CN114181847A - 一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其应用，具体地，是由小分子或大分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，包含该细菌的药物组合物及其应用。其中，该细菌优选肠道菌群中的益生菌，更优选地，是乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等；该小分子药物是儿茶酚胺类神经递质，优选地，是多巴胺；大分子药物为具有炎症缓解作用的天然分子，优选的，是蚕丝蛋白。利用多巴胺自聚将其修饰在益生菌的表面，在保护益生菌的基础上，联合免疫治疗及菌群调控，以用于治疗慢性结肠炎。该细菌，在局部发炎的组织中，其表面的聚多巴胺颗粒抑制免疫过度反应，并有助于炎症反应的逆转。

Description

一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其应用，具体地，是由小分子或大分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，包含该细菌的药物组合物及其应用。其中，该细菌优选肠道菌群中的益生菌，更优选地，是乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等；该小分子药物是儿茶酚胺类神经递质，优选地，是多巴胺；大分子药物为具有炎症缓解作用的天然分子，优选的，是蚕丝蛋白。利用多巴胺自聚将其修饰在益生菌的表面，在保护益生菌的基础上，联合免疫治疗及菌群调控，以用于治疗慢性结肠炎。
背景技术
细菌存在于人体内微生物群中，其中的菌群在维持机体免疫和代谢平衡状态方面非常重要。由于某些细菌栖息在身体特定的某些区域中，如肠道，能优先瞄准肿瘤微环境并在其中生存，因此，基于细菌的治疗性给药系统是药物和其他药物分子的有效途径。血管构筑缺陷、间质压力升高以及肿瘤微环境中渗透距离增加均属于药物输送到肿瘤部位这一过程中的重要障碍。
近年来，含有药物的纳米脂质体、纳米级拮抗剂和功能性核酸分子都能够被修饰在细菌上，从而传递到炎症或肿瘤微环境中。如趋磁细菌、海洋趋磁球菌例如菌株MC-1，均是利用磁场的作用将载有抗肿瘤药物喜树碱的纳米脂质体递送到肿瘤缺氧区域。另外，细菌也用于向实体肿瘤输送功能性核酸。
由于致病菌会引发副反应，因此用于肠道粘膜药物递送的细菌主要是益生菌，如乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等。与纳米颗粒相比，益生菌自身能够抵抗病原微生物，可以保护肠粘膜，预防抗原降解，激活相关免疫反应。而工程化的益生菌具有很多功能，如蛋白的分泌(抗原或炎症因子等)。此外，在细菌表面连接IgA等蛋白也可进行药物递送。益生菌药物递送体系可以用于结肠炎和肠道感染的预防和治疗。
虽然采用益生菌对肠道炎症进行治疗具有其固有的优势，但是，由于胃部和肠道环境苛刻，益生菌口服后生存率极低。为了提高益生菌的存活率，研究人员提出了一些解决方案。例如，筛选合适的耐酸耐胆盐菌株，二次发酵，添加保护剂和包覆等方法，使更为有效，不仅可以提高益生菌在加工和储存过程中的生存能力和稳定性，还可以在肠道中持续地靶向释放细胞。益生菌化的常用壁材包括碳水化合物、蛋白质、植物胶和细菌多糖。然而，这些材料对益生菌进行表面修饰则会影响益生菌在肠道的定植。目前选用的表面修饰材料仅仅起到对益生菌进行保护的作用。
此外，现有研究表明，免疫调控可以有效地对肠炎进行治疗。免疫抑制剂，临床上多用于治疗自身免疫性疾病，目前在用的多是小分子抑制剂。小分子抑制剂能够靶向作用于蛋白，降低蛋白活性或者阻碍生化反应的分子量小于1KD的分子药物，容易穿透细胞膜，在应用上具有一定的优势。然而，由于小分子抑制剂的脱靶作用会对正常组织产生严重的副作用。将小分子药物纳米化能够降低小分子免疫抑制剂的治疗效果并降低毒副作用。纳米药物几乎全部由小分子药物或药物衍生物自组装形成，具有质量可控、载药量较高、组成简单、工艺简便等独特性质，成为新一代纳米药物研究的热点。另外，采用活细胞递药在疾病治疗等方面已经取得了很大的进展，如细胞负载药物后可以更直接的和免疫细胞发生接触，进一步改善免疫环境，对自身免疫性疾病，如结肠炎和风湿性关节炎等进行治疗。
考虑到多巴胺具有β受体激动作用，也具有一定的α受体激动作用，能增强心肌收缩力，增加心排血量，加快心率作用较轻微，对周围血管有轻度收缩作用，升高动脉压的作用。目前临床上主要用于各种类型休克。重要的是，多巴胺具有调节免疫细胞的作用。多巴胺的免疫调节作用于1980年到1990年左右提出，在多种免疫细胞中均有多巴胺受体的表达，如淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞以及单核细胞等。多巴胺可以通过多巴胺受体调控一系列的免疫反应，如炎症因子的分泌，细胞黏附，细胞毒性和趋药性，这些免疫反应反进而调控多巴胺通路。现有研究发现，多巴胺通过调控树突状细胞来调控淋巴细胞免疫功能的。多巴胺在特定条件下可以发生氧化自聚，形成聚多巴胺。聚多巴胺具有极强的黏附效果，耐腐蚀，可用于表面修饰，对界面进行保护。聚多巴胺被广泛应用于各个领域，如细胞内化、软光刻技术、生物相容性表面修饰、纳米材料解毒、纳米材料功能化、界面科学、传感、催化等。将聚多巴胺修饰到纳米颗粒的表面，也可以用于肿瘤的免疫治疗。但是，目前还没有有效组合免疫调控手段治疗炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD) 的益生菌药物递送体系或活性药物。
发明内容
针对现有技术中益生菌治疗肠道疾病中存在的不足，本发明申请的发明人及其团队提出，在保护益生菌的基础上，提供附加功能，如调节结肠粘膜免疫，以大大提高IBD的治疗效果。因此，本发明申请的技术方案在保证益生菌存活的基础上，联合免疫治疗，大幅度促进肠炎的治愈率，并缩短治疗时间。具体地，本发明利用多巴胺自聚将其修饰在益生菌的表面，在保护益生菌的基础上，联合免疫治疗于菌群调控用于治疗慢性结肠炎。
第一方面，本发明申请提供了一种表面被生物活性药物修饰的细菌，其中该细菌是由小分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，该细菌是选自肠道菌群中的益生菌。
进一步地，优选地，该益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等中的一种或多种；该小分子药物是儿茶酚胺类神经递质，优选地，是多巴胺。
第二方面，本发明申请提供了一种制备上述表面被生物活性药物修饰的细菌的方法，包括：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式，以聚多巴胺颗粒的形式粘附在细菌的细胞膜表面，其中该聚多巴胺颗粒是纳米级颗粒，其直径为100-500nm。
进一步地，将漂洗后的益生菌分散在pH7.5-9.0、含有0.5-2mg/ml多巴胺的Tris-HCl 中，在18-30℃下，震荡300-800r/min，反应30-120min，得到表面负载聚多巴胺的益生菌。优选地，pH值为7.5-8，最优选地，pH值为8.5。
进一步地，聚多巴胺负载量为大约0.25-1.5mg/109CFU。
第三方面，本发明申请提供了一种治疗炎症性肠病的药物递送体系，该体系至少包括一种上述表面被生物活性药物修饰的细菌，其中该细菌是由小分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，且该细菌是选自肠道菌群中的益生菌。
进一步地，优选地，该益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等中的一种或多种；该小分子药物是儿茶酚胺类神经递质，优选地，是多巴胺。
进一步地，该药物递送体系还可以包括药学上可接受的载体。
第四方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包括上述任一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其药学上可接受的载体。
进一步地，在该药物组合物中，该被修饰的细菌的含量为1-99.9重量％。优选地，10-90 重量％。其中每109CFU活的细菌细胞的平均负载聚多巴胺颗粒的量为0.25-1.5mg。
第五方面，本发明申请提供了该表面被生物活性药物修饰的细菌在制备用于治疗炎症性肠病的药物方面的用途。
通过使用该细菌，在局部发炎的组织中，该细菌表面的聚多巴胺颗粒抑制免疫过度反应，并有助于炎症反应的逆转。通过该活的益生菌，可以将肠道菌群调节和多巴胺免疫调节组合使用。除免疫抑制能力外，聚多巴胺颗粒还防止细菌在口服后受到环境损害。被修饰的细菌不仅抑制过度活跃的免疫反应，而且还积极调节与结肠炎相关的小鼠的肠道微生物菌群，将会大大提高IBD的治疗效果。
该细菌，在局部发炎的组织中，其表面的聚多巴胺颗粒抑制免疫过度反应，并有助于炎症反应的逆转。通过该活菌，可以将肠道菌群调节和多巴胺免疫调节组合使用。除免疫抑制能力外，聚多巴胺颗粒还防止细菌在口服后受到环境损害。被修饰的细菌不仅抑制过度活跃的免疫反应，而且还积极调节与结肠炎相关的小鼠的肠道微生物菌群。
有益效果
本发明公开了上述被改良的细菌介导的治疗手段及技术方案，将多巴胺免疫调控体系用于局部炎症的调控。基于实验研究，患有结肠炎的小鼠口服聚多巴胺纳米颗粒后，肠炎的症状有所缓解，另外，PDNI能够调控固有淋巴层中淋巴细胞中Th细胞和Treg细胞的比例。为了进一步提高PDNI的治疗效果，采用益生菌负载PDNI(EcN@PDNI)，PDNI被递送到肠道的同时，PDNI的修饰也可以保护益生菌免受胃液的腐蚀。组合免疫调控和肠道菌群调控，用于结肠炎的治疗。该被改良细菌的制备方法简单、成本低、安全性高，这具有重要的研究意义和临床应用价值。与氨基水杨酸相比，在两种动物结肠炎模型中，多巴胺免疫调节和肠道菌群调节相结合具有更好的治疗效果。
附图说明
图1示出了PDNI在炎症组织的免疫调控能力。
其中：a.小鼠结肠炎是通过饮用水中给予小鼠3％葡聚糖硫酸钠盐(DextranSulfate Sodium Salt,DSS)构建的结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型，之后口服给予PDNI(10mg/kg)。连续5天给药后提取LPMC，经PMA刺激之后进行流式抗体染色；
b.治疗结束时小鼠肠道照片；
c.小鼠的平均结肠长度；
d.小鼠血清中IL-17A的浓度；
e,g,i,k.(e)LPMC标记anti-CD4-FITC/anti-CD25-PE-cy7/anti-Foxp3-PE，(g)anti-CD4-FITC/anti-IFN-PE-cy7，(i)anti-CD4-FITC/anti-IL-4-APC和(k) anti-CD4-FITC/anti-IL-17A-PE的流式图像；
f,h,j,l.LPMC中(f)CD4+CD25+Foxp3+，(h)CD4+IFN+，(j)CD4+IL-4+和(l) CD4+IL-17A+细胞的比例；m,n,o中，LPMC中(m)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IFN+，(n) CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-4+和(o)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-17A+的值。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝5)。
图2示出了血清中(a)TGFβ和(b)IL-10的水平。其中，p<0.05，*，p<0.01，**。 ns表示没有显著性差异(n＝5)。
图3示出了PDNI在炎症部位的免疫调控作用。
其中：a.小鼠模型是通过灌肠给予小鼠2.5％TNBS溶液构建，后连续5天灌胃给予小鼠0.2mL PBS或PDNI(10mg/kg)；
b-d.分别示出了LPMC中(b)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IFN+，(c) CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-4+和(d)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-17A+的值。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝5)。
图4示出了PDNI对DC的免疫抑制作用。
其中：a.与PDNI孵育12h后，DC标记anti-MHC II-PE和anti-CD86-APC流式抗体后的流式图像。
b,c.DC经PDNI处理后，其中(b)CD86+和(c)MHC II+细胞的比例.
d.PDNI对DC的毒性(12h)。
e.PBS,LPS and LPS/PDNI与DC孵育后细胞的流式图。
f,g.DC经PBS、LPS和LPS/PDNI处理后，其中(f)CD86+和(g)MHC II+细胞的比例；
h-k.细胞上清中(h)IL-10，(i)IL-1β，(j)IL-6和(k)TNFα中的水平。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝3)。
图5示出了PDNI对CD4+T细胞的调控作用。
其中：a.CD4+T细胞在CD3&CD28、CD3&CD28&TGF和CD3&CD28&TGF/PDNI刺激5天后的流式图；
b,c.刺激后CD4+T细胞中(b)CD25+Foxp3+和(c)IL-17A+细胞的百分比；
d.刺激后CD4+T细胞中Foxp3+/IL-17A+的比值；
e.CD4+T细胞在与刺激后DC孵育5天后的流式图；
f,g.与DC孵育后CD4+T细胞中(f)CD25+Foxp3+和(g)IL-17A+细胞的百分比；
h.孵育后CD4+T细胞中Foxp3+/IL-17A+的比值。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝3)。
图6示出了不同浓度DA修饰EcN，标尺为1μm。
图7示出了EcN@PDNI的表征。
其中：a.EcN@PDNI的制备示意图；
b.EcN和EcN@PDNI的TEM图像，标尺为1μm；
c,d.EcN和EcN@PDNI的(c)水合粒径和(d)zeta电位；
e.EcN and EcN@PDNI的扫描电子显微镜图像，标尺为1μm(上)和0.5μm(下)；
f.EcN和EcN@PDNI的流式图；
g.EcN和EcN@PDNI的共聚焦图像，标尺为10μm。
图8示出了(a)EcN和(b)EcN@PDNI对MODE-K细胞的细胞毒性。
图9示出了EcN@PDNI分别在体内外的存活率。
其中：a-c.EcN和EcN@PDNI在(a)模拟胃液、(b)0.3mg/mL胆汁酸和(c)模拟肠液孵育不同时间后的存活率；
d.同样浓度的EcN和EcN@PDNI的荧光成像；
e.口服EcN或EcN@PDNI后小鼠的荧光成像图片；
f.口服EcN或EcN@PDNI后小鼠肠道的荧光成像。
g.胃肠道荧光强度值；h,i(h)肠道组织和(i)肠道内容物中的益生菌数量。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝3)。
图10示出了，a.该细菌在模拟胃液中孵育之后的共聚焦图像，标尺为10μm；b,c.(b) EcN和(c)EcN@PDNI在模拟胃液中的存活率(n＝3)。
图11示出了EcN and EcN@PDNI在胃液中孵育2和4小时之后的透射电子显微镜图像，标尺为2μm。
图12示出了：a.细菌在模拟肠液中孵育之后的共聚焦图像，标尺为10μm；b.与肠液孵育之后EcN的荧光强度；c,d.EcN@PDNI在肠液中孵育前后(c)zeta电位和(d)水合粒径的变化(n＝3)。
图13示出了EcN@PDNI在肠液中孵育后上清液在280nm处的吸光度(n＝3)
图14示出了EcN@PDNI对DSS诱导结肠炎的治疗。
其中：a.实验方案路线图；
b.治疗后各组小鼠的肠道图片；
c.治疗后各组小鼠的体重变化曲线；d.治疗后小鼠结肠长度；
e.EcN组和EcN@PDNI组胃肠组织中的细菌的数目；
f,g.小鼠血清中(f)IL-1β和(g)IL-6的浓度；
h.小鼠肠组织中髓过氧化物酶的浓度；
i.近端结肠和远端结肠的组织切片，黑色、蓝色和绿色箭头代表炎症、出血和水肿，标尺为50μm。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝5)。
图15示出了EcN@PDNI对结肠炎小鼠的免疫调控及肠道菌群调控。
其中：a-d.LPMC中(a)CD4+CD25+Foxp3+，(b)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IFN+， (c)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-4+和(d)CD4+CD25+Foxp3+/CD4+IL-17A+的比值；
e-g.血清中(e)IL-17A、(f)TGFβ和(g)IL-10的浓度；
h,i.肠道菌群中(h)ACE和(i)Shannon指数的值，其中，值越大代表丰度和多样性越高；
j,k.不同组小鼠(j)PCA和(k)PCoA的图像；l,m肠道菌群中(l)菌门和(m)菌属的分布图；
n-p.肠道菌群中(n)Proteobacteria、(o)Escherichia_Shihella和(p)Mucisoirllum的丰度。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝5)。
图16示出了EcN@PDNI对恶唑酮诱导小鼠肠炎模型的治疗。
其中：a.实验设计路线图；
b.治疗后小鼠肠道照片，箭头代表发炎的地方；
c.治疗前后的小鼠体重；
d.治疗后小鼠的结肠长度；
e.EcN组和EcN@PDNI组胃肠组织中的细菌的数目；
f,g.小鼠血清中(f)IL-1β和(g)IL-6的浓度；
h.小鼠肠组织中髓过氧化物酶的浓度；
i.远端结肠的组织切片，黑色和绿色箭头代表炎症和水肿，标尺为50μm。
其中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，****表示p<0.0001，ns 表示没有显著性差异(n＝5)。
上述统计均是采用单因素方差分析(ANOVA)和图基(Tukey)检验进行统计分析。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步说明，但是并不以此限制本发明。在不背离本发明的技术构思及技术方案的前提下，对本发明所属领域的普通技术人员来说，能够实现的任何修改、调整或修饰、或者等同替换方法都将落入本发明的要求保护的范围内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在本发明申请的实施方案中，采用一步法制备一种表面被生物活性药物修饰的细菌，其中该细菌是由小分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，该细菌是选自肠道菌群中的益生菌。
优选地，该益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等中的一种或多种；该小分子药物是儿茶酚胺类神经递质，优选地，是多巴胺。
在此，制备上述表面被生物活性药物修饰的细菌的方法包括：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式，以聚多巴胺颗粒的形式粘附在细菌的细胞膜表面，其中该聚多巴胺颗粒是纳米级颗粒，其直径为100-500nm。
进一步地，将漂洗后的益生菌分散在pH 7.5-9.0、含有0.5-2mg/ml多巴胺的Tris-HCl 中，在18-30℃下，震荡300-800r/min，反应30-120min，得到表面负载聚多巴胺的益生菌。优选地，pH值为7.5-8，最优选地，pH值为8.5。
进一步地，聚多巴胺负载量为大约0.25-1.5mg/109CFU，灌胃0.1-0.3ml具有抗炎症效果。
实验例1：
在该验例中，采用多巴胺修饰在大肠杆菌Nissle 1917细胞膜外表面，获得一种被修饰的菌株。具体地，将将漂洗后的益生菌分散在pH8.5、含有0.5-2mg/ml多巴胺的Tris-HCl 中，在25℃下，震荡500r/min，反应30min，得到表面负载聚多巴胺的益生菌。
实验例2：
通过将EcN(2×109)分散于3mL多巴胺溶液中(0，0.25，0.5，1.0，2.0mg/mL)，震荡30min后4000g离心洗涤得到EcN@PDNI，室温与FITC共孵育2h对PDNI进行染色，通过共聚焦显微镜(Confocal)、流式细胞仪(FC)进行表征。EcN@PDNI的微观形貌通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜进行观察，其中，扫描电子显微镜的样本通过固定和梯度乙醇脱水后制备。EcN@PDNI的水合粒径和Zeta点位通过马尔文激光粒度仪进行表征，另外，EcN@PDNI-FITC通过流式细胞仪进行表征。
实验例3：
模拟胃液的配置：将10g胃蛋白酶溶于1L pH为1.8的NaCl溶液中。
模拟肠液的配置：将10g胰蛋白酶溶于1L pH为6.8的KH2PO4溶液中。
胆汁酸溶液的配置：0.3g胆酸钠溶于1L pH为7.4的PBS溶液中。
分别将EcN和EcN@PDNI加入到不同的模拟体液中，共孵育0.5，1，2和4小时进行涂板测存活率，另外，共聚焦进行观察菌液，并采用透射电子显微镜进行表征。
实验例4：
分别构建两种结肠炎小鼠模型，研究PDNI对炎症部位免疫细胞的调控。
首先，在饮水中添加3wt％DSS，连续饮用7天，分为两组，其中一组灌胃PBS，另外一组灌胃PDNI。不做任何处理的小鼠作为空白对照组。连续灌胃5天后，采集小鼠的血液以及肠组织进行分析。将小鼠结肠纵向剖开，剪成0.5×0.5cm的小片，采用EDTA进行消化。将消化后的组织加入细胞消化液中(胶原酶IV、Dispase II和DNase I)37℃震荡40min，过滤膜后采用密度梯度离心(40％percoll/70％percoll)。离心之后，收集两层之间的细胞， PMA刺激之后采用抗体进行染色。
实验例5：
不同浓度的PDNI(50，20，10，5μg/mL)加入到2×105个巨噬细胞中共培养12h 经洗涤后采用CD86和MHCII流式抗体进行染色。另外，通过将PDNI和CD4+T细胞共孵育研究PDNI和淋巴细胞的作用，过程如下：首先，将淋巴细胞用含有IL-2的RIPM1640 完全培养基进行分散，然后，加入在CD3和CD28抗体以及TGF进行刺激，并加入PDNI (20μg/mL)进行共孵育，连续培养4天后，采用流式抗体染色并进行检测。
另外，将DC细胞分为3组，分别加入PBS，LPS(5μg)和LPS/PDNI(5/20μg)，共孵育12h后收集上清进行IL-10，IL-1β，IL-6和TNFα等炎症因子的检测。将细胞离心洗涤后进行流式抗体染色。另外，将CD4+T细胞加入到刺激后的DC后共孵育4天之后，采用流式抗体进行染色。
实验例6：
Balb/c小鼠用3％DSS饮用水预处理1周后发生结肠炎。未经预处理的小鼠作为对照。将结肠炎小鼠随机分为5组，每日给予PBS、EcN(2×108CFU)，EcN@PDNI(2×108CFU)、PDNI(10mg/kg)和ASA(60mg/kg)，分别治疗5天。实验期间每隔一天称重一次，用二氧化碳窒息处死小鼠。取小鼠血液和结肠进行组织病理学分析。血液经4000g离心5分钟，取上清，检测IL-1β和IL-6的浓度。
实验例7：
采用恶唑酮诱导法建立小鼠结肠炎模型。Balb/c小鼠称重，背部剃毛1cm×1cm，后滴加3％(溶于丙酮和橄榄油的混业溶液)恶唑酮，不含恶唑酮的混合液作为对照组，连续8天记录小鼠体重，到第8天时体重低于初始体重95％的小鼠舍去不用。将小鼠平均分组，3.5-F导管经肛门注入1％(溶于50％乙醇溶液)恶唑酮，停留1min，后将结肠炎小鼠随机分为5组，每日给予PBS、EcN(2×108CFU)，EcN@PDNI(2×108CFU)、PDNI(10mg/kg) 和ASA(60mg/kg)分别治疗5天。治疗后，用二氧化碳窒息处死小鼠。收集小鼠血液和结肠进行组织病理学分析。血清样品在4000g离心5分钟。血液经4000g离心5分钟，取上清，检测IL-1β和IL-6的浓度。
结果
1.PDNI对小鼠炎症部位免疫的调控
通过在饮用水中给予小鼠3％DSS，构建小鼠结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型。然后，研究PDNI对发炎结肠固有层单核细胞(LPMC)的免疫调节活性。因为Treg、Th1、Th2和Th17细胞的丰度失衡与炎症的进展密切相关，因此，主要检测LPMC中Treg、Th1、 Th2和Th17细胞的丰度。
结果如图1所示，未经DSS预处理的小鼠和给予PBS的DSS小鼠用作对照(图1.a)。PDNI明显增加了结肠炎小鼠的结肠长度(图1.b和c)。LPMC用CD4-Percp-cy5.5/Foxp3-PE或CD4-FITC/IFNγ-PE-cy7/IL-4-APC/IL-17A-PE等抗体对Treg、Th1、Th2和Th17细胞进行分类(图1.e、g、i和k)。PDNI显著降低CD4+IFNγ+细胞的百分率，LMPC中的CD4+IL-4+ 和CD4+IL-17A+细胞(图1.h、j和l)，并上调CD4+Foxp3+细胞(图1.f)。此外，使用 PDNI增加了Treg/Th1、Treg/Th2和Treg/Th17的比率(图1.m-o)，令其恢复到与未感染小鼠相同的水平，表明PDNI具有抗炎作用。由于Treg/Th17的提高，服用PDNI的小鼠血清中IL-17A的浓度降低，而与服用PBS的小鼠相比，IL-10没有显示出差异(图1.d和图 2.b)。
此外，图2表明，与PBS组小鼠比较，PDNI可降低TGFβ水平(图2.a)。
我们进一步建立了CD4+T细胞依赖性结肠炎模型，在用1％三硝基苯磺酸背部预处理后，通过肛门给予2.5％的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(图3.a)。PDNI可显著提高LMPC 中Treg/Th1、Treg/Th2和Treg/Th17的比值(图3.b-d)，证明PDNI可通过调节Treg、Th1、 Th2和Th17细胞来减轻炎症。
2.PDNI对树突状细胞和淋巴细胞的调控
通过PDNI对DC和CD4+T细胞的免疫调节能力，进一步解释炎症组织中LPMC中细胞的变化。由于DC上MHCII负责向CD4+淋巴细胞呈递抗原，因此,通过研究PDNI对DC 上CD86和MHC-II表达的影响来研究PDNI对免疫的影响。当浓度高达125μg/ml时，PDNI 对DC也没有明显的毒性(图4.d)。PDNI可降低DC上CD86和MHC-II的表达(图4.a-c)，从而抑制DC的成熟和抗原呈递。我们进一步研究了PDNI对脂多糖激活的DC的免疫抑制能力。分别用PBS、LPS和LPS/PDNI处理细胞。PDNI有效地抑制了LPS对DC的活化， CD86和MHC-II的表达降低反映了这一点(图4.e-g)。PDNI可提高细胞上清中IL-10的水平，降低IL-1β，IL-6和TNFα的浓度(图4.h-k)，这也表明PDNI具有降低MHC II 表达和抑制炎症细胞激活的能力。
另外，通过将PDNI和CD4+T细胞共孵育研究其调节CD4+T细胞中Treg和Th17之间免疫平衡的能力。
首先，将细胞分为3组，分别加入CD3&CD28、CD3&CD28抗体/TGFβ和CD3&CD28 抗体/TGFβ/PDNI，共同孵育4天，然后，用CD25-PE-cy7、CD4-FITC、IL-17A-PE或 Foxp3-APC流式抗体进行标记(图5.a)。与Foxp3+细胞相比，PDNI能够降低抗CD3、 CD28和TGFβ刺激的CD4+T细胞中IL-17A+细胞的百分比(图5.b和c)。相应地，PDNI 提高了Treg/Th17的比率(图5.d)，可以抑制炎症部位的免疫过度反应。其次，将CD4+T 细胞与分别经PBS、LPS和LPS/PDNI预处理的DC共培养。如图5.e-h所示，与LPS预处理的DC相比，LPS/PDNI预处理的DC不仅降低了IL-17A+细胞的百分比，而且增加了 Foxp3+细胞的比率。与LPS/PDNI预处理的DC共培养导致Foxp3+/IL-17A+的增加，表明 PDNI上调了CD4+T细胞中Treg/Th17的比率。综上所述，PDNI通过降低DC上MHCⅡ的表达，直接逆转T细胞对Th17的刺激，提高Treg的百分率。对T细胞和DC的免疫调节作用可简单地归因于聚多巴胺的降解使DA从PDNI中释放出来。
3.EcN对PDNI的负载及EcN@PDNI的表征
IBD是由化学试剂入侵或抗原引起的对肠道不适当的免疫反应，目前确切的原因仍不清楚。传统的免疫抑制剂可以调节免疫系统的活动，延缓炎症进展。然而，由于对其他疗法无反应或仅对类固醇有反应的患者的病情缓解。其应用受到了限制。另一方面，肠道微生物目前的研究进展为结肠炎的有效治疗提供了靶点。IBD的发生伴随着肠道微生物菌群失调和分类多样性的降低，导致病原菌的积累和移位。增加微生物区系中益生菌的丰度对治疗有益。因此，发明人在此将免疫调节与肠道微生物群调节相结合，以阐述多巴胺免疫调控系统的潜在应用。
鉴于多酚结构的粘附行为，采用PDNI分别包裹活的益生菌。益生菌可以促进PDNI进入肠道，从而保护细菌在口服给药后免受胃酸损伤。以益生菌EcN为例，之前的研究证明了其对诊断和治疗有益。EcN@PDNI通过在室温下将细菌与DA在Tri-HCl中振荡0.5小时制备(图7.a)。随着DA浓度的增加，EcN上出现的PDNI密度增加(图6)，表明DA 在细菌上的自聚合。透射电镜图像显示，用1mg/ml的DA孵育可形成完整的涂层(图2-9b)。采用PDNI修饰之后，细菌的水合尺寸从1200纳米增加到1750纳米(图7.c)。相反，zeta 电位从-12.-0.5下降至-16.3-0.4mV(图7.d)。扫描电子显微镜图像显示EcN的表面相对光滑，在PDNI修饰后变得非常粗糙(图7.e)。流式细胞仪分析表明，用FITC标记的PDNI 修饰后，荧光强度显著增强(图7.f)。与未修饰的EcN相比，FITC标记的PDNI和EcN 表达的mCherry之间的荧光信号重叠，进一步验证了DA在细菌上的自聚合(图7.g)。与 MODE-K细胞共孵育24h，EcN@PDNI对上皮细胞细胞基本没有细胞毒性(图8)。
4.PDNI对EcN的保护作用
由于益生菌口服后胃酸和胆汁酸能使细菌失活，因此通过体外将益生菌加入到模拟胃液和模拟胆酸中，研究EcN@PDNI在模拟胃液和胆酸中的存活率。与EcN相比，EcN@PDNI具有更高的存活率，比未包衣细菌高5～10倍(图9.a、b和图10。未修饰的细菌在暴露于模拟胃酸4小时后严重受损，而EcN@PDNI保持其初始形态(图11)。与未包衣细菌相似的生长曲线证实，EcN@PDNI在模拟肠液中正常增殖(图9.c和图12.b)，表明PDNI 保护细菌免受环境损伤，对其增殖也没有明显的影响。我们通过孵育进一步监测了PDNI 涂层的稳定性EcN@PDNI在模拟肠液中，发现FITC标记的PDNI的荧光信号随着细菌生长而降低(图12.a-b)。同时，细菌的zeta电位从-15.5上升到-12.5mv，平均粒径从2减小到1.3μm(图12.c-d)。另外，EcN@PDNI的上清液在280nm处的吸光度增加，进一步表明PDNI的脱落(图13)。
体内成像系统捕获的荧光图像显示，细菌在修饰PDNI后表现出相同的荧光强度(图 9.d)。小鼠给药后，EcN@PDNI组荧光强度高于EcN组小鼠(图9.e)。给药后4小时，进一步观察到胃肠道的增强信号(图9.f-g)。为了统计EcN@PDNI在肠道中的存活率，从胃、小肠、盲肠和结肠收集组织和相关内容物，进行细菌平板计数。发现EcN@PDNI具有更高的存活率(图9.h-i)。用PDNI修饰后，EcN存活的数量增加了几个数量级。这些结果表明，PDNI除了具有免疫调节作用外，还可以保护EcN免受胃肠道应激，从而提高 EcN在体内的存活率。
5.EcN@PDNI对DSS诱导结肠炎的治疗
通过构建DSS诱导的结肠炎研究了EcN@PDNI对结肠炎的治疗效果。以一线药物ASA作为对照。此外，未感染小鼠和给予PBS的模型小鼠作对照组。DSS诱导的小鼠结肠炎的特征与人类相似，包括体重减轻、血性腹泻、溃疡形成和上皮细胞丧失。为评价其疗效，连续5次口服EcN(2×108CFU)，EcN@PDNI(2×108CFU)、PDNI(10mg/kg)和 ASA(60mg/kg)，并在给药后5天处死(图14.a)。EcN@PDNI能有效逆转模型小鼠的血性腹泻和体重减轻(图14.c)。EcN@PDNI组小鼠的结肠长度比给予PBS、EcN、PDNI 和ASA的小鼠分别长26、10、12和19cm(图14.b、d)。给药后的细菌能够增强益生菌在胃肠道内定植(图14.e)，比喂食EcN的小鼠高10倍。与服用PBS的小鼠相比，EcN@PDNI 降低IL-1β在血清中的水平，接近于未感染小鼠的血清(图14.f)。此外EcN@PDNI组小鼠血清中IL-6的浓度最低，证明其能有效的减轻炎症反应(图14.g)。与所有治疗小鼠相比，EcN@PDNI组小鼠结肠髓过氧化物酶水平显著降低(图14.h)。近端和远端结肠的病理检查显示，PBS处理的小鼠出现上皮细胞丢失(图14.i)。对PBS处理的小鼠也观察到 DSS诱导的炎症、出血和水肿。尽管给予EcN、PDNI或ASA可产生有益的效果，但使用 EcN@PDNI最有效地消除炎症并减少出血和水肿。以上结果表明，EcN@PDNI可以有效的提高治疗效果。
6.EcN@PDNI对肠道菌群和免疫的调控
为了证明EcN@PDNI具有抑制发炎结肠的免疫过度反应和积极调节肠道微生物群的能力，首先分析了EcN、EcN@PDNI和ASA治疗的DSS小鼠LPMC中Treg，Th1，Th2和 Th17细胞的丰度。与EcN和ASA的比较，EcN@PDNI提高LMPC中CD4+Foxp3+细胞的百分比(图15.a)和Treg/Th1、Treg/Th2和Treg/Th17的比率(图15.b-d)。此外，EcN@PDNI 治疗不仅降低了IL-17A的水平，并增加了IL-10的水平(图15.e、g)。与给予EcN的小鼠相比，EcN@PDNI显著降低TGFβ的水平(图15.f)。与PDNI类似，EcN@PDNI对IBD 小鼠具有免疫调节活性。
通过分析治疗后微生物组的变化来研究EcN@PDNI对肠道菌群调节作用是作用。EcN@PDNI显著的增加了肠道菌群的丰富度和均匀度，如ACE和Shannon指数的提高(图15.h、i)。主成分分析(PCA)和主坐标分析(PCoA)都表明EcN@PDNI与PBS、EcN、 PDNI和ASA组小鼠相比，菌群分组存在显著差异(图15.j、k)。EcN@PDNI显著降低了肠道中的变形杆菌(一个由病毒病原体组成的门)和致病菌(致病属)的丰度(图15.l、 m)。DSS诱导可使变形杆菌门和志贺菌属的数量分别增加53％和48％，EcN@PDNI治疗后抑制率分别为72％和99％(图15.n、o)。同时，EcN@PDNI显著增加了结肠定植修复肠粘膜菌属的分布(图15.p)。另外，肠粘膜修复菌属丰度的提高进一步改善了肠道通透性。
7.EcN@PDNI对恶唑酮诱导结肠炎的治疗
通过直肠内施用恶唑酮(1％)，建立了另外一种结肠炎的小鼠模型，该结肠炎具有远端结肠粘膜的典型急性炎症，其特征在于粘膜中的上皮损伤和浸润淋巴细胞。进行了类似于DSS模型鼠的治疗以评估EcN@PDNI的治疗效果(图16.a)。PBS、PDNI和ASA给药的小鼠出现远端结肠粘膜发炎，而在用EcN@PDNI处理的小鼠中未观察到明显的症状(图 16.b)。在EcN@PDNI处理期间，小鼠的体重更有效地恢复(图16.c)。用EcN@PDNI 处理的小鼠的结肠长度与未感染的小鼠相当，比分别用PBS和ASA的小鼠的结肠长两倍(图 16.d)。EcN@PDNI在肠道中显示出高水平的定殖(图16.e)。此外，与PBS相比，EcN@PDNI 降低了髓过氧化物酶和包括IL-1β和IL-6在内的炎性细胞因子的水平(图16.f-h)。在所有接受治疗的小鼠中，EcN@PDNI组小鼠的IL-1β和MPO的浓度最低。PBS组小鼠的远端结肠切片中出现了严重的炎症和水肿，因为恶唑酮可能会诱导远端结肠的损伤(图16.i)。与其他治疗组相比，EcN@PDNI有效缓解了炎症和水肿，并显示出最低的组织病理学评分 (平均评分0.6)。与临床ASA相比，EcN@PDNI在恶唑酮小鼠的治疗中也显示出更高的活性。
综上，使用聚多巴胺纳米颗粒等具有治疗效果的活性材料，作为免疫抑制剂，且证明了其参与多巴胺系统进行免疫调控的能力。PDNI可以激活Treg细胞，并抑制Th细胞，包括Th1，Th2和Th17细胞。除了直接干预外，PDNI还抑制DC的激活，DC的激活进一步上调了Treg/Th17的比例。在局部发炎的组织中，PDNI抑制了免疫过度反应，并有助于炎症反应的逆转。通过用PDNI修饰活菌，将肠道菌群调节和多巴胺免疫调节结合起来。除免疫抑制能力外，PDNI还可以防止细菌在口服后受到环境损害。修饰的细菌不仅抑制过度活跃的免疫反应，而且还积极调节与结肠炎相关的小鼠的肠道微生物组。与氨基水杨酸相比，在两种动物结肠炎模型中，多巴胺免疫调节和肠道菌群调节相结合具有更好的治疗效果。
以上仅是本发明的具体实施例以及用于证实本发明申请发明构思的实验例，但并不以此限制本发明。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种表面被生物活性药物修饰的细菌，其特征在于，所述细菌是由小分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，所述细菌是选自肠道菌群中的益生菌。
2.根据权利要求1所述的表面被生物活性物质修饰的细菌，其特征在于，所述益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等中的一种或多种；所述小分子药物是儿茶酚胺类神经递质。
3.制备表面被生物活性药物修饰的细菌的方法，其特征在于，所述方法包括：通过多巴胺在有氧碱性溶液中氧化和自聚合的方式，以聚多巴胺颗粒的形式粘附在细菌的细胞膜表面，其中该聚多巴胺颗粒是纳米级颗粒，其直径约为100-500nm。
4.根据权利要求3所述的方法其特征在于，进一步地，所述细菌是选自肠道菌群中的益生菌，聚多巴胺负载量为0.25-1.5mg/109CFU。
5.一种治疗炎症性肠病的药物递送体系，其特征在于，所述系至少包括一种上述表面被生物活性药物修饰的细菌，其中该细菌是由小分子药物修饰在细胞膜外表面的细菌，且该细菌是选自肠道菌群中的益生菌。
6.根据权利要求5所述的药物递送体系，其特征在于，所述益生菌为乳酸菌、双歧杆菌和大肠杆菌等中的一种或多种；所述小分子药物是儿茶酚胺类神经递质。
7.根据权利要求6所述的药物递送体系，其特征在于，所述小分子药物是多巴胺。
8.根据权利要求6所述的药物递送体系，其特征在于，所述药物递送体系还可以包括药学上可接受的载体。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括上述任一种表面被生物活性药物修饰的细菌及其药学上可接受的载体。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，在所述药物组合物中，该被修饰细菌的含量为1-99.9重量％，其中每109CFU活的细菌细胞的平均负载聚多巴胺颗粒的量为0.25-1.5mg。
11.一种表面被生物活性药物修饰的细菌在制备用于治疗炎症性肠病的药物方面的用途。
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