CN109777786B

CN109777786B - 狐源犬ⅰ型腺病毒强毒株及其应用

Info

Publication number: CN109777786B
Application number: CN201711129263.2A
Authority: CN
Inventors: 闫喜军; 朱言柱; 薛向红; 孙杰; 赵辉; 王洋; 史宁; 鲁荣光; 胡博; 吕爽
Original assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Current assignee: Institute Special Animal and Plant Sciences CAAS
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2023-03-03
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: CN109777786A

Abstract

本发明公开了一株狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株及其应用。本发明首先公开了一株分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.14340。本发明从发生狐狸传染性脑炎的银黑狐体内分离得到1株犬腺病毒，经电子显微镜观察、免疫荧光检测和PCR鉴定，确定为狐源犬Ⅰ型腺病毒。本发明所分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株，对银黑狐毒力稳定，接种后银黑狐均出现典型的狐狸传染性脑炎临床症状，能够作为狐狸传染性脑炎疫苗效力评价和检验用强毒株使用。

Description

狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株及其应用

技术领域

本发明涉及一株分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株，本发明还涉及所述狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株在狐狸传染性脑炎疫苗评价中的应用，属于狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株的分离及应用领域。

背景技术

狐狸传染性脑炎(Fox Infectious Encephalitis)，是由腺病毒科(Adenoviridae)、腺病毒属(Mastadenovirus)的犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1) 引起狐狸的一种急性、接触性传染病，以感觉过敏、肌肉痉挛、共济失调、呕吐、腹泻、便血，最终导致死亡为主要特征。该病由Green于1928年在美国银黑狐养殖场发现，1949年Siedentopf和Carlson证实狐狸脑炎病原与犬传染性肝炎病原相同。美国、德国、法国、挪威和加拿大等国家相继报道狐狸传染性脑炎病例，1989年中国山东等地也发生了狐狸脑炎，之后在中国多个省份陆续发生。狐狸传染性脑炎现已广泛流行于世界各养狐国家。

目前，中国狐狸存栏数达1500万只，主要集中在吉林、辽宁、黑龙江、山东、河北等省份地区。狐狸传染性脑炎是危害狐狸养殖业的重要传染病之一，由于缺乏特效的治疗方法，目前仍以疫苗接种为主要防控手段。目前，中国国内市场上商品化的狐狸脑炎活疫苗，包括中国农业科学院特产所研制的狐狸脑炎活疫苗。疫苗研制过程中，疫苗免疫效果评价需要标准的强毒株攻击免疫动物，以评价疫苗的免疫效果。因此，培育标准的效力检验强毒株对疫苗研制和效果评价至关重要。

特产所研制的狐狸脑炎活疫苗效果评价使用的狐狸脑炎强毒株为犬Ⅰ型腺病毒脏器毒CAV I-C05株，该毒株来源于犬，由于脏器强毒株制备和检测程序繁琐，而且毒力不稳定，因此培育狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株细胞适应毒，对狐狸脑炎活疫苗效力评价和毒株标准化，具有重要的实际意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株在评价狐狸传染性脑炎疫苗的免疫效果中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明从吉林省某银黑狐养殖场发生狐狸传染性脑炎的银黑狐体内分离得到2株犬腺病毒，经电子显微镜观察、免疫荧光检测鉴定和PCR 鉴定，确定为狐源犬Ⅰ型腺病毒。分离株的致病性检测结果表明，其中1 株病毒可导致接种银黑狐100％发病，狐狸出现体温升高，食欲不振，进而出现呕吐、腹泻，以及神经过敏、角弓反张等神经症状，狐狸100％发病死亡。本发明将该毒株命名为狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株。

本发明将所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株经银黑狐连续传5 代，1-5代强毒接种银黑狐均100％发病。本发明将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的第4-6代MDCK细胞(犬肾细胞)培养物肌肉注射银黑狐，银黑狐均100％发病。本发明用Reed-Muench法，测定狐源犬Ⅰ型腺病毒 CAV I-F1301株对2-8月龄银黑狐的ID₅₀(median infective dose，半数感染量)≤1×10^3.5TCID₅₀/ml；进一步优选的，所述狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐的ID₅₀＝1×10^3.30TCID₅₀/ml(其中，TCID₅₀为Tissue culture infective dose，半数组织培养感染剂量)。每只银黑狐接种100个 ID₅₀的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株，可导致银黑狐100％发病出现典型狐狸脑炎临床症状。本发明所分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株毒力稳定，是一株致病性良好的强毒毒株，能够作为疫苗评价强毒株使用。

本发明所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对犬的致病性低。

本发明将所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.14340；分类命名是：犬Ⅰ型腺病毒(Canineadenovirus)；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是：2017年9月13日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明进一步公开了所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株在评价狐狸传染性脑炎疫苗的免疫效果中的应用，尤其是对银黑狐的免疫效果中的应用。

本发明所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株能够作为狐狸传染性脑炎疫苗评价和检验用强毒株。其中，所述狐狸传染性脑炎疫苗优选为狐狸脑炎活疫苗；进一步优选的，所述狐狸脑炎活疫苗的有效成分为犬腺病毒弱毒疫苗株CAV-2C株，活疫苗成品中犬腺病毒弱毒病毒含量 (TCID₅₀)≥10^5.5/头份。

本发明所述的狐狸传染性脑炎疫苗评价，通过以下步骤进行：将狐狸传染性脑炎疫苗免疫银黑狐，免疫后不同时间用所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒 CAV I-F1301株攻毒免疫组银黑狐，观察免疫组银黑狐的临床变化及死亡情况，计算保护率。

其中，所述狐狸传染性脑炎疫苗为狐狸脑炎活疫苗；优选的，所述狐狸脑炎活疫苗的有效成分为犬腺病毒弱毒疫苗株CAV-2C株，活疫苗成品中犬腺病毒弱毒病毒含量(TCID₅₀)≥10^5.5/头份。所述免疫后不同时间为免疫后21天、3个月、6个月、9个月和12个月。所述攻毒的剂量为100 个ID₅₀/只；所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐的ID₅₀(半数感染量)≤1×10^3.5TCID₅₀/ml；优选的，ID₅₀＝1×10^3.30TCID₅₀/ml。所述狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的培养方法包括：将所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株接种MDCK细胞进行培养，收获病毒液，即得；优选的，将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株按培养体积的0.5-1％接种 MDCK细胞；所述培养为35℃培养96小时，待细胞病变达到80％时，收获病毒液。

本发明采用狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对狐狸脑炎活疫苗(有效成分为犬腺病毒弱毒疫苗株CAV-2C株)的免疫效果进行评价，将狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)免疫银黑狐，免疫21天、3个月、6个月、9 个月后分别采用狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株攻毒，免疫银黑狐的保护率为100％，对照组100％发病；一次免疫接种12个月后，狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)对狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的攻击保护率为 86.7％。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明分离得到一株狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株，该强毒株对银黑狐毒力稳定，接种后可出现典型的狐狸传染性脑炎临床症状。本发明所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株能够作为疫苗研制和疫苗效力评价检验用强毒株使用，在狐狸传染性脑炎疫苗研制和疫苗评价领域，将具有良好的应用前景。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

可互换使用的术语“疫苗”或“疫苗组合物”指这样的药物组合物，其包括在动物中诱导免疫应答的至少一种免疫原性组合物。疫苗或疫苗组合物可以保护动物免受由于感染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增强活性组分的免疫活性的一种或多种另外组分。疫苗或疫苗组合物可以另外包括对于疫苗或疫苗组合物典型的进一步组分，包括例如佐剂或免疫调节剂。疫苗的免疫活性组分可以包括以其原始形式的完全活生物体或在经修饰的活疫苗中作为经减毒的生物体，或在经杀死或灭活的疫苗中通过合适方法灭活的生物体，或包括病毒的一种或多种免疫原性组分的亚单位疫苗，或通过本领域技术人员已知的方法制备的遗传改造、突变或克隆的疫苗。疫苗或疫苗组合物可以包括一种或同时超过一种上述组分。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株的分离和致病性研究

1、狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株分离鉴定

采用MDCK细胞(犬肾细胞)从吉林省某银黑狐养殖场发生狐狸传染性脑炎的发病狐狸的肝脏中分离得到2株犬腺病毒，经电子显微镜观察、免疫荧光检测鉴定和PCR鉴定，确定为狐源犬Ⅰ型腺病毒。

2、狐源犬Ⅰ型腺病毒分离株的致病性

将2株狐源犬Ⅰ型腺病毒经MDCK细胞培养后进行病毒含量测定，病毒含量调整为10^6.5TCID₅₀/ml，分别肌肉接种银黑狐，1ml/只，观察10 天，其中1株病毒可导致接种银黑狐100％发病，狐狸出现体温升高，食欲不振，进而出现呕吐、腹泻，及神经过敏、角弓反张等神经症状，狐狸 100％发病死亡。本发明命名该毒株为狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株。

3、狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株培育

(1)将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的细胞培养物肌肉接种2-4 月龄银黑狐3只，1ml/只(病毒含量为1×10^6.00TCID₅₀/ml)，待银黑狐出现典型狐狸脑炎临床症状时剖杀，采取肝脏进行病毒分离，并传2代，培养物-20℃保存备用。

(2)按照(1)的方法将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株连续传5 代。1-5代强毒接种银黑狐均100％发病。

(3)将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株第5代细胞分离培养物通过MDCK细胞连续传6代，取4-6代培养物分别肌肉注射银黑狐4只，1 mL/只(病毒含量为1×10^6.00TCID₅₀/ml)，连续观察10d，第4-6天各组银黑狐均100％发病。

4、狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐的半数感染量(ID₅₀)

将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的第6代细胞培养物进行10倍系列稀释，将10^-2-10^-5四个稀释度分别肌肉注射银黑狐4只，1mL/只，每天观察各组银黑狐临床变化及死亡情况，连续观察14d，计算半数感染量(ID₅₀)。结果表明，狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐的半数感染量为1×10^3.30TCID₅₀/ml。

5、狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐毒力

将狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株的第6代细胞培养物肌肉注射银黑狐5只，每只100个ID₅₀，接种4-6天银黑狐100％发病，出现典型临床症状。说明，狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株毒力稳定，可用于疫苗评价强毒株使用。

本发明将所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO. 14340。

实施例2狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株用于狐狸脑炎疫苗免疫效果评价试验

(1)取检验合格的狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)(购自吉林特研生物技术有限责任公司，商品名称为“狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)”) 3批，后肢肌肉接种(10^6.0TCID₅₀/头份)银黑狐50只，同时设接种细胞培养液对照组，免疫后每月采血、分离血清，用于血清中和试验。

(2)试验动物接种疫苗后3周、3个月、6个月、9个月和12个月后，使用狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株(保藏编号为：CGMCC NO. 14340)对银黑狐进行攻毒，连同对照组每只接种100个ID₅₀，每组5只，每天观察各组银黑狐临床变化及死亡情况。

(3)结果表明，接种3批狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)3周、3个月、6个月、9个月后，免疫组对狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株强毒的攻毒保护率为100％，接种银黑狐均正常，无任何临床症状出现；对照组100％发病。银黑狐接种疫苗12个月后对狐源犬Ⅰ型腺病毒CAVI-F1301株强毒的攻毒保护率为86.7％(13/15)，对照组100％发病出现典型症状。

(4)结果还显示，接种狐狸脑炎活疫苗(CAV-2C株)的银黑狐血清中和抗体≥1：50，可抵抗狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株强毒攻击，获得保护。

以上结果表明，本发明所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒CAV I-F1301株对银黑狐有稳定的毒力，是一株致病性良好的强毒毒株，可用于评价预防狐狸传染性脑炎疫苗的免疫效果。

Claims

1.一株分离的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.14340。

2.权利要求1所述的狐源犬Ⅰ型腺病毒强毒株在制备评价狐狸传染性脑炎疫苗对银黑狐的免疫效果试剂中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的狐狸传染性脑炎疫苗为狐狸脑炎活疫苗。

4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：所述狐狸脑炎活疫苗的有效成分为犬腺病毒弱毒疫苗株CAV-2C株。