CN109999192A

CN109999192A - 一种利用纳米锌制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗

Info

Publication number: CN109999192A
Application number: CN201910329367.0A
Authority: CN
Inventors: 刁菁; 李乐; 于晓清; 王晓璐; 许拉; 樊英; 盖春蕾; 王淑娴; 叶海斌
Original assignee: Shandong Marine Biology Institute
Current assignee: Shandong Marine Biology Institute
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明涉及一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其中所使用的灭活剂为纳米锌，浓度为100mg/L，灭活条件为28℃孵育84h；利用此种方法制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗菌体结构完整性好、免疫原性强，显示出较甲醛灭活全菌疫苗更好的免疫保护效果，且安全无毒副作用，可推广应用于鱼类杀鲑气单胞菌病的防治。

Description

一种利用纳米锌制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗

技术领域

本发明属于水产养殖疫苗技术领域，具体涉及一种杀鲑气单胞菌的灭活疫苗。

背景技术

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是导致冷水鱼疖疮病及皮肤溃疡病的病原菌，其宿主范围广，包含至少五个亚型，是冷水鱼养殖过程中危害较重的一种常见致病菌，对于该菌的防治技术研究一直是国内外关注焦点。目前，疫苗是公认最安全有效的鱼类疾病免疫防控制剂，特别是针对大型深海网箱及养殖工船等装备型养殖模式，如果在入海前对鱼体实施疫苗免疫，能够提高鱼体对特定病原的抗病力，从而降低深海养殖过程中的疾病发生率。目前，灭活疫苗在水产疫苗行业仍是最为常用的疫苗类型,例如弧菌、气单胞菌和草鱼呼肠孤病毒等灭活疫苗，它们均表现出非常良好的免疫保护效果。病原的灭活是灭活疫苗生产中最为关键的环节,它直接影响着疫苗质量与最终的免疫接种效果，而灭活效果的好坏与灭活剂息息相关,理想的灭活剂可以在彻底灭活病原的前提下最大限度地保持抗原的免疫原性,从而保证鱼体在接种疫苗后机体产生最佳的免疫保护性应答,同时无论对鱼类还是人类,均不产生安全问题。化学灭活剂甲醛是最传统且应用最广泛的灭活剂，但是存在刺激性、致癌危险、破坏免疫原性、灭活不彻底、灭活时间长、灭活效果受多种因素影响等缺陷,因此筛选较甲醛更优良的灭活剂并建立更优的灭活策略已成为当前灭活疫苗研制中需要解决的迫切课题,对于生产高效、安全的灭活疫苗具有十分重要的意义。锌是一种动物必需的微量元素，多项研究表明锌能够影响动物的生长、发育、免疫、成骨以及代谢功能。同时，锌还具有良好的抗菌作用，特别是利用纳米技术研制的纳米锌抗菌剂，它具有表面效应、体积效应及量子尺寸效应等一系列纳米材料特有性质，能大大提升传统锌材料的抗菌性能，对于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌和病毒等均显示了的显著的杀灭作用。由于其性状稳定、资源丰富且对环境无毒害作用，目前已推广应用于医药、畜牧、公共卫生等多个领域，但是在疫苗研发方面尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于利用纳米锌杀菌作用强、稳定无毒等优良特性，制备出一种抗原完整性好、免疫原性强且无细胞毒性的杀鲑气单胞菌灭活疫苗，能够显著提高鱼体对杀鲑气单胞菌感染的免疫保护力，且安全无毒副作用。

本发明提供一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其中抗原菌株为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种RB0506株(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida RB0506)，于2018年12月03日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018849；

上述的灭活疫苗是利用纳米锌作为灭活剂制备而成的；

所述的制备方法如下：

将Mueller-Hinton(MH)肉汤中过夜培养的杀鲑气单胞菌室温6000rpm离心10min，细菌沉淀用生理盐水(0.9％NaCl溶液)重悬，再离心收集沉淀，重复2次，用生理盐水重悬并调整细菌浓度至1.5×10⁹个/mL，分装于离心管内；用生理盐水将纳米锌原液稀释后加入上述离心管内充分混匀，最终管内纳米锌终浓度分别为100mg/L，置于28℃孵育84h；然后6000rpm离心10min收集沉淀，并用生理盐水洗涤2次去除纳米锌；最后用生理盐水调整菌液浓度至OD₆₀₀为0.1±0.01。

本发明存在以下优点：

1)制作工艺简单，所用灭活剂为纳米材料，来源广泛，成分稳定，且有良好的菌体灭活效果。

2)所使用灭活方法，对菌体结构破坏小，保证了菌体良好的免疫原性，通过与传统甲醛制备的灭活疫苗对比，其免疫保护效果更优。

3)所制备的灭活疫苗安全性好、无毒副作用，适于推广使用。

附图说明

图1：不同浓度纳米锌在不同温度条件下最短时间灭活菌体的SDS-PAGE结果；

图2：扫描电镜检测不同浓度纳米锌在不同温度条件下灭活菌体的形态；

图3：不同灭活条件对杀鲑气单胞菌菌体抗原性的影响；

图4：纳米锌与甲醛灭活的杀鲑气单胞菌菌苗的免疫保护效果；

图5：不同浓度纳米锌作用下的EPC细胞形态。

具体实施方式

本发明通过对灭活剂在不同条件下对菌体蛋白和免疫原性影响，确定了最佳的灭活方法，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

实施例1：杀鲑气单胞菌菌株的分离及其毒性分析

(1)患病虹鳟取自山东日照养鱼厂，病鱼平均体重为(100±5)g，平均体长(17±2)cm，主要症状为体表溃烂、腹鳍基部充血发红、肛门突出、肠道充血。

(2)取症状典型的濒死病鱼，无菌条件下从鳍基部、肠道等病灶处挑取部分组织，划线于MH琼脂平板上，28℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌。

(3)将分离获得各菌株纯培养物，在MH琼脂平板上进行扩大培养，28℃培养24h后，用0.9％无菌生理盐水洗脱菌落，获得菌悬液，利用比浊法将菌株的细菌浓度定为1×10⁷CFU/mL，用于注射感染。

(4)实验用健康虹鳟每20尾1组，大小规格与患病虹鳟相同，并设生理盐水对照组。养殖水温为17±1℃，全天充气，每天换水50％。暂养7d后，腹腔注射0.2mL不同菌株的菌悬液，对照组注射同体积的0.9％无菌生理盐水。定时观察记录，取濒死鱼的病灶及内脏器官进行细菌再分离，所分离优势菌株再次感染虹鳟，观察结果。

(5)感染实验结果显示，仅有菌株RB0506显示出对健康虹鳟具有较高的毒力，可引起90％虹鳟死亡，且死亡虹鳟出现与患病虹鳟相同的症状。因此，证实菌株RB0506为引起虹鳟皮肤溃疡的病原。且在感染患病的虹鳟体内可再次分离到该菌株。

菌株RB0506于2018年12月03日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018849。

6)从GenBank下载已知杀鲑气单胞菌的封闭带毒素(ZOT)、OmpW基因和气溶素Aerolysin基因的序列，经过alignment分析比对后，根据保守序列设计用于扩增Primer5.0软件设计封闭带毒素(ZOT)、OmpW基因和气溶素Aerolysin基因的扩增引物，采用RT-PCR方法扩增各基因节段序列，并用BLASTn分析各基因编码情况。与GenBank上已发表的三个抗原基因进行核苷酸和氨基酸的同源性比对。

结果表明，三种抗原蛋白都存在5-10个氨基的差异。分子生物学分析结果表明新分离的杀鲑气单胞菌RB0506菌株与已报到的杀鲑气单胞菌有着明显区别，主要表现为各基因片段核苷酸之间的点突变和基因重组。

其中RB0506菌株ZOT基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:1,OmpW基因的序列为SEQ IDNO:2，气溶素Aerolysin基因的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。

用RB0506菌株制备疫苗，并进行免疫感染实验，结果表明用RB0506菌株制备的灭活疫苗的免疫组，再RB0506菌株攻毒组的死亡率显著低于使用已报到的杀鲑气单胞菌制备的疫苗(表1)。

表1：三种菌株制备的疫苗的免疫保护试验结果表

注：表示存活数/攻毒总数，

上述结果表明本发明所筛选获得的杀鲑气单胞菌相比于已报到的杀鲑气单胞菌发生了变异，从而在感染保护上与已有细菌株在感染保护上有着显著的差异。

实施例2：不同条件下纳米锌对杀鲑气单胞菌的灭活效果

(1)待灭活细菌的准备：将MH肉汤中过夜培养的杀鲑气单胞菌室温6000rpm离心10min，细菌沉淀用生理盐水(0.9％NaCl溶液)重悬，再离心收集沉淀，重复2次，最后用生理盐水重悬并调整细菌浓度至1.5×109个/mL，分装于50mL离心管内，每管30mL。

(2)纳米锌灭活实验：共设置4个纳米锌灭活浓度，即用生理盐水将纳米锌原液进行稀释并分别加入上述离心管内充分混匀，最终管内纳米锌终浓度分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L，对照管加入等体积生理盐水。然后将每个灭活管内菌液分为3等份，分别放置于4℃、28℃及37℃条件下进行灭活。每隔12h，从各灭活管内取1mL菌液，离心收集沉淀并用生理盐水洗涤2次去除纳米锌，然后取重悬后的菌液涂布MH琼脂培养板，每个处理涂布3个平板，每板涂布100μL。将平板置于28℃培养箱内，培养48h后观察并记录细菌生长情况。剩余菌液用于菌体蛋白及免疫原性的检测。

(3)在3个不同温度条件下分别加入不同浓度的纳米锌，经过不同时间孵育处理杀鲑气单胞菌后，菌体存活情况经测定显示，加入的纳米锌浓度越高，其对杀鲑气单胞菌完全灭活的时间越短，同时随着作用温度的升高，纳米锌对菌体完全灭活的时间缩短(见表2)。400mg/L、200mg/L、100mg/L及50mg/L浓度的纳米锌分别在72h、96h、108h、120h之内可以将杀鲑气单胞菌完全灭活；同样浓度纳米锌在不同温度下对细菌的灭活时间不同，其中在37℃条件下纳米锌灭活时间最短，4种浓度纳米锌均可在60h内将细菌完全灭活，400mg/L纳米锌在24h内即可将细菌完全灭活；其次为28℃条件下，4种浓度纳米锌均可在96h内将细菌完全灭活；灭活作用最慢的为4℃条件下，完全灭活时间最短为72h，最长达到120h。

表2：不同浓度纳米锌在不同温度下孵育处理杀鲑气单胞菌不同时间后菌体的存活情况

(注：+表示细菌存活，-表示细菌死亡。)

实施例3：纳米锌对杀鲑气单胞菌菌体蛋白及免疫原性的影响

(1)SDS-PAGE检测纳米锌对杀鲑气单胞菌菌体蛋白组成的影响

在收集的不同浓度及不同温度条件下，最短灭活时间的纳米锌灭活菌液中，按体积比1:4加入4×上样缓冲液，沸水中煮沸10min，冷却后点样进行SDS-PAGE；电泳凝胶由浓度为12％分离胶和浓度为5％浓缩胶两部分组成；采用Tris-Gly电泳缓冲液(0.025mol/LTris，0.25mol/L Gly，0.1％SDS，pH 8.3)，4℃稳流条件下电泳，浓缩胶30mA，分离胶60mA，至溴酚蓝指示剂迁移至分离胶底部边缘时停止电泳；将凝胶放入固定液中固定1h，然后用考马斯亮蓝(CBB-R250)染色4h，放入7％乙酸脱色液中脱色，如图1所示，不同条件下纳米锌灭活的杀鲑气单胞菌菌体蛋白组成及浓度与未经纳米锌灭活的杀鲑气单胞菌相同，没有出现蛋白条带丢失或蛋白浓度明显降低的现象。

(2)扫描电镜检测纳米锌对杀鲑气单胞菌菌体结构的影响

在6000rpm、4℃条件下离心20min，分别收集50mg/L和400mg/L浓度纳米锌在不同温度下灭活的菌体，用2.5％戊二醛前固定,1％锇酸后固定,磷酸缓冲液冲洗,梯度乙醇脱水,临界点干燥后喷金,经AMRAY-1830型扫描电镜进行观察。如图2所示，在4℃和28℃灭活条件下，两种浓度纳米锌对菌体完整性的破坏程度相差不大，灭活后的菌体大部分保持了原有的完整结构，仅出现少量细菌碎片，但37℃灭活条件下，灭活后的菌体结构破坏较明显，视野中出现较多的菌体碎片。

(3)间接ELISA检测纳米锌对杀鲑气单胞菌免疫原性的影响

离心收集培养至指数生长期的杀鲑气单胞菌，将菌体密度调整至5×10⁷CFU/ml，以全菌免疫小鼠制备鼠抗杀鲑气单胞菌多克隆血清抗体。同时，在4℃条件下离心收集4种浓度纳米锌在不同温度下最短时间灭活的菌体，并用生理盐水调整浓度至OD₆₀₀为0.1±0.01，然后加入酶标板中4℃包被过夜；次日加入3％的牛血清白蛋白(BSA)溶液，37℃下封闭45min；去除封闭液，用PBST洗3次，每次5min；加入鼠抗杀鲑气单胞菌血清(1:200)，37℃孵育1h(间或轻轻震荡)，阴性对照为免疫前小鼠血清；PBST洗3次后，加入AP标记羊抗鼠Ig，37℃下孵育1h；PBST洗3次后，将pNPP发色液加入酶标板发色30min，2mol/L NaOH终止发色，酶标仪405nm测OD值。如图3所示，在4℃和28℃条件下，不同浓度纳米锌灭活菌体的抗原性没有显著性差异，而在37℃条件下,不同浓度纳米锌灭活菌体的抗原性受到不同程度的影响，其中100、200和400mg/L纳米锌灭活组菌体抗原性显著低于50mg/L-4℃灭活组，而400mg/L-37℃灭活组菌体抗原性则显著低于各浓度纳米锌在4℃条件下灭活菌体的抗原性(见图3)。

实施例4：杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗的免疫保护力

根据以上结果，从灭活效率及疫苗抗原性保持的效果出发，选择100mg/L-28℃为杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗制备条件，制备出纳米锌灭活疫苗；同时利用0.1％的甲醛溶液在28℃条件下对杀鲑气单胞菌灭活5h，制备出甲醛灭活疫苗；然后将两种灭活疫苗浓度调整至OD₆₀₀为0.1±0.01，利用腹腔注射的方法分别免疫健康虹鳟，每尾100μL，对照组注射同体积的无菌生理盐水，每组免疫30尾，每组设3个重复，养殖水温为17±1℃，全天充气，每天换水50％；免疫后40d用杀鲑气单胞菌进行攻毒，每尾腹腔注射浓度为5.0×10⁷CFU/mL的菌液100μL；每天定时观察并记录各实验组鱼体死亡数量，计算两种灭活疫苗对杀鲑气单胞菌感染的相对免疫保护率。

如图4所示，攻毒后注射生理盐水组的鱼体在攻毒后第2天便开始出现死亡，并且鱼体在接下来的一周内出现大量死亡，直至攻毒后第10天死亡率达到96.7％。两个免疫组鱼体的死亡率显著低于对照组，在攻毒后第10天纳米锌与甲醛灭活菌体免疫组鱼体的死亡率分别为13.3％与20％，计算其免疫保护率分别为86.2％与79.3％，两个免疫组均表现出较好的免疫保护效果。攻毒受感的鱼体表现出腹鳍基部充血发红、肛门突出、肌肉出血、肠道出血等杀鲑气单胞菌感染的典型临床症状，并能从受感死亡鱼体中再次分离到该菌株。

实施例5：杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗的安全性

(1)纳米锌对鲤上皮瘤(EPC)细胞毒性的研究

将纳米锌溶液用M199培养基(含2％胎牛血清)两倍梯度稀释至浓度为100mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1600mg/L、3200mg/L，然后分别与密度为2.5×10⁶个/mL的EPC细胞悬液1:1混合均匀，接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL，每个处理设3个重复，置于20℃培养，12h后观察细胞贴壁情况，3d后观察细胞存活情况,6d后在每个孔内加入10μL阿尔玛蓝指示剂，置于20℃培养4h，用酶标仪在570nm测定波长下和605nm参考波长下测定OD值，计算细胞活性值。结果如表3所示，高浓度1600mg/L纳米锌溶液会影响细胞的正常贴壁，低于400mg/L浓度的纳米锌溶液不会影响细胞正常贴壁(图5)；利用阿尔玛蓝指示剂测定6天后EPC细胞活性，发现与对照组相比，浓度低于400mg/L纳米锌溶液对细胞生长及代谢无显著影响。

表3：不同浓度纳米锌对EPC细胞贴壁及生长的影响

(2)杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗对鱼体的安全性试验。

将制备的杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗双倍剂量腹腔注射健康虹鳟，观察30d，鱼体未出现死亡及发病现象；同时单剂量连续腹腔注射健康虹鳟两次，中间间隔15d，观察30d后鱼体未出现死亡及发病现象，且通过解剖发现免疫鱼体组织黏连现象不明显。以上结果证明本发明研制的杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗安全性好，无毒副作用。

综上所述，本发明研制的杀鲑气单胞菌纳米锌灭活疫苗，显示出较甲醛灭活全菌疫苗更好的免疫保护效果。且纳米锌灭活疫苗无毒副作用，应用于鱼体安全性好，在鱼用疫苗领域具有良好的开发应用前景。

序列表

<110> 山东省海洋生物研究院

<120> 一种利用纳米锌制备的杀鲑气单胞菌灭活疫苗

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 364

<212> PRT

<213> 杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp.masoucida)

<400> 1

Met Ala Ile Val Ile Glu His Gly His Asn Gly Ser Tyr Lys Arg Ser

1 5 10 15

Ser Val Ile Trp Tyr Arg Leu Pro Pro Ala Leu Arg Ala Gly Arg Leu

20 25 30

Val Val Thr Asn Ala Ala Gly Ala Tyr Pro Leu His Arg Ile Glu Glu

35 40 45

Gly Leu Gly Glu Lys Phe Pro Leu Thr Ala Arg Leu Phe Arg Val Ser

50 55 60

Ser Gln Asp Pro Lys Tyr Trp Gln Leu Trp Arg Val Trp His His Trp

65 70 75 80

Met Pro Ile Gly Ala Phe Val Phe Ile Asp Glu Cys Cys Asp Ile Tyr

85 90 95

Asp Arg Asp Val Phe Lys Gly Gly Pro Glu Phe Asn Leu Glu Pro Ile

100 105 110

Glu His Tyr Ser Asn Val Leu Pro Pro Asp Arg Ile Gln Leu Phe Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Glu Ser Phe Lys Pro Glu Thr Ile Glu Ser Cys Asp Thr

130 135 140

Asp Asp Thr Gly Arg Val Val Phe Asp Asp Arg Gly Leu Ile Met Tyr

145 150 155 160

Pro Thr Ser Pro Lys Glu Ser Phe Met Arg His Arg His Tyr Asn Trp

165 170 175

Asp Val Val Glu Ala Thr Pro Asp Ile Thr Ser Ile Pro Arg Pro Val

180 185 190

Arg Ala Cys Cys Glu Val Ala Phe Ala Tyr Arg Ser Lys Asp Ser Phe

195 200 205

Phe Phe Ser Lys Arg Lys Pro Arg Ile Tyr Glu His Asn Pro Asp Asp

210 215 220

Asn Gly Ile Pro Thr Lys Gln Ser Val Thr Phe Lys Arg His Val Pro

225 230 235 240

Leu Ala Val His Arg Leu Tyr Lys Ser Thr Gln Gln Ser Ala Ile Thr

245 250 255

Lys Ser Gly Gln Ser Gly Gly Pro Leu Ser Ser Phe Lys Ile Arg Phe

260 265 270

Val Leu Phe Gly Val Leu Pro Ser Leu Val Leu Phe Trp Met Trp His

275 280 285

Tyr Ser Thr Arg Leu Gly Ala Asp Pro Ala Ala Ser Glu Thr Gly Asp

290 295 300

Pro Val Ala Val Glu Ser Arg Ser Ala Thr Ser Ser Gly Ala Asp Ala

305 310 315 320

Ile Ser Val Pro Val Pro Asp Val Ser Asn Arg Gly Ala Gln Ser Ala

325 330 335

Phe Val Met Pro Ala Gln Val Thr Glu Leu Phe Thr Asn Gly Ala Ser

340 345 350

Gly Ala Ile Tyr Ala Gly Arg Phe Asp Gly Gln Gly

355 360

<210> 2

<211> 204

<212> PRT

<400> 2

Met Lys Lys Ile Leu Pro Leu Met Glu Val Ala Ala Leu Ala Ser Pro

1 5 10 15

Val Ala Met Ala His Gln Ala Gly Asp Ile Leu Ile Arg Gly Gly Leu

20 25 30

Ala Phe Val Ser Pro Gln Thr Ser Ser Asp Asp Val Gly Gly Ser Gly

35 40 45

Ser Glu Phe Glu Ile Asp Ser Asn Met Gln Arg Gly Pro Thr Leu Ser

50 55 60

Tyr Leu Ile Thr Asp Asn Trp Gly Val Glu Leu Leu Ala Glu Thr Pro

65 70 75 80

Phe Ser His Ser Val Ser Leu Ala Gly Thr Glu Val Ala Lys Asp Thr

85 90 95

Glu Leu Pro Pro Thr Leu Met Ala Gln Tyr Tyr Phe Gly Asp Ala Lys

100 105 110

Ser Lys Val Arg Pro Tyr Val Gly Val Gly Val Asp Tyr Thr Asn Phe

115 120 125

Phe Asp Glu Lys Gly Arg Gly Pro Leu Ala Asn Glu Asp Ile Thr Leu

130 135 140

Asp Asp Ser Trp Gly Val Ala Gly Pro Val Gly Leu Asp Met Ala Ile

145 150 155 160

Asn Asp Arg Trp Phe Val Asn Ala Ser Asp Trp Ile Met Asp Ile Asp

165 170 175

Thr Glu Val His Val Asn Gly Gly Asp Gly Ile Lys Thr Ser Val Asp

180 185 190

Pro Met Ala Phe Met Phe Gly Val Gly Tyr Arg Phe

195 200

<210> 3

<211> 216

<212> PRT

<400> 3

Met Lys Lys Leu Lys Ile Thr Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Gly Asp

1 5 10 15

Leu Met Ala Gln Ala Gln Ala Ala Glu Pro Val Tyr Pro Asp Gln Leu

20 25 30

Arg Leu Phe Ser Leu Gly Gly Asp Val Cys Gly Asp Lys Tyr Arg Pro

35 40 45

Glu Arg Glu Glu Ala Gln Ser Val Lys Ser Asn Ile Val Gly Met Met

50 55 60

Gly Gln Trp Ala His Tyr Gly Leu Ala Asn Gly Trp Val Ile Met Gly

65 70 75 80

Pro Gly Tyr Asn Gly Glu Ile Lys Pro Gly Ser Ala Ser Ser Thr Trp

85 90 95

Cys Tyr Asp Ile Asn Pro Ala Thr Gly Glu Ile Pro Thr Leu Ser Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Pro Asp Gly Asp Glu Pro Asp Val Gln Trp Arg Leu Val

115 120 125

His Asp Ser Ala Asn Phe Ile Lys Asp Lys Thr Tyr Leu Ala His Tyr

130 135 140

Leu Gly Tyr Ala Trp Val Gly Gly Asn His Ser Gln Tyr Val Gly Met

145 150 155 160

Asp Met Asp Val Thr Arg Asp Gly Asp Gly Trp Val Ile Glu Gly Asn

165 170 175

Asn Asp Gly Gly Cys Asp Gly Tyr Arg Cys Gly Asp Lys Thr Ser Ile

180 185 190

Lys Ile Ser Asn Phe Ala Tyr Asn Leu Asp Pro Asp Ser Glu Lys His

195 200 205

Gly Asp Val Thr Gln Ser Asp Arg

210 215

Claims

1.一种杀鲑气单胞菌灭活疫苗，其特征在于，所述的灭活疫苗其中抗原菌株是利用纳米锌灭活的杀鲑气单胞菌。

2.如权利要求1所述的灭活疫苗，其特征在于，所述的杀鲑气单胞菌的保藏编号为CCTCC NO:M2018849。

3.权利要求1所述的灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的方法是将将培养的杀鲑气单胞菌离心后，细菌沉淀用生理盐水重悬制成菌液；用生理盐水将纳米锌原液稀释后加入菌液中，至纳米锌终浓度为100mg/L，置于28℃孵育84h；然后离心收集沉淀，并用生理盐水洗涤去除纳米锌；最后用生理盐水调整菌液浓度至OD₆₀₀为0.1±0.01完成制备。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的杀鲑气单胞菌是使用Mueller-Hinton肉汤培养的。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的生理盐水为0.9％NaCl溶液。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的菌液中细菌浓度为1.5×10⁹个/mL。