CN112741842A

CN112741842A - 口服富勒烯材料在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病药物中的应用

Info

Publication number: CN112741842A
Application number: CN202110146030.3A
Authority: CN
Inventors: 王春儒; 贾旺; 甄明明; 白春礼; 姜俐赜
Original assignee: Beijing Fullcan Biotechnology Co ltd; Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Beijing Fullcan Biotechnology Co ltd; Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-05-04
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112741842B

Abstract

本发明提供了一种口服富勒烯材料在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病药物中的应用。所述应用是富勒烯材料在制备预防和/或治疗如下1)‑7)中的至少一种疾病或病况的药物或药物载体中的应用：1)预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病；2)保护心肌细胞；3)抑制细胞的凋亡；4)促进细胞的氧化损伤修复；5)改善心脏的结构和功能；6)缓解心肌缺血带来的心肌水肿、出血、超微结构改变等症状；7)改善心肌缺血引起的远端组织损伤。

Description

口服富勒烯材料在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及口服富勒烯材料在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物中的应用。

背景技术

心血管系统疾病是全球病死率最高的疾病，占总死亡率的三分之一，其中以急性心肌梗死最为严重。每年有超过300万急性ST段抬高性心肌梗死患者，这类患者最有效的治疗方法为及时、有效的再灌注治疗。再灌注治疗改善心肌供血的同时伴随着一系列病理生理反应，包括过氧化反应、炎症、细胞内钙超载，最后出现不可逆的细胞凋亡和坏死，这种因再灌注损伤所致的心肌损伤称为再灌注损伤。再灌注损伤与分子、细胞、组织上的改变如细胞死亡、炎症、中性粒细胞活化和氧化应激等有关。

目前，心肌缺血再灌注损伤的防治措施及相关药物主要有：(1)通过减轻钙超载与改善能量代谢障碍(钙离子通道阻滞剂、腺苷、阿卡地辛、钠-氢交换抑制剂)；(2)自由基清除剂和抗氧化剂(别嘌呤醇、依达拉奉、硝普钠等)；(3)保护血管内皮细胞(血管紧张素转换酶抑制剂)；(4)抑制炎性反应(类固醇、利多卡因等)；(5)心脏停搏液的代谢添加剂(丙酮酸、氨基酸)等。这些药物通过多种不同机制对抗心肌缺血再灌注损伤，最终达到一个相同的目的：减轻心肌损伤，恢复心脏功能。然而这些防治药物并不总能在心肌缺血再灌注损伤的不同阶段获得理想的疗效，而且也会带来一系列副作用，因此，开发新型、安全、高效的心肌缺血再灌注损伤的防治药物依然很有必要。

近年来，随着纳米科技的迅猛发展，纳米材料越来越多的在生物医药领域中应用。其中，富勒烯/金属富勒烯纳米材料，是一种具有多功能的纳米材料，能够抗氧化，抗炎症，治疗肿瘤，抗菌，降低血糖，加快伤口愈合，治疗脂肪肝，保护心脏、骨髓等。富勒烯及其衍生物能有效抑制氧化应激所致的细胞损伤。此外，富勒烯材料由于体积小(直径约0.7nm)，可以穿透细胞膜，扩散到细胞核，并移位到细胞器中，进一步调控MAPK信号蛋白(ERK、p38和JNK)的表达，这些蛋白与干细胞存活、增殖、凋亡和心肌发生有关。近期，有研究报道，富勒烯醇/藻酸盐水凝胶具有良好的抗氧化活性(能有效清除超氧阴离子和羟基自由基)，可以有效去除心梗(MI)区过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，提高植入的棕色脂肪源干细胞(BADSCs)的保留和存活，诱导血管生成，促进心脏功能恢复。但是其治疗心肌缺血再灌注损伤的效应鲜有人报道，并且，该报道中是将富勒烯醇/藻酸盐水凝胶直接注射在心梗区进行治疗的，操作难度较大，临床可及性较低。

综上，能够找到一种治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病，减轻患者病情，副作用较小的药物，并且用最方便的给药途径——口服给药，具有重要临床研究价值。

富勒烯是除石墨、金刚石和无定型碳之外碳元素的另一种同素异形体。这类物质指的是由碳原子组成的笼状结构，其含量最多的分子是C60，然后是C70、C84，其次是含量相对较少的C76、C78、C82等。另外由于富勒烯的碳笼内部为空腔结构，因此其内部空腔可内嵌不同原子、离子或原子簇，被称之为内嵌富勒烯，如La@C60，表示La内嵌在C60的笼状结构中，@表示at，形象的表达了内嵌的含义。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种富勒烯材料以口服的方式预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病。本发明的目的之二在于提供一种使用上述富勒烯材料并且治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物和方法。本发明的目的之三在于提供一种使用上述富勒烯材料并且改善心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的保健食品。

为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：

在本发明的一个方面，本发明提供了一种口服富勒烯材料在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物中的用途，所述富勒烯材料包括富勒烯、金属富勒烯、所述富勒烯或金属富勒烯的水溶性修饰物、所述富勒烯或金属富勒烯的脂溶性修饰物、所述富勒烯、金属富勒烯或脂溶性富勒烯分散在油溶液中制成的富勒烯组合物以及所述富勒烯的衍生物的至少一种。

在本发明的另一个方面，本发明提供了一种预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的口服药物组合物或保健食品，所述药物组合物、所述保健食品包括富勒烯材料作为活性组分，所述富勒烯材料包括富勒烯、金属富勒烯、所述富勒烯或金属富勒烯的水溶性修饰物、所述富勒烯或金属富勒烯的脂溶性修饰物、所述富勒烯、金属富勒烯或脂溶性富勒烯分散在油溶液中制成的富勒烯组合物以及所述富勒烯的衍生物的至少一种。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述口服药物组合物或保健食品还包括可接受的载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述富勒烯包括空心富勒烯、内嵌金属富勒烯中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述空心富勒烯为一种或多种通式为C2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；C60，C70，C82或C84等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述金属富勒烯为内嵌金属富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述内嵌金属富勒烯包括M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MxA3-xN@C2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的任意一种，30≤n≤60；0≤x≤3；可选的为Gd@C82。上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述富勒烯的水溶性修饰物包括选自下组的一种或多种富勒烯：(1)表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基、水溶性氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法、药物组合物或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸残基是指水溶性氨基酸在修饰富勒烯时，失去氨基酸分子的一部分后剩余的不完整的氨基酸，即：氨基酸残基是氨基酸分子的一部分，其是不完整的氨基酸。缺少氨基酸分子中的任何一个部分都算是氨基酸残基，如：失去氨基酸中氨基上的氢、失去氨基酸中羧基上的氢或羟基等。可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述富勒烯的水溶性修饰物为水溶性羟基化钆金属富勒烯、水溶性羟基化C60、水溶性羟基化C70、水溶性氨基化钆金属富勒烯可选的为Gd@C82(NH₃)n、水溶性氨基化C60、水溶性氨基化C70、水溶性羧基化钆金属富勒烯可选的为Gd@C82(COOH)n、水溶性羧基化C60、水溶性羧基化C70等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述富勒烯的水溶性修饰物通式为C2a(OH)b或M@C2d(OH)e，其中：30≤a≤60，可选的a为30或35；0<b<50，可选的0<b<30，还可选的b＝13、20、24等；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La等；30≤d≤60，可选的d为41或30或35；0<e<50，可选的0<e<30，还可选的e＝13、20、24等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和肽链中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括：脂质体、蛋白、聚合物胶束和细胞膜载体中的至少一种；其中：所述蛋白包括白蛋白或转铁蛋白；所述聚合物胶束含有聚乙丙交酯聚乙二醇、聚赖氨酸以及壳聚糖的至少之一。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，富勒烯材料的平均粒径为1～5000nm，可选的平均水合粒径为1-200nm。粒径在上述范围内的富勒烯活性物质，生物兼容性好，易均匀分散于常用辅料，制备简单，使其能够经由口服方式注入到生物体内。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，富勒烯的水溶性修饰物的修饰方法、包裹方法、负载方法和自组装方法不受特别限制，本领域技术人员可以根据富勒烯的具体组成以及药物的具体要求，选择适当的方法合成富勒烯的水溶性修饰物。例如：

(1)物理包覆的方法可以将原料富勒烯中的至少一种与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到与原料相应的包覆的富勒烯的水溶性修饰物，如聚乙二醇包覆的富勒烯和/或聚乙二醇包覆的内嵌金属富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的内嵌金属富勒烯。

(2)水溶性羟基富勒烯的制备可通过相转移催化剂参与的液液反应(Xing G etal,J.Phys.Chem.B.,2004(108):11473-11479)或将富勒烯本体直接与H₂O₂在碱性下反应得到。水溶性氨基富勒烯的制备可以通过将富勒烯固体粉末与H₂O₂和氨反应得到。由此，可以改善富勒烯表面的亲疏水性能，达到水溶性修饰的目的。可选的，水溶性羟基富勒烯的制备方法包括：(a)将过氧化氢水溶液(可选的，过氧化氢水溶液质量百分含量为1-30％)和碱性溶液(氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液(可选的，氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液的质量百分含量为10-80％)混合(可选的，按照过氧化氢水溶液和氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液的体积比为1-10:1混合)，在混合液中加入富勒烯本体/内嵌金属富勒烯本体(可选的，在每10-200ml混合液中加入20-500mg富勒烯本体/内嵌金属富勒烯本体)，在温度50-80℃下反应(可选的，所述反应为搅拌反应4-24h；可选的，搅拌转速为600-1300r/min，优选1000r/min)，过滤，保留滤液。(b)将所述滤液加入过量的乙醇(可选的，所述乙醇浓度为85％-100％)，经过离心(可选的，离心转速为6000-13000r/min，优选10000r/min，离心时间为1-10min)后收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液。(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理，可选的，透析至所述溶液在室温的电导率小于1μs/cm；可选的，将经过所述透析后的所述溶液冷冻干燥，以便获得羟基化富勒烯固体/羟基化内嵌金属富勒烯固体。

(3)水溶性载体负载富勒烯可以通过非共价键修饰方法，将富勒烯与水溶性载体，如脂质体、聚合物胶束、蛋白等添加至油性溶剂中，通过疏水-疏水相互作用，将富勒烯活性物质与上述水溶性载体结合。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述油溶液可以为单一组分的油，也可以为不同油溶液形成的混合油。通常为植物油，如橄榄油，亚麻籽油，葵花籽油，玉米胚油，大豆油，芝麻油，米糠油，胡麻油，红花籽油，核桃油等，也包括动物油脂，如角鲨烷等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述富勒烯分散在油溶液中的方法是将富勒烯与油溶液的混合液经球磨或超声后，依次经离心去除沉淀，然后将所得上层液过滤去除颗粒，即得。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，富勒烯组合物中富勒烯的浓度为0.01-100mg/mL，该范围的公开应当被视为是范围内所有数值的公开，可选的有0.01-0.8mg/mL，0.01-1mg/mL，0.01-10mg/mL，10-20mg/mL，20-30mg/mL，30-40mg/mL等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，将富勒烯与油溶液混合的过程中，每1ml油溶液中混合0.05-1000mg富勒烯，该范围的公开应当被视为是范围内所有数值的公开，可选的有0.05-1mg，0.05-10mg，0.05-100mg等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，将所述混合液经球磨或超声30min-15h，可选的有8-12h，10h等。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，混合液经球磨或超声后，离心前，还包括将所述混合液置于阴凉干燥避光保存，静置一定的时间的步骤。可选的，一定的时间指2h-24h。

上述应用、方法、药物组合物、保健食品在另一种实施方式中，所述治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病包括以下的至少一种：

1)预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病(优选的，所述的用途中，所述的心肌缺血再灌注损伤包括急性心肌梗死治疗充血恢复期心脏受损，所述的缺血性心脏病包括各类急、慢性冠脉综合征，进一步优选为心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病)；

2)保护心肌细胞；

3)抑制心肌细胞的凋亡；

4)促进心肌细胞的氧化损伤修复；

5)改善心脏的结构和功能；

6)缓解心肌缺血再灌注带来的心肌水肿、心肌出血、超微结构的改变等症状；

7)有效改善心肌缺血再灌注损伤带来的远端组织(包括但不局限于小肠组织)损伤；

上述应用中，富勒烯材料预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的方法，包括如下步骤：向需要预防和/或治疗的心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的生物体给予口服有效剂量的所述口服富勒烯材料，预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病。

上述药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。载体、赋形剂和稀释剂既可以是充当有效成分的载体、赋性剂和稀释剂，也可以是充当介质的载体、赋性剂和稀释剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜的载体、赋形剂和稀释剂可以是固体、半固体或液体材料，如：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(water syrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁或液状石蜡。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂。

上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/mL，可选的为0.01-3mg/mL，0.01-5mg/mL，0.01-10mg/mL，0.01-20mg/mL，0.01-30mg/mL，0.01-40mg/mL，0.01-50mg/mL；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/g，可选的为0.01-3mg/g，0.01-5mg/g，0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、小型猪、猴子和人等。

上述方法在另一种实施方式中，所述有效成分的施用剂量为0.1mg/kg/d-100mg/kg/d，可选的为1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d等，施用疗程可以为5天-30天，根据病情可短期服用或长期服用；有效成分的施用方式主要为口服给药。

上述方法在另一种实施方式中，所述富勒烯材料在生物体内的使用浓度范围为0.1mM-10mM。所述富勒烯和/或金属富勒烯材料是以其水溶性/油溶液的形式存在，生物体体内的使用浓度范围为500ppm-10000ppm。由此，可以进一步提高该药物的使用效果。

本发明所用的术语“治疗”包括其通常被接受的含义，该含义包括阻止、预防、抑制、改善以及减缓、停止或逆转所产生症状或预期病变的发展。照此，本发明涵盖治疗性和预防性的施用。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“原料富勒烯”、“富勒烯”、“富勒烯本体”或其他没有修饰语的富勒烯均是指没有经过改性的富勒烯。

本发明中所有范围的公开应当视为对范围内所有子范围和所有点值的公开。例如：1-1000的公开应当视为也公开了1-200，200-300等范围，同时也公开了200、300、400、500、600、700、800、900和100等点值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)发明人经过大量实验发现，富勒烯材料能够较快的在体内代谢，生物相容性好，对生物体毒副作用小。

(2)该药物给药的方式具体为口服摄入，经消化系统过滤吸收，副作用更小，疗效显著。

(3)该药物主要为口服给药，因为口服给药是最方便的给药途径，与注射相比，它可以提高患者的依从性，临床可及性高，并且对于某些慢性疾病，可以更安全、更早的进行治疗。

(4)所述的心肌缺血再灌注损伤包括但不限于急性心肌梗死治疗充血恢复期心脏受损，所述的缺血性心脏病包括但不限于各类急、慢性冠脉综合征，进一步优选为心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病。

(5)该药物不仅可以代谢出生物体外，而且口服摄入后，毒副作用低，起效快。同时，其对正常细胞没有明显的细胞毒性，安全无毒。

(6)该药物因为是口服方式给药，直接与肠道组织接触，食物或者药物被小肠吸收后，从小肠上皮细胞分泌出一些因子。这些因子可以激活心肌细胞上的一些受体，进而发挥多效作用。调节因心肌缺血引起的体内氧化应激、炎症状态，修复心脏和各主要相关组织。

(7)本发明中对于心肌缺血再灌注损伤的防治，富勒烯材料可以在心肌缺血再灌注损伤模型成熟前使用作为预防效果，同时在心肌缺血再灌注损伤后使用，可快速防治和修复心肌缺血再灌注损伤中受损的心肌细胞和随后的其他器官损伤。

附图说明

图1为富勒烯C60材料的扫描电镜图像。

图2为不同浓度富勒烯C60材料处理对HUVEC细胞的活力影响。

图3为不同浓度富勒烯C60材料处理对HUVEC细胞氧化损伤后细胞活力的影响。

图4为流式细胞术检测不同浓度富勒烯C60材料处理对HUVEC细胞的氧化损伤后的细胞凋亡状态的影响。

图5为心肌缺血再灌注损伤模型动物实验流程图。

图6为术前小鼠心电图数据。

图7为阻断左前降支30min后小鼠的心电图数据。

图8为心肌缺血再灌注模型不同处理组小鼠的超声心动图。

图9为心脏组织的Masson染色观察。

图10为小肠(回肠)组织的H&E染色观察。

图11为肝脏、脾脏、肾脏组织的H&E染色观察。

图12为肺脏组织的H&E染色观察。

图13为流式细胞术检测小肠细胞数量变化。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例所用原料C60固体粉末使用转移弧法制得，分子量720，纯度99％。

实施例1：富勒烯材料的制备

取适量粒径2～3μm富勒烯C60粉末，与药用辅料微晶纤维素、共聚维酮、山嵛酸甘油酯等混合均匀，用压片机压制成每片200mg的片剂。

动物实验使用时，将片剂用纯化水溶解成混悬剂使用。

实施例2：富勒烯材料的粒径表征

取适量实施例1制备的富勒烯C60材料滴在洗干净的硅片上，待水分完全蒸发后，用扫描电子显微镜SEM(Hitachi，S-4800，日本)观察C60材料的形貌及粒径。

实验结果如图1所示，该C60材料的粒径为2～3μm。

实施例3：富勒烯材料对人脐静脉内皮细胞HUVEC的细胞毒性及氧化损伤修复效果

1.细胞培养条件：HUVEC细胞在细胞培养箱中培养(37℃，5％二氧化碳)，培养基为MEM，添加10％FBS和1％的青霉素-链霉素双抗溶液。

2.实验方法及结果：

(1)用WST-8的方法检测富勒烯材料有无细胞毒性

将密度为5×10^4/ml的HUVEC细胞悬液按200μl/孔接种于96孔板，在培养24h后，吸出上清液，换为200μl不同浓度的富勒烯材料使终浓度为0，10，20，40，60，80，100，200，400，500μg/ml，每组6个平行实验，培养24h。向每孔加入100μl CCK-8溶液(无色DMEM稀释)，分别测试不同组的OD值。实验重复三次。细胞增殖率(％)＝处理组/对照组。

相应的检测结果如图2所示，从图2可得知：C60浓度在500μg/ml以内对HUVEC细胞没有毒性。

(2)用WST-8的方法检测富勒烯材料对HUVEC细胞的氧化损伤修复效果

将密度为5×10^4/ml的HUVEC细胞悬液按200μl/孔接种于96孔板，孵育24h后，换为200μl浓度为0.2mM的H₂O₂孵育1h，然后加入不同浓度梯度的富勒烯材料孵育3h，用CCK-8检测细胞活力评价富勒烯材料的抗氧化损伤能力。相应的检测结果如图3所示，数据表明，C60浓度在20μg/ml时即表现出对HUVEC细胞的损伤修复趋势，随着C60浓度的增加，对HUVEC细胞的损伤修复效果逐渐增强。

(3)用流式细胞仪检测富勒烯材料对HUVEC细胞氧化损伤后细胞凋亡情况的影响

HUVEC细胞以1×10⁵/mL的密度种于12孔细胞培养板中，培养24小时后，然后弃掉旧培养基，更换为含0.6mmol/L的H₂O₂的MEM培养液(对照组换不含双氧水的MEM培养液)，孵育1小时后，弃掉旧培养基，分别加入含有0、20、80、200μg/ml的富勒烯材料的MEM培养液，37℃，600rpm，共孵育3小时。然后弃掉培养基，PBS洗涤3次。然后将细胞重悬在100μl结合缓冲液中(按说明书)，加5μl Annexin V和1μl PI，室温避光孵育15min后，在染色样品中加入400μl结合缓冲液后，尽快用流式细胞仪检测。

实验结果如图4所示，HUVEC细胞受600μM过氧化氢氧化损伤1小时后，正常细胞比例从正常组的82.19％减低到14.45％，早期凋亡细胞比例从17.74％上升到84.66％，晚期凋亡比例从0.06％上升到0.85％。而与C60共孵育3小时后，可见正常细胞比例上升，早期凋亡、晚期凋亡比例下降，而且变化具有剂量依赖关系。说明C60能够明显抑制氧化应激导致的细胞凋亡。

实施例4：富勒烯材料在动物实验中治疗心肌缺血再灌注损伤的效果

1.动物模型及分组

SPF级C57BL/6J小鼠，雄性，体重：22g±2g，周龄：6-8周。

手术方法：动物深度麻醉，确认麻醉状态后，备皮，安装好心电监护仪，消毒局部皮肤，铺洞巾后剪开肋间皮肤，钝性分离肌肉、打开心包膜，将心脏推出体外，暴露左冠状动脉前降支，用6-0无菌丝线快速结扎，打活结，看到心脏底部变白，用荷包缝法迅速关闭胸腔，挤压防止气胸，造成左室前壁心肌缺血。分别记录术前、缺血时心电图变化。

到达缺血时间以后，解开活结，再次关闭胸腔，缝合肌肉皮肤，进行心肺复苏。分别记录术前、缺血再灌注后的心电图变化。

分组：

a.假手术组(Sham)：按照MI/RI模型方法，只穿线，不结扎；

b.模型组(MI/RI)(心肌缺血再灌注损伤组)：阻断左前降支30min后，再灌注15d；

c.阳性药组依达拉奉(Edaravone)：阻断左前降支30min后，用依达拉奉处理1次(再灌注前10min，静脉注入15mg/kg)，再灌注15d；

d.富勒烯组(Fullerene)：阻断左前降支30min后，用富勒烯处理1+14×2次(再灌注前10min，灌胃1次，然后再灌注开始后，第1-14天，每天灌胃2次)，再灌注15d。

第15d时取材。图5为具体实验流程。

2.实验方法及结果

(1)实时心电监护，输出心电图：实时关注MI/RI造模情况

图6为术前小鼠心电图数据。图7为阻断左前降支30min后小鼠的心电图数据。

心电图显示，与手术前相比，结扎后出现T波高耸，ST段抬高，QRS波增宽。说明心肌缺血再灌注模型造模成功。

(2)超声心动图：测量左心室功能参数

图8为心肌缺血再灌注损伤的小鼠的超声心动图及左心室主要参数：舒张末期左心室内径(LVIDD，模型组增大)；收缩末期左心室内径(LVIDS，模型组增大)；射血分数(EF，泵血功能评价，模型组减小)；舒张末期左心室前壁厚度(LVAWD)；收缩末期左心室前壁厚度(LVAWS)；缩短分数(FS，模型组减小)。经过富勒烯材料及阳性药依达拉奉治疗后，左心室主要指标有不同程度的改善，其中，富勒烯材料作用效果更为明显。

实施例5：富勒烯材料在组织水平上治疗心肌缺血再灌注损伤的效果

1.实验方法

Masson染色：Masson染色是指用两种或三种阴离子染料混合，胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一。在心肌缺血再灌注模型中被染成蓝色的为梗死区域。

由实施例4，于第15天取假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、阳性药依达拉奉组、富勒烯组小鼠心脏，用4％多聚甲醛固定，并做好标记。然后用蜡块包埋，切片。石蜡切片脱蜡至水。铁苏木素液染核5min。水洗。盐酸酒精分化数秒。丽春红液5min。

快速水洗。1％磷钼酸分化2-5min。苯胺蓝1-3min。冰醋酸快速分化。100％酒精5min。100％酒精10min。透明。中性树胶封片。用数字切片扫描仪扫描分析。

(2)H&E病理(小肠，肝，脾，肾，肺)

由实施例4，于第15天将假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、阳性药依达拉奉组、富勒烯组小鼠颈椎脱臼法处死，分别取其小肠，肝，脾，肾，肺，用4％多聚甲醛固定，并做好标记。然后用蜡块包埋，切片。进行梯度脱水，不同浓度的乙醇(100％，95％，80％，70％)脱水5分钟。切片用苏木精染色7min，用水以及乙醇洗涤，用伊红染色3min，并用水和乙醇洗涤。最后切片封片后用数字切片扫描仪扫描分析。

(3)流式细胞术检测小肠细胞数量变化情况

由实施例4，于第15天将假手术组、心肌缺血再灌注损伤组、阳性药依达拉奉组、富勒烯组小鼠颈椎脱臼法处死，取其小肠(回肠2cm)，轻柔去掉内容物，减去PP结(派氏结)，径向剪开小肠。用PBS洗小肠5次，小肠基本干净。用10ml缓冲液I(HBSS+5mM EDTA+10mMHepes)洗小肠3次，15min/次，于37℃，平置。Vortex 15s换新buffer。用缓冲液II(HBSS+2％FBS+0.5mg/ml胶原酶II+0.5mg/ml胶原酶III+0.1mg/mL DNaseI)消化小肠3次，于37℃，20min/次，vortex 15s换新缓冲液，去掉第一次消化液，收集第二次、第三次消化的细胞。收集含有细胞的滤液，400g室温离心5min得到细胞沉淀。

根据相关抗体的说明书染流式抗体(7AAD区分死活细胞)，37℃，孵育30min，避光。加PBS，终止孵育。PBS洗3次，每次5min，1200rpm。

流式细胞仪检测信号(7AAD用FL3通道)。

2.实验结果

图9所示，Masson染色中，与对照组(假手术组)相比，心肌缺血再灌注损伤后，心脏组织梗死区域明显增加，而依达拉奉阳性药组及富勒烯治疗组均有不同程度的改善，富勒烯治疗组改善更为显著。

图10所示，H&E病理观察不同处理组小鼠小肠。通过小肠绒毛的病理观察以及长度统计，发现口服C60可以缓解心肌缺血再灌注损伤后小鼠回肠部位绒毛缩短、排列杂乱的病理状态。

图11所示，H&E病理观察不同处理组小鼠肝、脾、肾，结果发现，与对照组(假手术组)相比，心肌缺血再灌注损伤后，肝、脾、肾病理未出现明显变化。

图12所示，H&E病理观察不同处理组小鼠肺脏，结果发现，与对照组(假手术组)相比，心肌缺血再灌注损伤后，肺部存在炎症现象，依达拉奉处理后依然有炎症现象，而富勒烯治疗组有较明显的改善。

图13所示，与正常组及假手术组相比，心肌缺血再灌注损伤会引起小肠组织细胞数量下降，而口服富勒烯可以提升心肌缺血再灌注损伤后小肠组织细胞数量。

综上所述，富勒烯材料对心肌缺血再灌注损伤有较好的治疗效果，可以降低受损细胞的ROS水平，抑制炎性反应，促进心肌细胞存活率增加，心肌功能恢复。并且，口服富勒烯材料可以明显修复心肌缺血再灌注损伤后小肠组织的病理状态。

此外，该种材料基本无毒副作用。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

工业实用性

本发明口服富勒烯材料在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物中的应用通过权利要求1，实现将富勒烯材料用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物的制备中，抑制炎性反应，促进心肌细胞存活率增加，心肌功能恢复，缓解因心肌缺血引起的远端组织损伤。

Claims

1.口服富勒烯材料在制备用于预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的药物中的用途，所述富勒烯材料包括富勒烯、金属富勒烯、所述富勒烯或金属富勒烯的水溶性修饰物、所述富勒烯或金属富勒烯的脂溶性修饰物、所述富勒烯、金属富勒烯或脂溶性富勒烯分散在油溶液中制成的富勒烯组合物以及所述富勒烯的衍生物的至少一种。

2.一种预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病的口服药物组合物或保健食品，所述药物组合物、所述保健食品包括富勒烯材料作为活性组分，所述富勒烯材料包括富勒烯、金属富勒烯、所述富勒烯或金属富勒烯的水溶性修饰物、所述富勒烯或金属富勒烯的脂溶性修饰物、所述富勒烯、金属富勒烯或脂溶性富勒烯分散在油溶液中制成的富勒烯组合物以及所述富勒烯的衍生物的至少一种。

3.根据权利要求1所述的用途、权利要求2所述的口服药物组合物或保健食品，其特征在于，所述富勒烯包括空心富勒烯、金属富勒烯中的至少一种，

优选地，所述空心富勒烯为一种或多种通式为C2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，可选的为C60、C70，C82或C84；

优选地，所述金属富勒烯为内嵌金属富勒烯；

优选地，所述内嵌金属富勒烯包括M@C2n、M2@C2n、MA@C2n、M3N@C2n、M2C2@C2n、M2S@C2n、M2O@C2n和MxA3-xN@C2n中的一种或多种，其中：M、A均代表金属元素且M、A均选自Sc、Y和镧系金属元素中的任意一种，30≤n≤60；0≤x≤3；可选的为Gd@C82。

4.根据权利要求3所述的用途、权利要求3所述的口服药物组合物或保健食品，其特征在于，所述富勒烯的水溶性修饰物包括选自下组的一种或多种富勒烯：(1)表面修饰有亲水基团的富勒烯；(2)被亲水性生物小分子包裹的富勒烯；(3)被具有生物相容性的载体材料负载的富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系富勒烯；

优选地，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基、水溶性氨基酸残基中的一种或多种；优选地，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的用途、权利要求4所述的口服药物组合物或保健食品，其特征在于，所述富勒烯的水溶性修饰物为水溶性羟基化钆金属富勒烯、水溶性羟基化C60、水溶性羟基化C70、水溶性氨基化钆金属富勒烯可选的为Gd@C82(NH₃)n、水溶性氨基化C60、水溶性氨基化C70、水溶性羧基化钆金属富勒烯可选的为Gd@C82(COOH)n、水溶性羧基化C60、水溶性羧基化C70等，进一步可选的所述富勒烯的水溶性修饰物通式为C2a(OH)b或M@C2d(OH)e，其中：30≤a≤60，可选的a为30或35；0<b<50，可选的0<b<30，还可选的b＝13、20、24；M选自稀土金属，可选的稀土金属为Gd、La；30≤d≤60，可选的d为41或30或35；0<e<50，可选的0<e<30，还可选的e＝13、20、24。

6.根据权利要求4或5所述的用途、权利要求4或5所述的口服药物组合物或保健食品，其特征在于，表面修饰有羟基的富勒烯的制备方法包括将富勒烯本体直接与H₂O₂在碱性下反应得到，该制备方法进一步可选的包括：(a)将过氧化氢水溶液(可选的，过氧化氢水溶液质量百分含量为1-30％)和碱性溶液(可选的，氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液，可选的，氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液的质量百分含量为10-80％)混合(可选的，按照过氧化氢水溶液和碱性溶液(可选的，氢氧化钠溶液和/或氢氧化钾溶液)的体积比为1-10:1混合)，在混合液中加入富勒烯本体(可选的，在每10-200ml混合液中加入20-500mg富勒烯本体)，在温度50-80℃下反应(可选的，所述反应为搅拌反应4-24h；可选的，搅拌转速为600-1300r/min，优选1000r/min)，过滤，保留滤液；(b)将所述滤液加入过量的乙醇(可选的，所述乙醇浓度为85％-100％)，经过离心(可选的，离心转速为6000-13000r/min，优选10000r/min，离心时间为1-10min)后收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液；(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理；

优选地，所述富勒烯材料的平均水合粒径为1-5000nm，可选的平均水合粒径为1-200nm；

优选地，所述富勒烯分散在油溶液中的方法是将富勒烯与油溶液的混合液经球磨或超声后，依次经离心去除沉淀，然后将所得上层液过滤去除颗粒，即得；

优选地，所述富勒烯组合物中富勒烯的浓度为0.01-100mg/mL，可选为0.01-0.8mg/mL，0.01-1mg/mL，0.01-10mg/mL，10-20mg/mL，20-30mg/mL，30-40mg/mL等；

优选地，将富勒烯与油溶液混合的过程中，每1ml油溶液中混合0.05-1000mg富勒烯，可选为0.05-1mg，0.05-10mg，0.05-100mg等；

优选地，所述混合液经球磨或超声30min-15h，可选为8-12h，10h。

7.根据权利要求1、3-6任一项所述的用途、权利要求2-6所述的口服药物组合物或保健食品，其特征在于，所述预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤或缺血性心脏病包括以下的至少一种疾病或病况：

2)保护心肌细胞；

3)抑制心肌细胞的凋亡；

4)促进心肌细胞的氧化损伤修复；

5)改善心脏的结构和功能；

7)有效改善心肌缺血再灌注损伤带来的远端组织(包括但不局限于小肠组织)损伤。

8.如权利要求1、3-7任一项所述的用途，其特征在于：富勒烯材料，优选水溶性富勒烯材料或脂溶性富勒烯材料经由口服方式进入到生物体内；口服富勒烯材料后，可以经由“肠器官轴”(包括但不局限于肠心轴)发挥作用。

9.如权利要求1、3-8任一项所述的用途，其特征在于：所述心肌缺血再灌注损伤包括急性心肌梗死治疗充血恢复期心脏受损，所述的缺血性心脏病选自各类急、慢性冠脉综合征，进一步优选为心绞痛、心肌梗死、缺血性心肌病。

10.利用权利要求1、3-9任一项所述用途中的口服富勒烯材料预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的方法，包括如下步骤：向需要预防和/或治疗的心肌缺血再灌注损伤的生物体给予口服有效量的所述口服富勒烯材料，所述口服富勒烯材料经肠道、血液循环穿过内皮细胞间隙，到达心脏受损部位，预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤；

优选地，所述水溶性富勒烯材料和/或金属富勒烯材料是以其水溶液的形式存在，生物体体内使用浓度范围为0.1mM-10mM；优选地，所述脂溶性富勒烯和/或金属富勒烯材料是以其油溶液的形式存在，生物体体内的使用浓度范围为500ppm-10000ppm；

优选地，所述生物体为哺乳动物。