CN113005069B

CN113005069B - 一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN113005069B
Application number: CN202110121677.0A
Authority: CN
Inventors: 夏立群; 侯素莹; 鲁义善; 王文基; 陈建林; 刘彦升
Original assignee: Shenzhen Yihai Biotechnology Co ltd; Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Current assignee: Shenzhen Yihai Biotechnology Co ltd; Guangdong Ocean University; Shenzhen Research Institute of Guangdong Ocean University
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: CN113005069A

Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用，该减毒鰤鱼诺卡氏菌为缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株；其中，血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。本发明提供的减毒鰤鱼诺卡氏菌，可用作疫苗或免疫佐剂；其通过基因敲除的方法缺失血红素蛋白相关蛋白基因后，能有效降低细菌的致病性，但仍保留了较好的免疫原性。另外，由于本发明是在鰤鱼诺卡氏菌基因组上直接进行敲除，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不会因为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。

Description

一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用。

背景技术

近年来鱼类诺卡氏菌病已经成为水产养殖业中的严重病害，当水产动物体质虚弱、免疫力低下时，病原菌可通过鳃、饲料或者伤口等进行感染。病鱼表现为腹部膨大，内脏器官常弥漫性分布有致密肉芽肿，该病的感染率和死亡率都比较高，目前尚缺乏有效的防治措施，给水产养殖行业带来巨大损失。近年来鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)已成为鱼类诺卡氏菌病的主要病原，超过39种海淡水养殖鱼种深受其害。

相关研究表明，导致鱼类诺卡氏菌病的主要病原菌是鰤鱼诺卡氏菌。鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于细菌域(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinobacterales)、诺卡氏菌科(Nocardiace ae)、诺卡氏菌属(Nocardia)。鰤鱼诺卡氏菌生长缓慢，该菌在平板上生长呈现黄色砂粒或颗粒状凸起，表面形成褶皱。液体培养条件下，细菌容易聚集形成大颗粒。目前关于鰤鱼诺卡氏菌防治手段，仍然是以预防为主。然而细菌的减毒株作为一种活性细菌，在保持原有免疫原性的基础上，又不会对宿主造成危害，因此减毒株备受关注。虽然在鰤鱼诺卡氏菌中，已有相关研究在探索减毒株的构建，但是相关的减毒株的保护效果依然不够理想。

血红素载体Hemophore是革兰氏阴性菌分泌到胞外或锚定于外膜,能够与血红素或Hemoprotein中的血红素结合,或使血红素从Hemoprotein中游离出来,高效率地将血红素呈递给细胞外膜受体的蛋白。外膜血红素受体经血红素载体介导而结合血红素的效率远远超过直接与血红素或Hemoprotein结合的效率。因此血红素载体Hemophore介导的血红素转运系统是细菌更重要、更主要的血红素转运系统。然而，在革兰氏阳性菌中未见有报道。在鰤鱼诺卡氏菌的全基因组中，发现一个基因，编码血红素载体蛋白相关蛋白的基因ORF4036，命名为HRP。前期研究表明，该基因编码的蛋白定位宿主细胞的线粒体，能诱导细胞发生凋亡，是鰤鱼诺卡氏菌中潜在的毒力因子。

基于上述问题，通过基因工程手段，构建一株对宿主具有较好保护性的减毒株，并探索该减毒株作为疫苗的应用是至关重要的。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，其为缺失血红素蛋白相关蛋白基因ORF4036(命名为鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036)的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，和/或所述血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

作为本发明实施例的一种优选方案，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌命名为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia sp.)ZJ0503-4036，其于2020年10月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61259，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明实施例的另一目的在于提供上述的减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其包括以下步骤：

S1、将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体；

S2、取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；

S3、利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；

S4、对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体的步骤，具体包括：

将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段作为上游同源臂，将所述血红素蛋白相关蛋白基因的下游片段作为下游同源臂，以Sac I和Kpn I为酶切位点，经过酶切、酶连至载体中，构建用于同源重组的重组载体。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示；所述血红素蛋白相关蛋白基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述载体为pRE112质粒；所述鰤鱼诺卡氏菌野生株为鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503。

具体的，步骤S2包括如下步骤：

将保存的鰤鱼诺卡氏菌野生株无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain HeartInfusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，26-30℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至40-60mL BHI液体培养基中，26-30℃，100-150rpm培养至对数生长期。取达到对数生长期的20-50mL鰤鱼诺卡氏菌菌液于50mL离心管中，2-4℃，6000-10000rpm收集细菌菌体；用8-15mL 10％甘油分别洗涤菌体两次，再用0.1mL无菌10％甘油重悬细菌菌体，放入-80℃冰箱保存，得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述步骤中，电转化的电压为180～220V，脉冲间隔时间为800～1200ms。

具体的，步骤S3包括：

所述电转化使用的电转仪无需专用的电转杯，使用方便，并且具有高密度矩阵针电极，使其在较低电压下即能产生高度均匀、足够强度的电场，实现高转染率。设置电转仪参数：电压180-220V，脉冲间隔时间800-1200ms，脉冲持续时间80-120μs，方波25-35个，进行电转化。电转化结束后，在96孔板中每孔加入80-120μL，26-30℃预热的BHI溶液，轻轻混合。将加了培养液的96孔板放在生化培养箱中，26-30℃复苏2小时，得到电转化菌液。

作为本发明实施例的另一种优选方案，所述对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的步骤，具体包括：

将电转化菌液涂布于含有氯霉素抗性的脑心浸液琼脂平板上进行培养，得到菌落；

将菌落接种至脑心浸液肉汤液体培养基中进行培养，并筛选出缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌。

具体的，取电转后复苏的电转化菌液100μL涂布于含有氯霉素(25mg/mL)抗性的BHI平板上，另以没电转过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照，等量涂布于含有氯霉素抗性的BHI平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的BHI液体培养基中培养5d，用引物对112-F1/R1检测细菌内是否含有敲除质粒。将阳性菌液接种到含有10％蔗糖的BHI液体培养基中继续培养，用引物对112-F1/R1检测细菌内是否消除敲除质粒，用缺失株验证引物进行多重PCR检测，筛选缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，即可得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌。

本发明实施例的另一目的在于提供上述制备方法制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌。

本发明实施例的另一目的在于提供上述减毒鰤鱼诺卡氏菌在制备疫苗或免疫佐剂中的应用。

本发明实施例提供的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，可用于递送表达外源抗原，用作活疫苗或免疫佐剂；其通过基因敲除的方法缺失血红素蛋白相关蛋白基因后，能有效降低细菌的致病性，但仍保留了较好的免疫原性。另外，由于本发明是在鰤鱼诺卡氏菌基因组上直接进行敲除，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不会因为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。

附图说明

图1为实施例1制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌的第一次筛选电泳结果图。图1中，M：DNAmarker 2000；1，2：ZJ0503-4036；3：ZJ0503；4：pRE112。

图2为实施例1制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌的第二次筛选电泳结果图。图2中，M：DNAmarker 2000；1，2：ZJ0503-4036；3：ZJ0503。

图3为实施例2中稳定遗传验证的电泳结果图。图3中，M：DNA marker 2000；1：ZJ0503-4036；2,3：ZJ0503；4：阴性对照。

图4的A为敲除质粒pRE112-ΔHRP构建方法原理图，B为缺失株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036的构建原理图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，其为缺失血红素蛋白相关蛋白基因ORF4036(命名为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia sp.)ZJ0503-4036)的鰤鱼诺卡氏菌菌株；其中，血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，血红素蛋白相关蛋白基因推导的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

具体的，如图4所示，该减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，包括以下步骤：

S1、构建同源重组载体：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至50mL BHI液体培养基中，28℃，120rpm培养至对数生长期；取一定体积的菌液提取细菌基因组，以此作为模板，利用表1的引物分别克隆血红素蛋白相关蛋白基因上游片段和下游片段；具体的，利用NS-HRP-UF和NS-HRP-DR引物，以NS-HRP基因上游片段(如序列表SEQ ID NO:3所示)和NS-HRP基因下游片段(如序列表SEQ ID NO:4所示)为模板，通过PCR扩增可获得重叠PCR产物。PC R扩增程序为：94℃，5min，15个循环：94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。72℃，5min。反应体系为：NS-HRP基因上游片段产物2μL，NS-HRP基因下游片段产物2μL，NS-HRP-UF和NS-HRP-DR各1μL，rTaq酶25μL，无菌水19μL。纯化重叠PCR产物，然后按照下述方法连接到pRE112载体中：

从实验室-80℃冰箱中取出含有pRE112质粒的E.coli S17-1菌种，37℃水浴融化，划线于含有氯霉素抗性的LB平板中。挑取单菌落过夜扩大培养，随后使用质粒提取试剂盒提取质粒。按照表2的体系对pRE112质粒和重叠PCR产物分别进行双酶切实验(以Sac I和Kpn I为酶切位点)，37℃反应30min。随后按照表3，将重叠PCR产物与质粒pRE112连接，得到重组载体。

表1引物序列

表1中，下划线为酶切位点，波浪线为重叠PCR位点。

表2双酶切反应体系

表3重叠PCR产物与质粒pRE112连接体系

S2、鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞的制备：将保存的鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株无菌操作划线接种到脑心浸液(Brain Heart Infusion，BHI)固体培养基(购自广东环凯微生物科技有限公司)，28℃倒置培养。待平板上长出单菌落，无菌操作挑取单菌落至50mL BHI液体培养基中，28℃，120rpm培养至对数生长期(OD＝0.7)。取对数生长期的35mL鰤鱼诺卡氏菌菌液于50mL离心管中，3℃，8000rpm收集细菌菌体；用10mL 10％无菌甘油分别洗涤菌体两次，再用10mL无菌甘油重悬菌体，得到鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞。

S3、电转化：吸取一定体积上述得到的重组载体(记为敲除质粒pRE112-ΔH RP)加入到上述鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞中，使得重组载体总量为1μg，冰浴混匀30min。随后将混合液加入到96孔酶标板中，每孔100μL。设置电转仪参数：电压200V、频率30、间隔时间1000ms、持续时间60ms。电转后，加入100μL 28℃预热的BHI液体培养基。置于28℃培养箱中静置复苏2h，得到电转化菌液。

S4、阳性克隆筛选：取上述电转化菌液100μL涂布于含有氯霉素(25mg/mL)抗性的BHI平板上，另以没电转化过的鰤鱼诺卡氏菌菌液作为阴性对照，等量涂布于含有氯霉素抗性的BHI平板上，放在生化培养箱中，28℃倒置培养至平板长出菌落。挑取单菌落到不含有10％蔗糖的BHI液体培养基中培养5d，用表4引物对112-F1/R1检测细菌内是否含有重组敲除质粒。将阳性菌液接种到含有10％蔗糖的BHI液体培养基中继续培养，用表4的引物对112-F1/R1检测细菌内是否消除重组敲除质粒pRE112-ΔHRP，其PCR扩增程序为：94℃，5min，30个循环：94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min。72℃，5min。另外，用表5的缺失株验证引物NS-HRP-F/R进行PCR检测，筛选NS-HRP缺失株，缺失株用NS-HRP-F1/R1无法扩增目的条带303bp，而野生株则可以扩增目的条带；缺失株用NS-HRP-F2/R2，可扩增出1047bp的片段，而野生株则可扩增出1380bp片段；PCR扩增程序为：94℃，5min，30个循环：94℃，30s，60℃，1min，72℃，1min。72℃，5min，其电泳结果如图1和图2所示。将构建成功的缺失株命名为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia sp.)ZJ0503-4036，其于2020年10月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61259，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

表4pRE112验证引物

表5筛选缺失株引物

实施例2

为测定上述实施例1制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036的遗传稳定性，分别从平板挑取减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036和野生株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503至含有BHI液体培养基的EP管中，培养3-4天。然后继续划线于无抗性的BHI平板上，28℃倒置培养至平板上长出菌落、观察菌落形态和生长特性。连续划线接种培养减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036至30代，用缺失株引物验证相应菌株的遗传稳定性，结果如图3所示，减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036连续传至30代，无法检测出血红素蛋白相关蛋白(NS-HRP)基因片段，表明减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036能稳定遗传。

实施例3

为了测定上述实施例1制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036和野生株鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503的半致死浓度(LD50)。参考文献方法(王文基,陈建林,侯素莹,等.鰤鱼诺卡氏菌感染乌斑杂交鳢的组织病理学研究[J].基因组学与应用生物学,2019,38(10):4439–4446.)，用无菌PBS溶液调整菌悬液浓度为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸CFU/mL，实验组每尾杂交乌鳢腹腔注射100μL菌液，对照组注射等量的无菌PBS溶液，每个浓度设立三个平行组，每组30尾。连续观察14天，每天正常投喂商业饲料并记录死鱼情况。参考文献方法(熊浩明,魏柏青,魏荣杰,等.用SPSS软件计算鼠疫菌半数致死量(LD_(50))[J].中国人兽共患病学报,2013,29(11):1127–1130.)，采用SPSS17.0进行统计学分析并计算LD50。结果如表6和表7所示，野生株的半致死浓度为4.74×10⁵CFU/m L；减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036的半致死浓度为2.46×10⁶CFU/mL，其半致死浓度相较野生株降低了1个数量级，表明了该菌株毒力发生显著下降。

表6鰤鱼诺卡氏菌各菌株死亡数统计

表7减毒鰤鱼诺卡氏菌半致死浓度计算置信度

另外，将上述实施例1制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036以10⁶CFU/mL免疫杂交鳢35天后，进行鰤鱼诺卡氏菌野生株活菌攻毒实验，并计算免疫保护率，同时设置对照组，对照组用PBS代替减毒鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503-4036。根据公式计算免疫保护率：

相对免疫保护率(RPS)＝{1–[免疫组死亡率(％)/对照组死亡率(％)]}×100％；

表8鰤鱼诺卡氏菌注射杂交鳢存活率鱼免疫保护率计算结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东海洋大学

广东海洋大学深圳研究院

深圳义海生物科技有限公司

<120> 一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1380

<212> DNA

<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)

<400> 1

cgaccgcatg cgaatgctgc acccgcacac agatttccag ctcaacggcg acccggtcac 60

ggtgtccgcc gatccggagc gcatcaccca gatcctcacc aacctgctca ccaacgcctg 120

ccaggccatg aaggaccacg gcggcatcac cgtcgacata cgcgcgatcc ccgccgaatc 180

cggtggcggc gggatcgaac tcacggtcac cgacaccggc cccggcatcc cggccgagga 240

ccgcgaccgc atcttcgacc gactggtccg tctcgaccac gcccgcgaca cccgccccga 300

cggctccggt ctgggtctgg ccatcgcccg cggcctggcc cgcgcccacg gcggcgatct 360

gacctgcgcc ggccccaccc ccgatacgac gggcgcggtc ttcgtcctcc gtctccccct 420

gagcccgcca accctgaaga acgcctgaag aaccccgccc gattcagcgc aacttcagca 480

accgcgggca aattcgatgg ggaaccaacc cccaacgatg gagtgagcat gaaccgcacc 540

ctcgccgcga tcctggtcgg cgccgccgga gccgccgcga tcgcgctcgc cgtgcccggc 600

accgcgtccg cggacacccc gcagtgcggc cccgccgccg cagccgccgc ccgtgccgac 660

gccgccccga aggtcgccgc ctacctggcc gcccaccccg acgtagcagc cgaactcacc 720

aaggtgaagg gcctccccaa ggaccagcgc cgcgccgaac tgaaagcctg gcgccaagcc 780

aacccccagg aagcccaaga cctcaaggcc gcccgccaag cggtaatcga ctaccacaag 840

tcctgccccc gccagaagta aaagcccccg cgatccgccc ccgcgagcgc ccaccgccga 900

gccacacccc tcgcctgccc ggcggccgag cgactgccct cgccacgcgc ggcacgcggt 960

cccgaccggg gacaccgacc cacaacgatc ggtgtccccg gtcaccgccc acacatctag 1020

acccggtcga acttccccac cacaaccgca ccaacgaacg catcccactg accgccggtg 1080

aaaacatgca ccgtcccacc gggatccttg gaatcacgca ccccaaccgc gcccccaccc 1140

agaaacgcgg cctcgacacc ttccttgccc ccgccgctct tgctgctctt gaaccaaacc 1200

gcttcgcgta gttcgtcgtt cacgaaaact cccttactgc atcgcgcagc agtcgcctgc 1260

tgctcatctc gtccaacgcg gctcgctgga gaagcctgaa agcggatacg tagccttcga 1320

cgatgtccgg cttctccgtg tacatgtccg ccgagaaccc ctccccgtac acggtcggcg 1380

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)

<400> 2

Met Asn Arg Thr Leu Ala Ala Ile Leu Val Gly Ala Ala Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ile Ala Leu Ala Val Pro Gly Thr Ala Ser Ala Asp Thr Pro Gln

20 25 30

Cys Gly Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Ala Asp Ala Ala Pro Lys

35 40 45

Val Ala Ala Tyr Leu Ala Ala His Pro Asp Val Ala Ala Glu Leu Thr

50 55 60

Lys Val Lys Gly Leu Pro Lys Asp Gln Arg Arg Ala Glu Leu Lys Ala

65 70 75 80

Trp Arg Gln Ala Asn Pro Gln Glu Ala Gln Asp Leu Lys Ala Ala Arg

85 90 95

Gln Ala Val Ile Asp Tyr His Lys Ser Cys Pro Arg Gln Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 528

<212> DNA

<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)

<400> 3

cgaccgcatg cgaatgctgc acccgcacac agatttccag ctcaacggcg acccggtcac 60

ggtgtccgcc gatccggagc gcatcaccca gatcctcacc aacctgctca ccaacgcctg 120

ccaggccatg aaggaccacg gcggcatcac cgtcgacata cgcgcgatcc ccgccgaatc 180

cggtggcggc gggatcgaac tcacggtcac cgacaccggc cccggcatcc cggccgagga 240

ccgcgaccgc atcttcgacc gactggtccg tctcgaccac gcccgcgaca cccgccccga 300

cggctccggt ctgggtctgg ccatcgcccg cggcctggcc cgcgcccacg gcggcgatct 360

gacctgcgcc ggccccaccc ccgatacgac gggcgcggtc ttcgtcctcc gtctccccct 420

gagcccgcca accctgaaga acgcctgaag aaccccgccc gattcagcgc aacttcagca 480

accgcgggca aattcgatgg ggaaccaacc cccaacgatg gagtgagc 528

<210> 4

<211> 519

<212> DNA

<213> 鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)

<400> 4

aagcccccgc gatccgcccc cgcgagcgcc caccgccgag ccacacccct cgcctgcccg 60

gcggccgagc gactgccctc gccacgcgcg gcacgcggtc ccgaccgggg acaccgaccc 120

acaacgatcg gtgtccccgg tcaccgccca cacatctaga cccggtcgaa cttccccacc 180

acaaccgcac caacgaacgc atcccactga ccgccggtga aaacatgcac cgtcccaccg 240

ggatccttgg aatcacgcac cccaaccgcg cccccaccca gaaacgcggc ctcgacacct 300

tccttgcccc cgccgctctt gctgctcttg aaccaaaccg cttcgcgtag ttcgtcgttc 360

acgaaaactc ccttactgca tcgcgcagca gtcgcctgct gctcatctcg tccaacgcgg 420

ctcgctggag aagcctgaaa gcggatacgt agccttcgac gatgtccggc ttctccgtgt 480

acatgtccgc cgagaacccc tccccgtaca cggtcggcg 519

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtacccgac cgcatgcgaa tgc 23

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcggatcgcg ggggcttgct cactccatcg ttgggg 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccccaacgat ggagtgagca agcccccgcg atccgc 36

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagctccgcc gaccgtgtac ggg 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atcttgcgaa tatatgtgta ga 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taaccagacc gttcagctg 19

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcgccgcga tcctggt 17

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gacttgtggt agtcgattac cgc 23

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgaccgcatg cgaatgc 17

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cgccgaccgt gtacggg 17

Claims

1.一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，其特征在于，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌为缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

所述减毒鰤鱼诺卡氏菌命名为鰤鱼诺卡氏菌（Nocardia sp.）ZJ0503-4036，其保藏号为GDMCC No：61259。

2.一种如权利要求1所述减毒鰤鱼诺卡氏菌在制备防治野生型鰤鱼诺卡氏菌活体攻毒的疫苗或免疫佐剂中的应用。