CN116115582B - 前药封装的工程化益生菌及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种前药封装的工程化益生菌及其制备方法与应用。该工程化益生菌是采用脂质体和巴柳氮组成益生菌外衣，然后将其修饰到益生菌表面而制成。本专利采用脂质体和巴柳氮组成益生菌外衣，成功赋予益生菌较强的消化液抗性，使益生菌进入肠道后仍具有较高的生物活性。巴柳氮进入结肠后，在偶氮还原酶作用下释放5‑ASA，可有效抑制炎症，并为鼠李糖乳杆菌GG的定植提供良好的肠道微环境。本专利开发了一种简单有效的方法构建口服工程化益生菌，通过巴柳氮与LGG协同作用，实现溃疡性结肠炎的高效治疗。

Description

前药封装的工程化益生菌及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种前药封装的工程化益生菌及其制备方法与应用。
背景技术
人类肠道中居住着数以万亿计的微生物，它们形成了一个复杂的群落，被统称为肠道微生物。研究表明肠道微生物在免疫调节、维持体内平衡和宿主健康方面发挥着至关重要的作用。溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性、复发性疾病，通常始于直肠，然后逆行向近端发展，可累及部分或全结肠以及回肠末端，目前已影响全球数百万患者。有研究证明UC和肠道微生物结构紊乱有关，而益生菌能够调节肠道微生物结构，因此益生菌疗法被认为是一种治疗UC的有效策略。然而，现有益生菌疗法存在不少于以下2点缺陷：(1)益生菌经口服进入消化道后，受到胃液，肠液等影响，其生物活性会降低；(2)快速的胃肠道运转使得益生菌很难有效在肠道中定植，因此无法有效发挥其益生作用以预防和治疗疾病。为了克服这些挑战，人们开发了几种方法，如将益生菌做成胶囊、片剂或微丸。虽然这些方法在保护益生菌免受酸和酶分解方面取得了成功，但益生菌肠道滞留时间短的问题仍未得到有效解决。因此，提高益生菌在极端条件下的生存能力，同时加强其增殖和定植，对于益生菌预防和治疗疾病是至关重要的。
菌体表面修饰是一种简单但有效地赋予菌体外源特性的策略，但包裹、修饰只能短暂的保护菌体免受胃肠道中消化液的影响，无法保证菌体在UC复杂的病理环境下有效在肠道中定植。UC的病理特点之一是胃肠道炎症稳态失衡，这会导致病灶处产生大量的活性氧，进而降低益生菌的生存能力和肠道定植能力。黏液层是肠道上皮防御的关键部分，是肠道微生物的栖息地。然而，UC中黏液层是被破坏的，黏液层破坏会导致微生物结构失调，微生物结构失调又会引起黏液层进一步破坏，从而形成恶性循环。研究表明，抑制炎症有助于肠道黏液层修复，肠道微生物结构改善，益生菌定植，进而促进UC治疗。临床数据也表明，肠道微生物结构改善与抗炎治疗相结合，能够提升UC治疗的效果。在临床UC治疗中，5-氨基水杨酸(5-ASA)通过发挥抗炎作用改善UC，然而，5-ASA口服后会在上消化道被大量吸收，因此利用率很低。为了改善5-ASA在结肠中的释放情况，5-ASA的前体药物巴柳氮(简称：Bal)因具有结肠酶响应释放，系统吸收少，人体耐受性好等优点，被广泛用于临床。
公开号为CN102014926A的发明专利公开了一种用于治疗炎性肠病的方法和试剂盒。该方法为：给需要治疗的哺乳动物施用活性剂和益生菌的组合物，活性剂为巴柳氮、氨基水杨酸盐等，益生菌为鼠李糖乳杆菌、乳酸菌等；公开号为CN112006285A的发明专利公开了一种靶向定植的益生菌粉及其制备方法，该益生菌粉包括益生菌、益生元和包埋层；益生菌包括两歧双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸链球菌、长双歧杆菌和德式乳杆菌保加利亚亚种。虽然该上述发明公开了巴柳氮和鼠李糖乳杆菌可联合应用用于治疗炎性肠病，以及益生菌增加包埋层以加强其定植，但是上述发明在药效和益生菌的靶向定植能力方面仍存在一定局限，且均未公开采用Bal构建益生菌外衣。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于提高益生菌生物活性和肠道定植能力的益生菌外衣。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于提高益生菌生物活性和肠道定植能力的益生菌外衣，所述益生菌外衣由LPC和巴柳氮组成；所述LPC和巴柳氮的摩尔比为1:1～1:5；所述益生菌为LGG。
进一步，所述LPC和巴柳氮的摩尔比优选为1：1。
进一步，所述益生菌外衣为LPC-Bal，所述LPC-Bal结构式如式Ⅲ所示；所述LPC的结构式如式Ⅰ所示；所述巴柳氮的结构式如式Ⅱ所示；
进一步，所述Bal苯环(4，5)上的氢质子的核磁峰范围为6.00-8.00ppm；LPC上的-CH3核磁峰在3.79ppm；LPC上-CH2和-CH3的核磁峰在0.89-1.00ppm。
本发明的目的之二在于提供一种所述益生菌外衣的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述益生菌外衣的制备方法，包括以下步骤：
S1：将所述巴柳氮、4-二甲氨基吡啶、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，反应得反应液1；
S2：添加所述LPC于S1所得反应液1中，制得反应液2；
S3：透析、冷冻干燥，得所述益生菌外衣。
进一步，所述巴柳氮、所述4-二甲氨基吡啶、所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1-5：1-5。
进一步，所述巴柳氮、所述4-二甲氨基吡啶、所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比优选为1：1.2：1.2。
进一步，S1中，反应条件为：40℃搅拌反应4h。
进一步，所述巴柳氮和所述LPC的摩尔比为1：1。
进一步，S2中，反应时间为8h。
进一步，所述透析为：用500Da的透析袋在超纯水中透析8h，每2h换一次水。
本发明的目的之三在于提供一种益生菌组合物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
益生菌组合物，所述益生菌组合物由外部的包裹层和内部的益生菌组成；所述包裹层为目的一所述的益生菌外衣；所述益生菌为LGG。
进一步，所述益生菌优选为LGG。
本发明的目的之四在于提供一种采用所述组合物制得的工程化益生菌。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
采用所述组合物制得的工程化益生菌，所述工程化益生菌由LPC-Bal和LGG组成；所述LPC-Bal包裹所述LGG。
本发明的工程化益生菌原理：由脂质体LPC和Bal组成的益生菌外衣(LPC-Bal)赋予了LGG较强的消化液抗性，以确保LGG进入肠道后仍具有较高的生物活性；前药进入结肠后，在偶氮还原酶作用下释放5-ASA，抑制炎症，改善病理环境；益生菌外衣破裂后释放出LGG，LGG能够有效的在肠道中定植，并调节肠道微生物结构。药物与益生菌协同作用，安全、高效治疗UC。
本发明的目的之五在于提供一种所述工程化益生菌的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述工程化益生菌的制备方法，包括以下步骤：
A1：将采用目的二所述的制备方法制备所述益生菌外衣；
A2：将LGG悬浮于预冷氯化钙溶液中，制备LGG悬液；
A3：将A1制得的益生菌外衣、胆固醇溶于氯仿，旋蒸得到脂膜；加入A2制得的LGG悬液，制得所述工程化益生菌。
进一步，所述LGG菌落总数为1×109CFU。
进一步，所述预冷氯化钙溶液浓度为12.5mM，用量为1mL。
进一步，所述益生菌外衣、胆固醇、氯仿的质量体积比为：16.7mg：2.26mg：1mL。
进一步，制备所述脂膜的旋蒸条件为37℃。
进一步，A3中，所述LGG悬液加入到旋蒸瓶后，无压旋转40min，3000rpm离心清洗两次，最后重悬于200μL PBS。
本发明的目的之六在于提供一种所述巴柳氮和所述LGG的联合应用在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明的目的之七在于提供一种所述益生菌组合物和/或所述工程化益生菌在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
本发明的目的之八在于提供一种所述益生菌组合物和/或所述工程化益生菌在制备降低溃疡性结肠炎的炎症相关因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量和/或mRNA表达量的药物中的应用。
本发明的目的之九在于提供一种所述工程化益生菌在制备改善肠道屏障和/或调节肠道微生物的药物中的应用。
进一步，所述工程化益生菌在制备抑制肠道黏液层和绒毛结构破坏的药物中的应用。
本发明的目的之十在于提供一种所述益生菌外衣在制备用于提高益生菌生物活性和肠道定植能力的产品中的应用。
进一步，所述益生菌为LGG。
本发明的有益效果在于：
1.本发明采用Bal构建益生菌外衣，Bal在偶氮还原酶作用下释放5-ASA，可有效抑制炎症，并为LGG的定植提供良好的肠道微环境。LGG与Bal协同作用实现溃疡性结肠炎的高效治疗；
2.本发明制得的LPC-Bal所构建的涂层在胃酸和肠道消化液条件下保持稳定，可赋予LGG较强的消化液抗性，并在肠道中实现定植；本发明的益生菌外衣显著提高了细菌的生物活性和肠道定植能力；
3.本专利开发了一种简单有效的方法构建口服工程化益生菌，该工程化益生菌具备消化液抵抗，UC病理环境改善，肠道微生物结构调节等功效，具体的，该口服工程化益生菌对肠道炎症和肠道屏障具有调节作用，能够有效抑制肠道黏液层和绒毛结构破坏，显著降低肠道炎症；同时正向调节肠道微生物结构，并通过增加益生菌而减少致病菌的相对丰度来调节UC中失调的肠道菌群。在溃疡性结肠炎的预防和治疗中发挥重要作用。
附图说明
图1为LBL的合成；
图2为600MHz核磁共振波谱表征LPC-Bal；
图3为代表性透射电子显微镜(TEM)图像；
图4为LGG和LBL激光共聚焦显微镜(CLSM)图像；
图5为x-z和y-z视野荧光图片；
图6为LGG和LBL在MRS培养基中，37℃下生长曲线；
图7为LBL和LGG在SGF中孵育后菌体存活数量；ns：无显著性差异，“***”：P<0.001，“**”：P<0.01；
图8为LBL和LGG在SIF中孵育后菌体存活数量；ns：无显著性差异，“**”：P<0.01，“***”：P<0.001；
图9为LBL和LGG在SGF中孵育后流式细胞仪检测结果；
图10为LBL和LGG在SIF中孵育后流式细胞仪检测结果；
图11为LBL和LGG在SGF和SIF中孵育后CLSM结果；
图12为LBL和LGG在SGF和SIF中孵育后TEM结果；
图13为Bal在连二亚硫酸钠溶液中释放5-ASA示意图；
图14为Bal在连二亚硫酸钠溶液中释放5-ASA结果；
图15为Caco-2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达量，其中，图15-A为Caco-2细胞中IL-6的mRNA表达量；图15-B为Caco-2细胞中IL-1β的mRNA表达量；图15-C为Caco-2细胞中TNF-α的mRNA表达量；“***”：P<0.001；
图16为P-p65免疫荧光染色结果；
图17为P-p65免疫荧光统计结果；“***”：P<0.001；
图18为LBL治疗UC示意图；
图19为灌胃LGG和LBL 4h后小动物成像表征结果；
图20为动物实验示意图；
图21为代表性结直肠长度图片；
图22为结直肠长度统计结果；“*”：P<0.05；
图23为小鼠血浆中IL-6水平、IL-1β水平、TNF-α水平；其中，图23-A为小鼠血浆中IL-6水平；图23-B为小鼠血浆中IL-1β水平；图23-C为小鼠血浆中TNF-α水平；“*”：P<0.05，“**”：P<0.01，“***”：P<0.001；
图24为小鼠结肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA表达量；其中，图24-A为小鼠结肠组织中IL-6的mRNA表达量；图24-B为小鼠结肠组织中IL-1β的mRNA表达量；图24-C为小鼠结肠组织中TNF-α的mRNA表达量；“*”：P<0.05，“***”：P<0.001；
图25为MPO免疫组化染色结果；
图26为MPO免疫组化染色积分光密度值；“***”：P<0.001；
图27为小鼠结肠组织ZO-1免疫荧光染色结果；
图28为小鼠结肠组织occludin免疫荧光染色结果；
图29为荧光强度统计结果，其中，图29-A为ZO-1荧光强度统计结果；图29-B为occludin荧光强度统计结果；“*”：P<0.05，“***”：P<0.001；
图30为小鼠结肠组织阿立新蓝染色结果；
图31为杯状细胞数量和面积统计结果；其中，图31-A为杯状细胞数量统计结果；图31-B为杯状细胞面积统计结果；“**”：P<0.01，“***”：P<0.001；
图32为小鼠结肠组织H&E染色结果；
图33为Alpha多样性指数；其中，图33-A为Chao 1指数；图33-B为Shannon指数；图33-C为Inverse-Simpson指数；“*”：P<0.05，“**”：P<0.01，“***”：P<0.001；
图34为Beta多样性；其中，图34-A为主成分分析结果；图34-B为主坐标分析结果；图34-C为非度量多维标度结果；
图35为热图表征科水平肠道微生物丰度前10的菌种；
图36为LEfSe结果表征各组特征菌种；
图37为Circos图表征优势菌种在不同组中的比例。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
以下实施例中，LGG购买自中国广东省微生物研究所菌种保藏中心,保藏编号为：GDMCC 1.2223；Caco-2细胞购买自美国菌种保藏中心，保藏编号为：ATCC HTB-37；MRS培养基购买自青岛海博生物技术有限公司；DMEM培养基购买自美国Gibco公司；LPC、Bal、FITC、Cy5购买自上海麦克林生化科技有限公司；抗体及其他相关试剂包括ZO-1、occludin、MPO等均采购自国内供应商并按操作说明使用。
巴柳氮(Bal)：5-氨基水杨酸(5-ASA)的前体药物，具有结肠酶响应释放，系统吸收少，人体耐受性好等优点，可有效改善5-ASA在结肠中的释放情况。
LPC：1-十六酰-SN-丙三醇-磷酸胆碱；
LGG：鼠李糖乳杆菌GG。
实施例1.LPC-Bal的制备
将Bal、4-二甲氨基吡啶、N-羟基硫代琥珀酰亚胺按照1:1.2:1.2摩尔比溶于N,N-二甲基甲酰胺，40℃搅拌反应4h。随后，加入与Bal等摩尔的LPC，继续反应8h。反应结束后用500Da的透析袋在超纯水中透析8h，每2h换一次水。透析结束后，冷冻干燥备用。
实施例2.LBL的制备与表征
1.制备方法：将LGG(1×109CFU)悬浮于1mL预冷氯化钙(12.5mM)溶液中。LPC-Bal(16.7mg)与胆固醇(2.26mg)溶于1mL氯仿，置于旋转蒸发瓶中，37℃旋蒸形成脂膜。将LGG悬液加入到旋蒸瓶中，无压旋转40min，3000rpm离心清洗两次，最后重悬于200μL PBS中备用。
2.表征：LBL的合成步骤如图1所示，将Bal连接到LPC上，并修饰到LGG表面以构建工程化益生菌LBL。为了证明Bal已经成功连接到LPC上，本实施例对样品的氢核磁共振图谱进行分析，结果如图2所示，6.00-8.00ppm范围的核磁峰属于Bal苯环(4，5)上的氢质子；LPC上的-CH3核磁峰在3.79ppm；在0.89-1.00ppm处发现LPC上-CH2和-CH3的核磁峰；结果表明Bal已经成功的连接到LPC上。同时，本实施例采用透射扫描电镜分析LBL的外貌形态，结果如图3所示，菌体外侧有明显的半透明边界，表明LPC-Bal已经成功修饰到LGG表面。
本实施例采用FITC-DSPE-mPEG2000和Cy5-NHS分别对LPC-Bal和LGG进行染色，并用激光共聚焦显微镜(CLSM)进行分析，结果如图4所示，LPC-Bal和LGG有明显的共定位，表明LPC-Bal已经成功修饰到LGG表面。接着对CLSM结果进行三维成像分析，如图5所示，可以看到在x-z和y-z方向上LPC-Bal和LGG都是重合的，进一步表明LPC-Bal已经成功修饰到LGG表面。
实施例3
1.体外抗性实验
将胃蛋白酶(3.2g)、NaCl(2.0g)溶于去离子水(1000mL)中，HCl调节至pH 2.0，随后用0.22μm滤膜过滤除菌，得到人工胃液(SGF)。将KH2PO4(6.8g)、胆盐(3g)、胰蛋白酶(10g)溶于去离子水(1000mL)中，NaOH调节至pH 6.8，随后用0.22μm滤膜过滤除菌，得到人工肠液(SIF)。将等量的LGG和LBL(1×109CFU)分别加入到等体积的SGF和SIF中。37℃振荡培养，在固定时间点取出100μL菌悬液，MRS培养基离心清洗3次，涂布到MRS平板中，37℃培养24h并计数。
2.实验动物
7周龄C57BL/6雄性小鼠，购买自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，SPF级条件下饲养，12h明暗交替，适应性饲养1周，随后开始实验。该动物实验得到重庆大学实验动物福利与伦理委员会批准。将小鼠随机等分为6组：
a)饲喂无菌饮用水7天，随后更换为PBS饲喂5天；
b)饲喂含有3％右旋糖酐硫酸钠(DSS)的无菌饮用水7天，随后更换为PBS饲喂5天；
c)饲喂含有3％ DSS的无菌饮用水7天，随后更换为PBS饲喂5天，并灌胃Bal；
d)饲喂含有3％ DSS的无菌饮用水7天，随后更换为PBS饲喂5天，并灌胃LGG(1×109CFU)；
e)饲喂含有3％ DSS的无菌饮用水7天，随后更换为PBS饲喂5天，并灌胃LBL(1×109CFU)。
实验结果：
(1)LBL体外抗性实验结果
实施例2中LPC-Bal成功修饰到菌体表面后，本发明随后验证了LPC-Bal对LGG生长的影响和LBL体外抗性能力，结果如图6所示，相比于LGG，LBL的生长出现明显延后，但菌体生长速率和生长总量并没有出现明显变化。本发明还验证了LPC-Bal对LGG在SGF和SIF中的保护作用；将等CFU的LGG和LBL分别置于SGF和SIF中，37℃孵育，在预定的时间点中取出等体积样品统计菌体数量。由结果可知，SGF会造成大量菌体死亡，当孵育至4h时，LGG组中菌体已基本完全死亡，但LBL组仍有部分菌体存活，表明LPC-Bal能有效帮助LGG抵抗SGF的影响，详见图7。SIF孵育结果也表现出相似的趋势，LGG对SIF具有一定的抗性，孵育2h后，LGG和LBL组菌体存活数量无明显差异，随着时间的延长，LGG组菌体存活数量明显少于LBL组，孵育至6h，LBL组中存活菌体数量是LGG组的1.6倍，表明LPC-Bal能有效帮助LGG抵抗SIF的影响，详见图8。
为了进一步证明消化液抗性是由LPC-Bal赋予的，本发明对LPC-Bal进行染色，并用流式细胞仪检测荧光强度变化情况。由结果可知，当LBL在SGF中赋予4h，仍能检测到荧光，而食物在小鼠胃部停留时间是小于4h的，详见图9。LBL在SIF中孵育2h至6h期间，荧光强度只发生了少量的降低，详见图10。这表明LPC-Bal是比较稳定的。随后本发明使用CLSM分析了LBL在SGF和SIF中赋予后LPC-Bal和LGG的共定位情况，结果如图11所示，随着孵育时间的延长，LPC-Bal会从菌体上脱落，但仍有一些菌体和LPC-Bal有共定位。TEM对LBL形态进行分析可知，在SGF中孵育4h，部分菌体出现破损，但仍有部分菌体依旧被LPC-Bal包被，详见图12。结果表明，LPC-Bal所构建的涂层在胃酸和肠道消化液条件下都是稳定的，证明该方法是有效的。
(2)益生菌外衣抗炎效果检测结果
由于Bal是5-ASA的前药，因此本发明进一步探究了Bal的药物释放情况以及抗炎效果。首先，用连二亚硫酸钠作为还原剂模拟偶氮还原酶，研究了连二亚硫酸钠作用下Bal的药物释放动力学，详见图13。在连二亚硫酸钠溶液下，Bal在前0.5h会剧烈释放出5-ASA，随后释放速度减缓，到8h时，完全释放完毕；而在无连二亚硫酸钠的溶液中，至8h，药物仅释放了15％，详见图14。随后，通过DSS处理的Caco-2细胞，研究了Bal的体外抗炎潜力。本发明通过qPCR检测了炎症相关因子IL-6，IL-1β和TNF-α在Caco-2细胞中的mRNA表达量，结果显示，在DSS的诱导下，炎症相关因子的mRNA表达量明显上升，而5-ASA对这些炎症因子有明显的抑制作用；由于Bal在细胞培养基中无法有效释放5-ASA，因此并没有表现出明显的炎症抑制作用，但是在体内，在偶氮还原酶作用下，是能够释放5-ASA的，因此Bal具有良好的抑制DSS诱导的炎症升高的作用，详见图15。TLR4/NF-kB信号通路相关蛋白P-p65的结果也表明，5-ASA能够有效降低P-p65表达水平，详见图16和图17。综上所述，Bal能够响应偶氮还原酶释放5-ASA以调节Caco-2细胞炎症水平，这表明LPC-Bal组成的益生菌外衣具有良好的抗炎功效。
(3)LBL治疗UC
为了评估益生菌外衣在帮助LGG抵抗体内肠道环境和增强肠道定植上的作用，申请人用Cy5-NHS对LGG进行染色并用小动物成像系统进行表征。给小鼠灌胃同样数量的LGG和LBL后，4h时检测菌体荧光强度发现LBL组菌体强度明显高于LGG组，详见图18和图19。这个差异可能是因为LPC-Bal组成的益生菌外衣能够保护菌体免受消化液的影响以保持菌体的完整性。该结果表明，该益生菌外衣能显著提高细菌的生物活性和肠道定植能力。
在确定益生菌外衣的保护能力和促进肠道定植能力后，随即开始证明LBL对DSS诱导的小鼠UC的治疗能力。给小鼠饮用含3％ DSS的水7d，诱导形成溃疡性结肠炎，随后进行5d的治疗，详见图20。治疗结束后取小鼠盲肠至直肠部分，通过比较长度可以发现LBL能够有效保护DSS诱导的结肠炎，详见图21和图22。此外，本实施例还评估了LBL对肠道炎症和肠道屏障的调节作用。在LBL作用下，血浆中炎症相关因子IL-6，IL-1β和TNF-α的含量明显降低，详见图23。肠道组织处IL-6，IL-1β和TNF-α的mRNA表达量也明显降低，详见图24。MPO是一种氧化应激和炎症标志物，免疫组化结果如图25和图26所示，结果表明LBL组MPO表达量明显低于其它处理组。这表明LBL能够显著降低DSS诱导的炎症。
(4)LBL改善肠道屏障
肠道通透性是肠屏障的功能特征，肠屏障功能障碍可导致肠通透性增加和肠道炎症性疾病。因此，本发明对紧密连接相关蛋白的表达量进行探究。由图27～图29可知，DSS会导致ZO-1和occludin的表达量降低，而LBL对DSS导致的通透性升高有明显的抑制作用。上皮杯状细胞分泌的黏液是重要的肠道屏障，而UC的病理特点之一就是杯状细胞耗竭。结肠组织阿立新蓝染色结果如图30～图31所示，结果表明，DSS导致杯状细胞数量剧烈减少，而LBL能够显著改善DSS造成的破坏。结肠组织H&E染色结果如图32所示，该结果显示，DSS组中肠道绒毛结构出现明显的破坏，而LBL组中未见明显的破损。这些结果说明LBL能够有效抑制DSS造成的肠道黏液层和绒毛结构破坏。
(5)LBL调节肠道微生物
肠道微生物平衡被认为在UC中起着重要作用。因此，申请人分析了LBL对小鼠肠道微生物结构的影响。利用Qiime2来分析肠道微生物扩增子序列变异(ASV)以计算多样性指标。如图33所示，相较于其他DSS诱导组，Alpha多样性指数，包括Chao 1，Shannon，inverseSimpson指数在LBL组中都是明显升高的，表明LBL能够正向调节肠道微生物结构。
Beta多样性，包括主成分分析(PCA)，主坐标分析(PCoA)和非度量多维标度(NMDS)被用于探索和可视化肠道微生物的差异程度。Beta多样性结果如图34所示，PBS+3％ DSS组与其他组肠道微生物结构有明显差异，而正常对照组与药物/菌体干预组空间距离较近，甚至有部分重合，表明药物或菌体干预能够正向调节肠道微生物结构，且LBL效果最好。随后，本实施例利用热图对科水平相对丰度前10的肠道微生物进行分析，结果如图35所示，LBL显著增加了Muribaculaceae，Lachnospiraceae，Lactobacillaceae，norank_o_Clostridia_UCG-014，Prevotellaceae和Ruminococcaceae的相对丰度，降低了Enterobacteriaceae，Staphylococcaceae和Eggerthellaceae的相对丰度。线性判别分析(LEsSe)结果如图36所示，该结果表明，在属水平上，正常组和药物/菌体干预组的特征性菌种主要为益生菌。g_Prevotellaceae_NK3B31_group是一种产丁酸益生菌，如图37所示，59％的g_Prevotellaceae_NK3B31_group都在LBL组中。以上结果表明LBL能够通过增加益生菌而减少致病菌的相对丰度来调节UC中失调的肠道菌群。

Claims (7)

1.用于提高益生菌生物活性和肠道定植能力的益生菌外衣，其特征在于，所述益生菌外衣为LPC-Bal，由LPC和巴柳氮组成；所述益生菌为鼠李糖乳杆菌GG；
所述LPC-Bal结构式如式Ⅲ所示；所述LPC的结构式如式Ⅰ所示；所述巴柳氮的结构式如式Ⅱ所示；
2.权利要求1所述的益生菌外衣的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将所述巴柳氮、4-二甲氨基吡啶、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于N,N-二甲基甲酰胺，反应得反应液1；
S2：添加所述LPC于S1所得反应液1中，制得反应液2；
S3：透析、冷冻干燥，得所述益生菌外衣。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述巴柳氮、所述4-二甲氨基吡啶、所述N-羟基硫代琥珀酰亚胺的摩尔比为1：1-5：1-5。
4.工程化益生菌，其特征在于，所述工程化益生菌由权利要求1所述的益生菌外衣和鼠李糖乳杆菌GG组成；所述益生菌外衣包裹所述鼠李糖乳杆菌GG。
5.权利要求4所述的工程化益生菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A1：将采用权利要求2所述的制备方法制备所述益生菌外衣；
A2：将所述鼠李糖乳杆菌GG悬浮于预冷氯化钙溶液中，制备鼠李糖乳杆菌GG悬液；
A3：将A1制得的益生菌外衣、胆固醇溶于氯仿，旋蒸得到脂膜；加入A2制得的鼠李糖乳杆菌GG悬液，制得所述工程化益生菌。
6.权利要求4所述的工程化益生菌在制备用于治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
7.权利要求1所述的益生菌外衣在制备用于提高益生菌生物活性和肠道定植能力的产品中的应用。
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