CN116236504A - 硫化铁纳米酶在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了硫化铁纳米酶(GFeSNs)在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用，体外实验结果显示GFeSNs可有效清除自由基，并呈现出GFeSNs浓度依赖性。体内实验采用注射甘油建立急性肾损伤模型，结果显示GFeSNs可有效缓解急性肾损伤，保护肾功能，应用前景广泛。根据临床用药需求,可将GFeSNs作为单一有效成分制成药物,也可与其他药物合用制成复方制剂。GFeSNs具有安全无毒副作用、有效、经济、实用等优点。

Description

硫化铁纳米酶在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及硫化铁纳米酶在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用，属于药物工业领域。
背景技术
炎症与氧化应激密切相关。过度炎症反应中的活性氧(ROS)可加重局部组织损伤，导致急性肾损伤(AKI)等疾病。临床上常用广谱抗氧化剂如N-乙酰-L-半胱氨酸和乙酰-L-肉碱来清除ROS，达到治疗AKI的目的。除此之外，补液和肾透析也是临床常用治疗AKI的方法。然而，这些治疗方式具有生物利用度低、毒性大和疗效低的弊端，患者遭受痛苦较大，从而限制了其在ROS相关疾病治疗中的临床应用。
有研究表明，铁基纳米材料因其高的生物相容性和生物功能在生物医学中得到了广泛的应用。硫化铁纳米酶(GFeSNs)具有清除多种自由基的活性，可以持续、稳定地释放多硫化氢，并表现出较强的抗炎作用和抗氧化性能。合成的硫化铁纳米酶具有高自由基清除活性，能够持续、稳定的释放多硫化氢，这种协同作用方式使硫化铁纳米酶具有广谱清除ROS的活性，包括·OH、O2 .-和H2O2。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供硫化铁纳米酶(GFeSNs)在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用；本发明的第二目的是提供GFeSNs在制备清除活性氧相关疾病药物中的应用。
技术方案：为了解决上述问题，本发明提供了GFeSNs在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用以及GFeSNs在制备清除活性氧相关疾病药物中的应用。
其中，所述药物为单组分制剂或复方制剂。
其中，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
本发明所述GFeSNs的制备方法包括以下步骤：
将氯化铁溶于乙二醇(EG)，超声搅拌，加入醋酸钠和谷胱甘肽(GSH)，继续超声搅拌，加热反应，洗涤，冻干，得到GFeSNs。
其中，所述氯化铁、乙二醇、醋酸钠和谷胱甘肽的摩尔比为1-10：20-40：20-40：1-10。
优选的，所述氯化铁、乙二醇、醋酸钠和谷胱甘肽的摩尔比为4-8：30-40：20-30：3-6。
其中，所述超声搅拌的时间为20-30min，所述继续超声搅拌的时间为20-30min。
其中，所述加热反应的温度为180-220℃，加入反应的时间为10-24h。
其中，所述洗涤是用无水乙醇和超纯水各洗涤三次以上。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：
本发明实验证实GFeSNs可有效减轻急性肾损伤，保护肾功能，其作用机制与GFeSNs缓解氧化应激有关，应用前景广泛。
根据临床用药需求,可将GFeSNs作为单一有效成分制成药物,也可与其他药物合用制成复方制剂。GFeSNs具有安全无毒副作用、有效、经济、实用等优点。
附图说明
图1为实施例1制备的GFeSNs的SEM图像；
图2为不同浓度的GFeSNs清除ROS能力检测图；
图3为不同浓度GFeSNs释放多硫化氢的荧光强度图；
图4为GFeSNs缓解NRK-52E细胞免受H2O2损伤图；
图5为GFeSNs对NRK-52E细胞的细胞毒性图；
图6为检测NRK-52E细胞内多硫化氢的水平图；
图7为GFeSNs对AKI小鼠的体内治疗效果研究图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1制备GFeSNs
将FeCl3(5mmol)溶解于EG(40mL)中，超声磁性搅拌15min。然后在上述溶液中缓慢加入NaAc·3H2O(40mmol)和GSH(4mmol)，连续超声搅拌至溶液变得透明。然后，将透明的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在200℃下反应12h。然后，用无水乙醇和超纯水各洗涤三次后，将所得产物冻干，得到GFeSNs在4℃保存供后续使用。
实施例2制备GFeSNs
将FeCl3(3mmol)溶解于EG(30mL)中，超声磁性搅拌15min。然后在上述溶液中缓慢加入NaAc·3H2O(30mmol)和GSH(5mmol)，连续超声搅拌至溶液变得透明。然后，将透明的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在200℃下反应10h。然后，用无水乙醇和超纯水各洗涤三次后，将所得产物冻干，得到GFeSNs在4℃保存供后续使用。
实施例3制备GFeSNs
将FeCl3(8mmol)溶解于EG(35mL)中，超声磁性搅拌15min。然后在上述溶液中缓慢加入NaAc·3H2O(25mmol)和GSH(6mmol)，连续超声搅拌至溶液变得透明。然后，将透明的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在200℃下反应18h。然后，用无水乙醇和超纯水各洗涤三次后，将所得产物冻干，得到GFeSNs在4℃保存供后续使用。
实施例4制备GFeSNs
将FeCl3(10mmol)溶解于EG(35mL)中，超声磁性搅拌15min。然后在上述溶液中缓慢加入NaAc·3H2O(35mmol)和GSH(8mmol)，连续超声搅拌至溶液变得透明。然后，将透明的溶液转移到聚四氟乙烯反应釜中，在200℃下反应24h。然后，用无水乙醇和超纯水各洗涤三次后，将所得产物冻干，得到GFeSNs在4℃保存供后续使用。
对实施例1制备的GFeSNs进行扫描电镜分析，结果如图1所示。图1为实施例1制备的GFeSNs的SEM图像(比例尺：100nm)，由图1可以看出，GFeSNs呈现出不规则片层结构，大小约为200nm。
实施例5不同浓度GFeSNs清除活性氧能力检测
分别用ABTS检测试剂盒、·OH检测试剂盒、H2O2检测试剂盒、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)检测GFeSNs(2.5-80μg/mL)清除活性氧能力。
取实施例1制备的GFeSNs用双蒸水或无水乙醇配成浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的GFeSNs溶液。
按照ABTS检测试剂盒、·OH检测试剂盒、H2O2检测试剂盒的试剂商说明检测ABTS、·OH和H2O2清除能力；将0.2mM的DPPH和不同浓度的GFeSNs溶液混合，水浴褪色后用酶标仪在517nm处检测吸光度。结果如图2所示，图2为不同浓度的GFeSNs清除ROS能力检测图，其中，(a)为不同浓度GFeSNs清除ABTS自由基效率图；(b)为不同浓度GFeSNs的DPPH清除效率图；(c)为不同浓度GFeSNs清除·OH自由基效率；(d)为不同浓度GFeSNs清除H2O2效率图；由图2可以看出，GFeSNs浓度越高，GFeSNs清除自由基能力越好，并呈现出浓度依赖性。
实施例6GFeSNs缓解细胞H2O2损伤效果评估
将硫烷硫检测试剂SSP4与不同浓度GFeSNs溶液(取实施例1制备的GFeSNs用双蒸水配成浓度分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL的GFeSNs溶液)以1:10的比例混合，避光反应30分钟后，吸取上清，使用黑色避光酶标板，设置激发波长470nm，发射波长515nm，扫描荧光强度，用双蒸水调零，结果如图3所示。图3为不同浓度GFeSNs释放多硫化氢的荧光强度图，由图3可以看出，GFeSNs浓度越高，生成的多硫化氢越多，呈现浓度依赖性。
将NRK-52E细胞以1×104的细胞密度铺于96孔板中，在37℃，5％ CO2的培养箱中培养24小时后分别加入上述不同浓度的GFeSNs溶液(0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)，在培养箱中孵育1小时后，加入浓度0.3mM的H2O2，在37℃，5％ CO2的培养箱中继续培养24小时后，用MTT检测细胞活力，结果如图4所示。图4为GFeSNs缓解NRK-52E细胞免受H2O2损伤图，由图4可以看出，GFeSNs能够缓解由H2O2引起的细胞损伤，在GFeSNs浓度仅为10μg/mL时即可使细胞活力显著提高至80％以上。
将NRK-52E细胞以1×104的细胞密度铺于96孔板中，在37℃，5％ CO2的培养箱中培养24小时后分别加入上述不同浓度的GFeSNs溶液(0μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL)，继续培养24小时后，用MTT检测细胞活力，结果如图5所示。图5为GFeSNs对NRK-52E细胞的细胞毒性图，由图5可以看出，GFeSNs在20μg/mL高浓度下对NRK-52E细胞没有毒性，并且能够促进细胞生长。
将NRK-52E细胞以2×105的细胞密度铺于24孔板中，在37℃，5％ CO2的培养箱中培养24小时后分别加入不同浓度的GFeSNs(0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL)，在37℃，5％CO2的培养箱中继续培养6h后，加入SSP4和DAPI染色后，用荧光显微镜进行成像，结果如图6所示.图6为检测NRK-52E细胞内多硫化氢的水平图(比例尺：20μm)，由图6可以看出，GFeSNs释放的多硫化物能够进入细胞，GFeSNs浓度越高，进入细胞的多硫化物越多，荧光越强。
实施例7：GFeSNs对AKI小鼠的体内治疗效果研究
将6-8周龄BALB/C小鼠适应性培养1-2天，分为正常对照组(PBS组)、AKI组、AKI给药组(AKI+GFeSNs组)，每组6-10只。实验前断水15h，小鼠肌肉注射8mL/kg 50％甘油建立急性肾损伤模型，2h后尾静脉注射0.5mg/kg GFeSNs溶液，PBS组和AKI组尾静脉注射PBS，所有小鼠正常进食饮水。1天后，将小鼠眼球取血分离血清检测血肌酐和尿素氮水平，取一部分肾组织固定于4％的多聚甲醛，进行H&E染色。同时，将一部分小鼠尾静脉注射高达1mg/kg的GFeSNs，分别在第7天和第30天处死小鼠，取心、肝、脾、肺和肾等主要器官进行H&E染色，实验结果如图7所示。图7为GFeSNs对AKI小鼠的体内治疗效果研究图，其中，(a)为各组小鼠的血肌酐(CRE)水平图；(b)为各组小鼠的尿素氮(BUN)水平图；(c)为各组小鼠的肾组织H&E染色图(比例尺：50μm)；(d)为各组小鼠的主要器官H&E染色图(比例尺：50μm)。由图7(a)、(b)可以看出，甘油诱导AKI组中血肌酐和尿素氮含量明显升高，肾功能恶化，而AKI给药组有效降低AKI组血肌酐和尿素氮水平。由图7(c)H&E染色结果显示，AKI小鼠肾皮质细胞大量凋亡，肾小管结构丢失，而AKI给药组的小鼠肾损伤明显减少，进一步证实GFeSNs对急性肾损伤时肾功能具有保护作用。由图7(d)H&E染色结果显示，H&E染色在不同时间点的心、肝、脾、肺、肾等部位和正常组相比均无明显变化，表明GFeSNs的生物安全性较高。

Claims (10)

1.GFeSNs在制备治疗急性肾损伤相关疾病药物中的应用。
2.GFeSNs在制备清除活性氧相关疾病药物中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物为单组分制剂或复方制剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂或口服液体制剂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述GFeSNs的制备方法包括以下步骤：
将氯化铁溶于乙二醇，超声搅拌，加入醋酸钠和谷胱甘肽，继续超声搅拌，加热反应，洗涤，冻干，得到GFeSNs。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述氯化铁、乙二醇、醋酸钠和谷胱甘肽的摩尔比为1-10：20-40：20-40：1-10。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述氯化铁、乙二醇、醋酸钠和谷胱甘肽的摩尔比为4-8：30-40：20-30：3-6。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述超声搅拌的时间为20-30min，所述继续超声搅拌的时间为20-30min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述加热反应的温度为180-220℃，加入反应的时间为10-24h。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述洗涤是用无水乙醇和超纯水各洗涤三次以上。
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