜(TEM)图像显示在由大肠杆菌(E.coli)制备细胞膜包裹细菌(cell membrane coated bacteria，下称CMCB)表面上具有约100nm厚度的透明或半透明外脂壳(如图3A-3B和图4A\图4D各图所示)。相比之下，未包裹的EcN在延长的鞭毛上显示出锋利的边缘(图3A)。同样的，基于相同方法包裹椭圆形粪肠球菌(E.faecalis)和球形金黄色葡萄球菌(S.aureus)，其结果图4B\4E和图4C\4F显示，结果显示表面具有透明或半透明外脂壳；其中图4A-4C(横向第一排)为未包裹细菌，图4D-4F为细胞膜包裹细菌。

实施例5：

通过对细菌和细胞膜分别染色，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测了细菌包裹情况，将表达mCherry的CMCB重悬于PBS中并与FITC-抗CD47-抗体(1：5000)(BDpharmingen，美国)在暗室中在冰上孵育30分钟，并用PBS洗涤，然后通过激光扫描共聚焦显微镜检查(Leica TCS SP8，德国)和流式细胞仪(Beckman CytoFlex，USA)分析。图5A-5F为LSCM图像，表达的mCherry(红色)表示EcN，FITC-抗CD47-抗体(绿色)显示细胞膜，右侧图为重叠后的图，CMCB呈现橙色。其中图5A-5C为未被细胞膜包裹的EcN，图5D-5F为细胞膜包裹细菌CMCB，结果显示，细菌细胞膜包裹率>99％。图6为EcN和CMCB的流式分析结果，结果显示CMCB存在CD47蛋白自身标记。同时，利用抗-CD47抗体作western blot检测，图7显示CMCB存在CD47蛋白标记(其中Bac为细菌(EcN)细胞，RBC为红细胞，CMCB为细胞膜包裹细菌)。

实施例6

为了检查包衣膜是否对包衣细菌的存活率有任何影响，将EcN和CMCB稀释至LB中的光密度(OD)值～0.15，并在37℃温育并轻轻摇动。通过nanodrop分光光度计(Eppendorf，德国)在不同时间点在600nm记录培养物的OD值；记录了CMCB的生长曲线(图8A)。

与未包裹的EcN相比，CMCB以相似的速率生长，并在3小时达到相同的OD600。同时，通过细胞计数试剂盒-8(Beyotime，中国)检查细胞活力，将EcN和CMCB在LB中稀释至OD600值～0.15，将180μl每种培养基接种到96孔板中并在37℃下不振荡培养。向每个孔中加入10μl CCK-8溶液。以1小时的间隔在450nm记录培养物的OD值。使用多检测微孔板读数器(BioTek，USA)测量450nm处的吸光度。与生长曲线结果一致，未包裹的EcN和CMCB之间的存活率没有显着差异(图8B)。

另外，细胞用碘化丙锭(PI)染色并成像以评估死细胞的数量。图9显示，利用LSCM成像表明细菌能够在细胞膜囊泡内生长，表明在用细胞膜包被后对细菌活力的影响可忽略不计。

实施例7

通过酶标仪测量CMCB/EcN对STm菌的抑制作用。细菌EcN(氨苄青霉素抗性)和细菌STm(Salmonella typhimurium，鼠伤寒沙门菌，卡那霉素抗性，表达mCherry)在37℃生长过夜。将STm和CMCB或EcN以1：100的比例混合。将150μl的各混合物在37℃下连续振荡培养至孔中，由STm表达的mCherry的相对荧光单位(RFU)以580/610nm以1小时间隔记录4小时。制备系列稀释液，然后涂布在Luria Bertani(LB)琼脂平板上，在细菌计数前将其在37℃下进一步培养24小时。如图16所示，细胞膜降低了EcN对STm的生长抑制能力，发明人认为细胞膜包衣会导致细菌产生的蛋白质不能分泌到胞外。

实施例8

检测EcN和CMCB在血液中预留作用。检测实验在6-8周龄雄性ICR小鼠上进行。每组每个时间点使用三只小鼠。为了评估CMCB的血液保留，将1×107CFU的细菌静脉内注射到小鼠尾静脉中。在注射后1,2,4,12和48小时通过眼窝收集50μl血液。细胞膜未包裹的EcN用作对照。用PBS连续稀释20μl每种血液，并将50μl各稀释液涂布在固体LB琼脂平板上，在37℃下进一步培养过夜，然后计数。

虽然注射后细菌迅速消失，但用CMCB处理的小鼠血液中残留的细菌数量远远高于未包衣的EcN。如图11A和图12A-12B所示，注射后12和48小时注射CMCB的小鼠的CFU分别比未包被的EcN大4和14倍，表明细胞膜包裹的EcN在血液循环中的保留显着增加。

通过包裹细胞膜显着改善了细菌的血液保留，这促使发明人进一步探索减少消除的机制。发明人研究了在用细胞膜包被细菌后RES是否吞噬EcN的问题，因为RES已被认为是侵入性微生物的主要清除机制。为了便于观察，构建了表达绿色荧光蛋白(GFP)的EcN，并与从ICR小鼠分离的原代腹膜巨噬细胞一起培养。然后借助流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析巨噬细胞吞噬细菌。根据参考文献2报道的方法，从小鼠腹腔分离的原代巨噬细胞以每个皿中2×10 ⁵个细胞的密度接种在含有10％FBS的1ml DMEM中，并在37℃下孵育24小时。然后用等体积(10μl)EcN或CMCB处理细胞1小时，接着用庆大霉素处理1小时。随后，在用PBS冲洗三次后，通过LSCM观察细胞。对于细胞摄取的定量分析，将细胞消化并收集用于流式细胞术分析。

正如预期的那样，在细胞膜存在下，细菌内化的巨噬细胞比例和吸收的细菌量分别减少了9％和8％(图11B和11C)。LSCM分析(图13)和体内细菌清除(图14)与流式细胞术结果一致，表明细胞膜包裹EcN降低了巨噬细胞清除率，因此在血液循环中提供了更有效的保留。图14中，白细胞为WBC、红细胞为RBC和血小板为PLT。

实施例9

接下来使用常规血液和细胞因子测定来测试CMCB诱导的炎症反应，这两种测定通常用于评估细菌治疗引起的副作用。如在“实施例8”部分中所述用EcN和CMCB处理的每只小鼠的100μl血液在注射后2小时取出并通过流式细胞术分析，具体地，裂解红细胞并用FC阻断(1：1,000，BD Pharmingen)封闭单核细胞，并与APC-亲和性抗-CD11b-抗体(1：200，BDPharmingen)在4℃温育1小时。用PBS洗涤染色的细胞，并使用CytoFlex(BeckmanCytoFlex，USA)分析。白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血小板(PLT)的计数通过标准动物血液分析仪在预定时间点定量。与注射细胞膜未包裹的EcN的小鼠相比，用CMCB处理的小鼠显示出更高的WBC、RBC和PLT计数(图15A-15C)，这与注射PBS的对照小鼠的测量值比注射未包裹的EcN的小鼠更接近(图14)。这些结果表明，注射CMCB比未包被的EcN诱导更低的炎症反应。

通过使用市售的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒在注射后的不同时间点测量从注射CMCB或游离EcN的小鼠取样的血清中的细胞因子水平来进行细胞因子测定。同样，细胞膜未包裹的EcN激活了比CMCB更严重的炎症反应。如图17A-17C所示，注射EcN比包被细菌刺激更高水平的细胞因子，包括白细胞介素-6(IL-6)，白细胞介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。注射CMCB的小鼠中细胞因子的分泌水平更接近于用PBS处理的对照小鼠的细胞因子(图18)。值得注意的是，图19A-19B显示所有小鼠的细胞因子分泌在2周后恢复到正常水平，说明将EcN包裹在细胞膜囊泡中打开了一个新的破口，可以减少细菌引起的急性副作用。

实施例10

在确认了细胞膜包被的EcN的血液保留和生物相容性得到改善之后，发明人进一步使用带有Hela肿瘤的裸鼠模型评估了细胞膜包裹EcN靶向和聚集到疾病部位能力。实验在雌性BALB/C小鼠(6-8周)(用于Hela肿瘤模型)和雌性BALB/C小鼠(6-8周)(用于CT26和4T1肿瘤模型)上购自上海交通大学医学院(中国上海)，在无特定病原体(SPF)条件下繁殖4天。收集肿瘤细胞(Hela，CT26和4T1)并重悬于PBS缓冲液中。将含有5×10⁵个肿瘤细胞的100μl PBS皮下注射到右下腹中。将小鼠随机分成两组(用1×10 7CFU的EcN和表达luxCDABE的CMCB处理)。通过卡尺测量每只小鼠的肿瘤体积并使用下式估算:(宽度)2×长度×0.5。

为了避免与不同血型相关的免疫反应，用于生物分布研究的细胞膜是从裸鼠中提取的，方法来自参考文献3。为了研究EcN和CMCB的生物分布，将上述构建的携带肿瘤的小鼠(Hela和4T1)静脉内注射1×10 ⁷CFU的EcN或CMCB。每组使用三只/四只小鼠。所有小鼠在指定的时间点通过体内成像系统(Caliper LifeSciences，USA)成像，并以预定的时间间隔处死以进行分析。将肝，脾，肺，心脏，脑，肾和肿瘤在玻璃均化器中匀浆。用PBS连续稀释每种匀浆的等重量，并将50μl每种稀释液涂布到含有抗生素的LB琼脂平板上，然后在37℃过夜孵育并计数细菌。组织中存在的细菌数量用于估计生物分布。图20A-20F显示正常器官和肿瘤的细菌分布，图20G显示EcN和CMCB在正常器官和肿瘤的分布。图20A-20和20G显示注射CMCB的小鼠的肿瘤组织含有的细菌比未被细胞膜包裹的EcN处理的小鼠多16倍，其中A-F代表注射1h、2h、3d、5d、8d和12d。意外的是，静脉注射CMCB的小鼠的脾、肺、脑和肾中EcN的聚集能力低于未包裹的EcN。根据图20G结果，发明人推测，注射CMCB的小鼠肿瘤组织中细菌的增加可能归因于血液循环中的高保留，为肿瘤部位的聚集提供了更大的机会。

实施例11

基于荧光蛋白表达和肿瘤靶向特异性的能力，发明人进一步评估了CMCB作为肿瘤靶向成像剂的潜力，采用两个移植有肿瘤的小鼠模型，即肺癌CT26和乳腺癌4T1，通过体内成像来评估生物成像效果。移植有大小约100mm³的肿瘤(CT26和4T1)的小鼠静脉注射1×10⁷CFU的EcN或CMCB。根据参考文献4制备包裹的脂质体并用作对照。通过体内成像系统对所有小鼠成像，并在预定时间点处死。通过病理切片分析肿瘤组织中EcN的分布。

图20A-20B显示，在乳腺癌4T1模型小鼠中，在注射表达荧光物质的EcN的小鼠的肿瘤部位出现可视化强发光信号(图21A，EcN和CMCB组)，信号主要出现在肿瘤部位，同时显示注射CMCB的小鼠肿瘤的平均发光信号增强比注射EcN的小鼠强约12倍(图21B)，并且几乎所有检测到的信号都集中在肿瘤部位。同时发明人也检测了注射EcN和CMCB的乳腺癌4T1模型小鼠中细胞因子水平，主要是涉及IFN-γ(干扰素)、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，图17D-17F显示，CMCB在乳腺癌4T1模型小鼠中激发了更多的IFN-γ(干扰素)、IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子的分泌。

除了优异的肿瘤靶向特异性外，细菌还能够在肿瘤组织内部繁殖并持续多天保持其发光信号(图21A)，CMCB的这种独特性质可用于肿瘤的长期生物成像，其可以持续12天。结果证明了CMCB具有作为肿瘤靶向成像的有效工具的潜力。

实施例12

发明人进一步研究了细胞膜的去除过程。活细菌不同于传统的表面修饰纳米颗粒，因为它们在各种材料进行表面修饰的情况下也能够增殖。因此，CMCB可能在其生长和分裂期间脱落细胞膜。发明人通过在不同培养基(包括100％血清，LB培养基和PBS)中培养CMCB来检查包被膜的稳定性。如图22A和图23A(血清)和23B(LB)所示，流式细胞术分析显示，分别在血清中孵育0.5小时和2小时后，几乎50％和93％的CMCB脱落细胞膜。当在LB中孵育时，CMCB从细胞膜中逃逸得更快，在孵育0.5小时后仅剩余17％的细胞膜。发明人推测细胞膜的脱落可能是由于血清和LB中细菌的快速分裂。发明人通过在冰冷的PBS和含有磺胺甲恶唑(SMX，5ug/ml)的血清中孵育来进一步测试细胞膜的稳定性，因为在这些条件下可以抑制CMCB的分裂。正如预期的那样，发明人发现在冷PBS中孵育24小时后CMCB几乎没有变化，尽管当孵育时间增加至48小时时，包被细菌的比例略微降低至83％(图22B和图23C)。类似地，当CMCB在含有SMX的血清中培养时，细胞膜的维持显著延长(图22C和图23D)。这表明细胞膜相对稳定和细胞膜的去除是由细菌细胞分裂引起的。

另外，利用激光共聚焦显微镜观察细胞膜的去除，其荧光如之前所述。如图24A和图25A-25D所示，浅橙色(24A右下图和25D)代表细胞膜包裹的EcN，而呈现红色的EcN则从细胞膜囊泡中逃逸(图24A左下图和图25C)，还观察到大量新生的EcN没有细胞膜。通过TEM进一步捕获该过程(图24B)，显示与空细胞膜囊泡连接的透明未包裹的EcN。细胞膜去除的过程如图24C。这些结果表明可控制的脱落过程，通过简单地转换培养基，可以容易地从CMCB去除细胞膜周期从数小时延长到数天，可以将CMCB适用于按需释放或长期施用细胞膜包裹细菌。

本发明申请提供了利用细胞膜包裹细菌的技术。这些利用细胞膜包裹的细菌作为伪装细菌，仅通过与细胞膜挤出的方式制备。此制备方法适用于多种菌种和多种细胞膜。正如实施例所示，具有天然细胞膜包裹的细菌能表现更低的炎症反应、更低巨噬细胞消除从而在血液中有更高存留度、在正常器官中更低聚集以及保持固定生物活性的活力。

脂质膜包裹的细菌

实施例13

采用实施例1相似的方法制备EcN细菌，根据报道(参考文献5)的方法制备LCB(脂质膜包裹的细菌，lipid membrane coated bacteria)，洗涤1.5ml细菌亚培养物并重悬于1ml含有12.5mM CaCl₂的冰冷的磷酸钙溶液中。将二油酰磷脂酸DOPA(dioleoylphosphatydic acid，Avanti Polar Lipids，Alabaster，AL，USA)和胆固醇(Sinopharm，Beijing，China)以4：1的摩尔比溶解在2ml氯仿中。使用旋转蒸发器在室温下干燥所得溶液，得到脂质膜。将得到的脂质膜在1ml细菌溶液中水合并涡旋15分钟，然后在4℃下储存以进一步表征。通过与FITC-mPEG2000-DSPE(与DOPA的摩尔比为10％)共组装来制备FITC标记的膜。

通过用二油酰磷脂酸(DOPA)和磷酸钙缓冲液中的胆固醇(图26A所示)涡旋包被EcN。使用钙离子制备LCB是至关重要的，因为它们有助于DOPA在细菌的阴性表面上自组装。胆固醇用于进一步稳定自组装脂质膜。优化的DOPA与胆固醇的摩尔比设定为4：1，这可以最一致地分离包被的EcN(图26B所示)。透射电子显微镜(TEM)图像显示涂层细菌上有明显的额外外壳，与未包裹EcN的锋利边缘形成鲜明对比(图26C所示)。具有不同形态的细菌包括球形金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)和椭圆形粪肠球菌(粪肠球菌)可以以相同方法进行包裹，显示该方法广泛适用于包裹不同菌株。动态光扫描(DLS)测量显示包裹脂质膜后尺寸和zeta电位均增加(图26D)。EcN、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌分别扩大到其初始大小的1.2，1.3和1.1倍。EcN、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的zeta电位分别从-38.4±3.2，-32.4±4.5和-28.8±1.6mV增加至-28.1±3.4，-19.6±3.4和-17.9±0.7mV。通过流式细胞术测量标记的LCB，显示荧光强度比未包裹的细菌显着增加，也证明存在脂质膜(图26E)。总之，这些结果也能证明了使用生物界面超分子自组装来包裹细菌的普遍性，简单性和高效性。

为了检查包裹的脂质膜是否对EcN的生存力和生长有影响，使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定评估细菌活力。在Luria Bertani(LB)培养基，含血清的LB或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，未包裹的EcN和LCB之间的生存力几乎没有差异。此外，LCB在培养基中培养时保留了生长和分裂的能力。如图27A-C所示，与未包裹的EcN相比，LCB在LB，LB与血清和PBS培养基中以相似的速率生长。

实施例14

发明人研究了脂质膜包裹膜对LCB存活和生长的影响，包括抗生素，强酸和碱以及乙醇等抗菌化学物质。如图27D所示，与未包裹的EcN相比，暴露于氨苄青霉素和安普霉素的抗生素组合3小时后，包裹的细菌存活50倍。接种后，存活细菌的数量在3至5小时的孵育时间下降仅50％，而在此期间未观察到的EcN完全死亡。将LCB暴露于强酸性(pH2.0)和碱性(pH11)条件后获得了类似的结果，其中LCB显示出大大提高的存活率(如图27E和F所示)。乙醇具有很强的杀菌活性，能够通过脱水和变性蛋白直接杀死细菌。在包裹膜存在下，即使乙醇浓度增加至50％(v/v)，细菌存活率也比未包裹的EcN高至少2倍(如图27G和H所示)。在这些结果的基础上，发明人推测LCB也可能在胃肠道环境中具有增强的存活率。因此，在补充有胃蛋白酶(pH 1.2)和含有胰蛋白酶的模拟肠液(SIF)(pH 6.8)的模拟胃液(SGF)中进一步评估LCB的存活。如图27I和27J所示，与未包裹的EcN相比，LCB显示出对SGF和SIF的显着改善的耐受性，并且两个群体之间的存活率差异随着暴露时间而增加。

为了证实观察到的增强的抗性可归因于脂质膜的存在，TEM用于在暴露于这些苛刻条件后检查细菌形态。如图28A和28B所示，LCB在暴露于SGF和SIF3小时后保持完整，而未包裹的EcN看起来异常并且在延长孵育时间后进一步受到损伤。在暴露于抗生素，乙醇以及强酸性和碱性之后，还观察到脂质膜维持细菌完整性的能力(图28C-F)。

实施例15

脂质膜是否可以增强体内存活，在口服施用10⁸CFU的包裹或未包裹细菌后评价胃肠道的定植。在给药后4小时使用体内成像系统(IVIS)对EcN的存在进行成像。与LCB的增强的体外存活率一致，包裹的的细菌在胃肠道，特别是盲肠中显示出增加的存活和定植(图29A和29B)。为了量化施用未包裹的EcN和LCB的小鼠之间的差异，通过平板计数分别评估胃、肠、结肠和盲肠中的EcN数。与未包裹的EcN相比，LCB显示小鼠胃中的存活率几乎高3倍，并且在给药后4小时的肠中水平高4倍以上(图29C-F)。肠内增强的保留在给药后保持长达4天。引人注目的是，给予LCB后，肠道，结肠和盲肠中的所有EcN计数均高于未包裹细菌。这些数据表明，用脂质膜包被EcN可以大大提高其口服生物利用度。

推测LCB的改善的生物利用度和定植可归因于自组装脂质膜的动态行为。为了验证这一假设，发明人测量了SGF和SIF中包裹膜的稳定性。用FITC标记的脂质膜包裹LCB，并在这些流体中孵育预定的时间段。如图29H，当孵育时间增加至4小时时，仅约20％的LCB具有分解的包衣，这超过了小鼠的胃滞留时间。该结果表明脂质膜在SGF中相对稳定并且可在胃排空期间保留。在SIF的情况下，超过60％的LCB在孵育4小时后具有分解的膜，这反过来导致它们的天然细胞包膜暴露并且在到达肠道后恢复其固有性质。简而言之，脂质膜的动态自组装和分解不仅提高了口服生物利用度，而且还保留了先天的生物活性。

实施例16

发明人进一步评估它们是否可以作为预防和治疗的增强疗法。据报道EcN可以治疗STm诱导的结肠炎，因为其分泌的微量蛋白可以抑制STm的增殖(参考文献6)。发明人通过与STm共培养测试了EcN的抑制增殖效果，并发现EcN以剂量依赖性方式抑制STm的生长。

接下来研究了在STm诱导的小鼠模型中LCB治疗结肠炎的潜力。在STm感染前一天给小鼠施用链霉素，然后在感染后第2天和第4天通过管饲法口服施用LCB(图30A)。未包裹的EcN和PBS均分别作为对照给药。排泄的粪便中的STm在指定的时间点列举。如图30B所示，在用LCB处理后，STm的量显着且连续地减少，与在处理后第4天用未包裹的EcN和PBS处理的小鼠相比，减少10至100倍。与对照组相比，用LCB处理导致盲肠中STm减少2至4倍，这可以通过大量EcN的定植来解释(图30C所示)。用LCB处理后STm的增强抑制也导致较少的体重减轻(图30D所示)。此外，进行盲法酶联免疫吸附测定(ELISA)和髓过氧化物酶(MPO)染色以评估被STm感染的小鼠的炎症。与包裹的EcN和PBS治疗相比，用LCB治疗小鼠显着减少了炎症反应，血清中细胞因子水平较低，包括白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-γ(TNF-γ)，以及盲肠病变中较少的MPO阳性细胞(图30E-30G)。

鉴于治疗结肠炎的疗效增加，发明人通过评估这两种菌株之间的体内竞争来探索LCB预防疾病的潜力。用等量的STm和LCB共同施用小鼠(图30H)。施用等量剂量的未包裹的EcN和空白PBS作为对照。与对照组相比，与LCB共同施用的小鼠表现出显着降低的STm存活和定植(图30I)，这归因于EcN的存在增加。特别地，与用LCB共同施用的小鼠排泄的粪便中EcN/STm的比例比用未包裹的EcN处理的小鼠高出25至8000倍(图30J)。此外，与LCB共同处理的小鼠在盲肠中显示出高达3100倍的EcN/STm比率。因此，通过给予LCB实现的优异抑制减轻了炎症症状，如体重减轻显着减少，血清中IL-6和TNF-γ水平降低(图30K)，以及病变中MPO阳性细胞减少(图30L和30M)。

实施例17

在确认了STm诱导的结肠炎中LCB的增强预防和治疗后，发明人进一步检查了LCB在DSS诱导的结肠炎模型中的效果。给小鼠喂食3％DSS 7天以诱导结肠炎，然后每天给予LCB 5天(图31A)，用未包裹的EcN和PBS用作对照。收获处理小鼠的肠道，在治疗后5天进行盲法组织病理学分析。与给予LCB的小鼠相比，从未包裹的EcN和PBS处理的小鼠中观察到肠重量和长度的直接减少(图31B)。与给予EcN(平均评分0.8)和PBS(平均评分1.2)的小鼠相比，用LCB处理的小鼠的盲肠疾病严重程度显着降低(平均评分0.4)(图31C)。图31D中苏木精和曙红(H&E)染色的代表性图像显示，在用LCB处理的小鼠的盲肠中未观察到组织学损伤，例如粘膜上皮细胞的脱落和固有层中肠腺的消失。另外，MPO阳性细胞的平均数量也显着低于EcN和PBS组中的数量(图31E和31F)。

最后，根据31G中显示的治疗设计进行了预防试验。给小鼠喂食3％DSS和LCB 5天。还进行了使用未包裹的EcN和PBS的对照。如图31H所示，与LCB的共同处理显示出对盲肠疾病严重程度降低的显着影响(平均得分0)。同时，仅在用未包裹的EcN和PBS处理的小鼠中发现组织学炎症(图31J)。此外，从用LCB共同处理的小鼠中观察到病变中MPO阳性细胞的显着减少(图31I和31K)。

细菌生物被膜的细菌

实施例18

从-80℃的50％甘油溶液中接种菌株，并在固体LB平板上生长。将种子菌接种在4ml LB培养基中于37℃下培养24小时(枯草芽孢杆菌LB培养条件，称为BSL)。然后将来自BSL培养物(100μl)的细菌接种到4ml Msgg培养基中于37℃下培养24小时(枯草芽孢杆菌-Msgg培养条件，称为BSM)。最后，将10μl培养物从BSM培养基(4ml BSM培养基以10000rpm离心1分钟，然后重悬于1ml PBS中)在30℃的固体Msgg板上放置48小时(枯草芽孢杆菌-生物被膜，称为BSB)。

将一块生物被膜放入65℃的干燥箱中24小时(重量不再变化超过24小时)，然后测量前后的重量(重量变化为水含量)，重复实验3次并取平均值结果。将一块生物被膜在1mlPBS中研磨，充分混合，在固体LB板上涂抹50μl液体，然后在37℃孵育过夜后计数一块生物被膜中的细菌数，重复三次实验并取平均结果。透射电子显微镜(HITACH，日本)用于实现枯草芽孢杆菌周围生物被膜成分的可视化。将涂碳的铜栅格用作目标溶液(10μl)的载体，然后需要用ddH2O洗涤5分钟，洗涤两次，最后在观察前风干。同时，使用克氏染色显示枯草芽孢杆菌和生物被膜之间的空间关系。

在不同的培养条件下，枯草芽孢杆菌会产生不同的细胞外形式。枯草芽孢杆菌在LB中生长，命名为BSL，不分泌细胞外基质；在Msgg中生长的BSL，分泌一些胞外基质；被生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌命名为BSB。从宏观上看，具有较暗内部和较浅周边的生物被膜呈圆形分布。使用了克氏染色法，发现BSB中的细菌被嵌入生物被膜中。

实施例19

发明人在体外评估了BSB对胃液和胆汁盐的抵抗力。与在SGF中孵育后半小时内全部死亡的BSL和BSM相比，BSB在6小时后仍然部分存活，其能够明显地经受住苛刻的条件。通过电子显微镜观察，我们发现它是BSB的细胞外基质，可抵抗SGF。随着孵育时间的延长，BSL和BSM失去活性，细胞成分逐渐聚集到细胞中间部分，而BSB则被具有包裹形态和正常活性的生物被膜紧密包裹。同样，BSB在0.3mg/ml胆汁盐培养基中的存活率远高于BSL和BSM，因为BSL和BSM都被胆汁盐分解成小碎片，而BSB可以通过生物被膜生存。体内BSB对SGF和胆汁酸盐的抗性结果与体外一致。发明人认为生物被膜具有很高的疏水性，因为BslA是生物被膜的主要组成蛋白之一，可以自组装成疏水层，这就是生物被膜可以帮助枯草芽孢杆菌逃脱各种刺激性液体攻击的原因。

实施例20

胃肠道中大多数活的益生菌都被排出体外，这表明加强细菌的肠道粘附至关重要。因此，发明人检查了BSB的肠粘连。无论是4小时，48小时还是120小时相同数量的细菌进行小鼠管饲，肠道组织中BSB的残留细菌数都比BSL，BSM大得多，表明BSB能够牢固粘附肠道上皮细胞，这与管饲后24小时小鼠肠道组织的革兰氏染色结果一致。BSB与肠组织的牢固粘附，一方面是由于其对胃肠道环境的抵抗力，另一方面是由于其在合适的肠道环境中生长较快并在肠道中继续分泌细胞外基质。

根据组织功能，肠道分为小肠，大肠和盲肠。发现BSB在肠的不同部位具有不同的粘附性能。此外，管饲后120小时，小肠组织中BSB的含量远高于其他组织，表明BSB对小肠组织的粘附性优于其他组织。这表明枯草芽孢杆菌的生物被膜可能特异性粘附在小肠组织上，这主要取决于EPS(胞外聚合物)的类型。

接下来，发明人评估了BSB在体内的口服生物利用度。根据小鼠灌胃后胃肠道中活细菌的数量，我们发现BSB的口服生物利用度明显优于BSL和BSM。与BSL和BSM相比，BSB分别在胃，小肠，大肠和盲肠中具有最多的细菌。一方面，BSB具有很好的抵抗胃酸和胆汁酸盐破坏的能力。另一方面，生物被膜成分可以促进细菌在肠组织中的粘附。另外，不同肠腔中BSB的分布与组织粘连有明显差异。盲肠腔中残留的BSB数量最多，而大多数粘附在小肠组织上，这极大地表明BSB对小肠的特异性粘附。

目前有关于枯草芽孢杆菌生物被膜的研究，但尚无口服给药的先例。发明人对装有生物被膜的枯草芽孢杆菌的生物安全性评估，在相同数量的BSL，BSM和BSB灌胃5天后，小鼠的肠道组织(包括小肠，大肠和大肠)，HE切开和染色后，表明其形态学与PBS-给药的小鼠没有明显不同。同时，取1毫升血液以测定血清中常见的炎症因子TNF-α，IL-6和CRP。结果表明，分别用BSL，BSM，BSB和PBS处理的四个组之间没有显着差异。因此，生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌是安全的。

实施例21

发明人进一步将BSB在肠道内定植以用于治疗病原菌的肠道内繁殖。金黄色葡萄球菌，容易形成抗生素耐药性，会导致严重的致命性肺炎和败血症的上皮性感染。金黄色葡萄球菌通常来自没有之前症状的定植，可能会引起去定植化的替代方式以进一步防止细菌传播。传统上认为，鼻孔为金黄色葡萄球菌定植位置，但是越来越多的研究表面感染爆发之前，肠道也为金黄色葡萄球菌繁殖储存位置。枯草芽孢杆菌也可以利用干扰脂多糖的方式对金黄色葡萄球菌群体产生影响，并导致较少金黄色葡萄球菌的肠道定植，由于口服益生菌的存活性低，肠道停留时间短等原因，患者需要多次服用该药物，但效果不明显，导致枯草芽孢杆菌作为医学上临床使用抑制金黄色葡萄球菌的肠道定植的难度较大，因此容易重新患有金黄色葡萄球菌，因此，发明人对生物被膜包裹枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的竞争性抑制实验。

将BSL，BSM和BSB与金黄色葡萄球菌以25：1的比例在SIF中分别于4小时和8小时后体外共孵育，结果表明BSB对金黄色葡萄球菌具有最佳的抑制作用，与在SIF和胆汁盐的混合溶液中共同孵育的结果一致。然后，发明人设计了在体内用BSB治疗金黄色葡萄球菌肠道定植的实验方案。成功地在C57BL/6小鼠上建立了金黄色葡萄球菌的肠道定植模型。第二天，给小鼠喂食1×10⁷CFU(100μl)分别通过管饲法治疗BSL，BSM，BSB和PBS。在第二，第四，第六天，收集粪便以间接显示小鼠体内金黄色葡萄球菌的数量。发现在三个时间点，用BSB喂养的小鼠的粪便中金黄色葡萄球菌数量最少，枯草芽孢杆菌数量最多。最后，在第八天，处死小鼠的肠组织和内容物。与体外结果一致，BSB对金黄色葡萄球菌定植的抑制作用。在肠道组织和腔体(包括小肠，大肠和盲肠)中，其体内组织都明显优于BSL和BSM，这与使用sau探针检测肠上皮细胞中的金黄色葡萄球菌到的结果一致。此外，经BSL处理的小鼠的结果与PBS处理的小鼠的结果一致，而BSB和BSM处理的小鼠结果更好，其中BSB处理的小鼠是最好的。我们还在处理过的小鼠的血液中孵育了细菌，结果与肠道无差异，但临床上血清炎症指标似乎未达到金黄色葡萄球菌感染的标准。

总而言之，生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌可在体内和体外抵抗胃肠道环境，并通过包含细胞与细胞之间通讯的复杂群落与肠上皮细胞牢固结合。研究表明，含生物被膜的益生菌口服制剂可有效增加肠道的益生菌群，改善肠道微环境，改变多种无效的条件。

基于上述优点，本领域人员可以确定，本申请所述表面修饰的细菌在制备细菌介导的诊断及成像方面的应用，其中，所述经表面修饰的细菌被用作诊断试剂或药物成分。还提供了所述表面修饰的细菌在用于制备预防和/或治疗肠炎、糖尿病、肥胖症以及癌症等疾病的药物方面的用途。

以上描述仅为本申请的较佳实施方式以及对所运用技术原理的说明。本领域技术人员应当理解，本申请中所涉及的发明范围，并不限于上述技术特征的特定组合而成的技术方案，同时也应涵盖在不脱离本申请构思的情况下，由上述技术特征或其等同特征进行任意组合而形成的其它技术方案。例如上述特征与本申请中公开的(但不限于)具有类似功能的技术特征进行互相替换而形成的技术方案。

参考文献：

1.Desilets,J.,Lejeune,A.,Mercer,J.&Gicquaud,C.Nanoerythrosomes,红细胞血影的新衍生物：IV.重新注入纳米红细胞的命运。Anticancer Res 21,1741-1747(2001)..

2.Zhang,X.,Goncalves,R.&Mosser,D.M.小鼠巨噬细胞的分离和表征。CurrProtoc Immunol Chapter 14,Unit 14 11,doi:10.1002/0471142735.im1401s83(2008).

3.Hu,C.M.et al.红细胞膜伪装聚合物纳米粒子作为仿生传递平台。Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States of America 108,10980-10985,doi:10.1073/pnas.1106634108(2011).

4.Wang,D.et al.通过核碱基分子识别构建的超分子工程化磷脂：用于药物递送的磷脂的升级产生。Chem Sci 6,3775-3787,doi:10.1039/c5sc01188d(2015).

5.J.Chen et al.,包含脂质和磷酸钙的溶瘤腺病毒复合物用于癌症基因治疗.ACS Nano 10,11548-11560(2016).

6.M.Sassone-Corsi et al.,Microcins介导发炎肠道中肠杆菌科细菌之间的竞争.Nature 540,280-283(2016).

Claims (10)

1.一种表面修饰的微生物，所述微生物为细菌或真菌，其特征在于，所述微生物细胞由生物膜包裹；所述的生物膜用于阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质。

2.根据权利要求1所述的表面修饰的微生物，其特征在于，所述生物膜为具有类似自然生物膜结构的外源性、非天然的膜；所述生物膜为生物界面超分子自组装膜，优选为具有类似自然生物膜结构的自组装单层膜或磷脂双分子层构成的膜；

优选为脂质膜，优选地所述脂质膜包含磷脂和胆固醇；优选地所述脂质膜由二油酰磷脂酸DOPA和胆固醇组成，优选地，所述二油酰磷脂酸DOPA和胆固醇的摩尔比为4:1；

优选地，所述表面修饰的微生物通过微生物细胞与生物膜反复涡旋制成。

3.根据权利要求1所述的表面修饰的微生物，其特征在于，所述的生物膜为外源性、天然的生物膜，优选为生物膜来自具有迁移能力或侵袭能力的细胞；

更优选为红细胞细胞膜、巨噬细胞细胞膜或肿瘤细胞细胞膜的一种；更优选的，所述的生物膜为红细胞细胞膜；

优选地，所述细胞膜通过低渗法提取；

优选地，所述表面修饰的微生物，通过生物膜和微生物细胞挤出的方法制备；优选地，使用AvavtiPolar Lipids挤出仪，并通过孔径为1μm聚碳酸酯多孔膜挤出；

优选地，所述的表面修饰的微生物的培养基为血清、LB培养基或PBS；优选地，所述培养基为包含磺胺甲恶唑(SMX)的血清或冰PBS。

4.根据权利要求1所述的表面修饰的微生物，其特征在于，所述的生物膜为细菌生物被膜，优选地所述细菌生物被膜由所述细菌或真菌自身分泌；优选地，所述表面修饰的微生物为细菌生物被膜包裹的枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求1-4任一项所述的表面修饰的微生物，其特征在于，所述细菌用于肿瘤治疗或改善肠道炎症；优选的，所述细菌为大肠杆菌Nissle、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和放线菌中的一种或多种组合；优选地，所述细菌为大肠杆菌Nissle1917、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的一种或多种组合；

所述真菌为酵母菌；

优选地，所述微生物包含外源性标记物质或用于表达外源性物质的载体，更优选地用于表达外源性物质的载体用于表达荧光标记、外源性或内源性毒素物质或分泌型抗菌物质。

6.表面修饰的微生物用于制备细菌介导的诊断和\或成像试剂或口服药物的应用，所述微生物为细菌或真菌，所述微生物由生物膜包裹以阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质；

优选地，所述的表面修饰的微生物用于制备微生物介导的肿瘤疾病成像试剂和\或肿瘤疾病治疗药物的应用；

优选地，所述的表面修饰的微生物用于制备口服药物和\或药物呈递中间体的应用；

优选地，所述表面修饰的微生物用于制备治疗肠道炎症或改善肠道功能药物的应用。

7.一种微生物介导的肿瘤疾病成像试剂和\或肿瘤疾病治疗药物，其特征在于，其包括表面修饰的微生物，所述微生物为细菌或真菌，所述微生物由生物膜包裹以阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质；

优选地，所述微生物包括外源性标记物质或携带能够表达外源性物质的载体；优选地，所述载体用于表达荧光标记、外源性或内源性毒素物质或分泌型抗菌物质。

8.一种用于治疗肠道炎症或改善肠道功能的药物，其特征在于，其包括表面修饰的微生物，所述微生物为细菌或真菌，所述微生物由生物膜包裹以阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质；

优选地，所述细菌为益生菌；优选地，所述益生菌为益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌和放线菌的一种或多种组合；所述真菌为酵母菌；

优选地，所述的细菌或真菌包括外源性荧光物质或携带能够表达外源性物质的载体；优选地，所用能够表达外源性物质的载体用于表达荧光标记、外源性或内源性毒素物质或分泌型抗菌物质。

9.一种医疗成像的方法，其用于肿瘤疾病成像，其特征在于，将生物膜包裹的微生物注射到待检测体内以特异性标记病患处，所述的微生物为细菌或真菌；

优选地，所述细菌由生物膜包裹以阻隔微生物细胞表面的免疫源性或其他毒副作用物质；所述微生物包含外源性标记物质或用于表达外源性物质的载体。

10.一种药盒，包括权利要求1-5任一项所述的表面修饰的微生物；所述药盒用于微生物介导的肿瘤疾病成像和\或肿瘤疾病治疗，或者用于治疗肠道炎症或改善肠道功能。

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