CN108939060B - 一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗 - Google Patents

一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，该口服疫苗是在分离鉴定到中华鳖细菌性腮腺炎病原—一种致病性蜡样芽孢杆菌的基础上，通过优化灭活疫苗口服制备方法，既能加强疫苗与粉料的结合，不易在水中飘散，而且在中华鳖肠道中不易被酸碱快速降解，有利于中华鳖对目的菌抗原的吸收，同时不易形成口服免疫耐受。

Description

一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗
技术领域
本发明涉及中华鳖疾病免疫防治技术领域，特别涉及一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗。
背景技术
中华鳖是一种名贵、经济价值很高的水生动物。在动物分类上，中华鳖属脊索动物门、脊索动物亚门、爬行纲、无孔亚纲、龟鳖目、曲颈龟亚目、鳖科(Trionychidae)。鳖科现有7属23种，我国仅有2属3种，其中鳖属有两个种，即中华鳖(Chinese soft-shelled turtle,Pelodiscus sinensis)和山瑞鳖(Palea steindachneri)，其中以中华鳖最为常见。20世纪60年代日本开始进行中华鳖的人工养殖，我国的台湾、泰国等地随日本之后开始发展中华鳖的人工养殖，中国大陆大约于上世纪70年代中后期开始进行中华鳖工厂化人工养殖。随着我国人民生活水平的日益提高，对鳖的市场需求稳步增长，中华鳖养殖从90年代初期至中期进入了高速发展期。养殖技术也由集约化程度较低的池塘养殖转化为集约化程度较高的室内控温温室养殖，养殖密度大大提高。产量也从1993年的4427吨增长到1996年的32004吨，四年间增长了7倍。随后，我国中华鳖的养殖进入了平稳发展阶段。养殖模式逐渐发展为控温高密度室内养殖结合池塘高密度养殖、池塘鱼鳖混养、池塘鳖和其他水产养殖动物等仿生态养殖。
尽管中华鳖规模化养殖得到了迅猛发展，但品种退化、病害严重以及基础研究薄弱等问题严重影响中华鳖健康养殖的可持续发展。中华鳖病害防治是中华鳖养殖过程中的关键环节之一，它直接关系到养殖者的经济效益。然而，由于中华鳖生物学相关的基础研究工作相对滞后，加上养殖环境因子的复杂性，以及病原的多样性，导致很多病因只能归结于条件性致病，无法对引起中华鳖发病的致病机制进行判定，进而也无法采取有效的措施来进行防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，能够避免或降低中华鳖细菌性腮腺炎病的暴发，对于中华鳖细菌性腮腺炎具有较好的免疫预防作用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，通过以下步骤制备而得：
(1)将蜡样芽孢杆菌接种至灭菌后的TSA液体培养基中，30℃震荡培养8～12h得菌液；
(2)菌液离心，弃上清，收集沉淀，沉淀用无菌PBS缓冲液漂洗2～3次；
(3)步骤(2)漂洗后的沉淀用PBS缓冲液重悬得重悬菌液，加入占重悬菌液体积0.4％的甲醛，混匀后37℃震荡灭活24～48h得灭活菌液；
(4)将灭活菌液与浓度0.02g/mL的海藻酸钠溶液等体积混合得混合液A，将混合液A与植物油按1:5的体积比混匀得混合液B，混合液B与浓度0.03g/mL的氯化钙溶液按照1:6的体积比混合，搅拌固化，离心，收集沉淀；
(5)步骤(4)所得沉淀用PBS缓冲液重悬得重悬液，重悬液与浓度0.02g/mL的壳聚糖液等体积混合进行乳化，搅拌均匀后4℃保存。
本发明针对目前中华鳖产业中危害严重的“腮腺炎”病症，通过细菌学、病毒学的方法，结合养殖水环境的多种水质指标、菌群等因素的变化情况展开了系统性研究，初步确定了中华鳖细菌性“腮腺炎”的病因及其发病机制，确定一种腮腺炎病症的主要致病因子是一种蜡样芽孢杆菌，对中华鳖具有高致死性。受多种因素影响，目前该病发生率居高不下，发病诱因复杂，且市场暂时无显著疗效鱼药可用，所以疫苗接种免疫是一个较好的途径。市面上常见的商品化疫苗主要为灭活苗和弱毒苗。灭活疫苗又称死疫苗，是指利用加热或甲醛等理化方法将人工大量培养的完整的病原微物杀死，使其丧失感染性和毒性而保持免疫原性，并结合相应的佐剂而制成的疫苗。灭活苗虽然免疫期短，常需强化接种，但是成本较低，安全性较高；而弱毒苗由于存在着成本高、易返祖、有潜在感染危险等缺陷，很难在实践中推广应用。根据筛选到的这种高致病性蜡样芽孢杆菌，本发明研制了一种成本低、适宜推广应用的口服疫苗，满足养殖过程中中华鳖细菌性腮腺炎的防疫需要，以期降低中华鳖养殖过程中的发病率和死亡率。作为优选，所述蜡样芽孢杆菌从患有中华鳖腮腺炎的病鳖上分离获得。
作为优选，步骤(2)离心速度8000rpm，时间15min。
作为优选，步骤(2)离心速度3000rpm，时间15min。
作为优选，步骤(3)中PBS缓冲液用量与步骤(1)中TSA液体培养基的体积相同。
作为优选，步骤(5)中PBS缓冲液用量与步骤(1)中TSA液体培养基的体积相同。
本发明疫苗，能够直接拌入饲料中进行投喂口服，因中华鳖日常饲料主要以粉料为主，每天按量进行加工投喂，而本发明所提供的灭活疫苗经过植物油、海藻酸钠、壳聚糖等多种物质乳化后，既能加强与粉料的结合，不易在水中飘散，而且在中华鳖肠道中不易被酸碱快速降解，有利于中华鳖对目的菌抗原的吸收，同时不易形成口服免疫耐受。
本发明疫苗的使用方法为：
(1)按照不同大小的中华鳖每日平均摄食量，在中华鳖饲料粉料中加入适量的灭活疫苗，以保证每天中华鳖摄入疫苗的菌含量达到107个以上；
(2)连续投喂带疫苗饲料5天，再投喂无疫苗饲料3天；重复3次后正常投喂；
(3)间隔3个月后再次进行疫苗投喂免疫。
鉴于中华鳖养殖和病害防控现状，本发明的疫苗具有以下优点：
1、本发明的灭活疫苗能够直接添加入饲料中，可以口服投喂免疫，操作简单便捷.
2、本发明的灭活疫苗在制备过程中加入了适宜的佐剂，不容易在口服过程中被肠道降解，有利于中华鳖的免疫保护；
3、本发明的灭活疫苗对人和环境较安全，不会造成污染。
附图说明
图1为中华鳖细菌性腮腺炎病原菌分离平板。
图2为中华鳖细菌性腮腺炎病原菌的种类鉴定。1:Bacillus cereus(蜡样芽胞杆菌)；2:Bacillus thuringiensis(苏云金芽孢杆菌)；3:Bacillus anthracis(炭疽杆菌)；4:Bacillus(芽孢杆菌属)。
图3为口服疫苗免疫后不同时段的血清抗体水平TAS-ELISA试验。1、PSB对照；2、口服免疫组1：连续免疫14天；3、口服免疫组2：连续投喂5天后停3天，重复3次。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例：
1、材料
感染致病性蜡样芽孢杆菌的中华鳖(患腮腺炎病鳖)采集自浙江省杭州市萧山区某中华鳖养殖场；正常中华鳖购自浙江省杭州市春潮特种两栖爬行动物研究院；所用海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙购自由上海生工生物公司；甲醛、PBS、培养基购自上海捷瑞生物公司；植物油等购自超市。
2、病原菌的分离与鉴定
(1)采集具有典型性中华鳖腮腺炎的病鳖，用医用酒精棉擦拭病鳖体表后，用无菌剪刀和镊子打开鳖腹腔，再用一次性无菌接种环分别粘取鳖肝、脾、肺组织在TSA固体平板上采用划线分离法获取单菌落。
(2)TSA固体平板经30℃培养8h后观察菌落生长情况(图1)，挑取优势单菌落置于TSA液体培养基中，置于恒温摇床中，30℃，200rpm培养。
(3)细菌鉴定：一是进行革兰氏染色和生理生化分析，观察细菌形态和物化特点；二是采用16SrDNA通用引物27F/1492R进行PCR获得细菌核酸序列，经序列测定后，在NCBI数据库中进行BLAST分析，初步确定细菌种属。
(4)对分离到的细菌进行全基因组测序和生物信息学分析，确定该细菌为一种蜡样芽孢杆菌(图2)，其毒力基因序列见SEQ ID No.1。
3、疫苗的制备
(1)配置2.5L TSA液体培养基，121℃湿热灭菌20min，挑选蜡样芽孢杆菌单菌落接种于冷却的培养基中，30℃震荡培养8～12h，测定菌液浓度。
(2)菌液离心(8000rpm，15min)，弃上清，收集沉淀，沉淀用无菌PBS缓冲液漂洗2～3次。
(3)步骤(2)漂洗后的沉淀用2.5L PBS缓冲液重悬得重悬菌液，加入占重悬菌液体积0.4％的甲醛，混匀后37℃震荡(80～100rpm转速)灭活24～48h得灭活菌液；随机分别接种到TSA固体平板和液体培养基(中30℃培养12h检测无活菌后备用；
(4)将灭活菌液与浓度0.02g/mL的海藻酸钠溶液等体积混合得混合液A，将混合液A与植物油按1:5的体积比混匀得混合液B，混合液B与浓度0.03g/mL的氯化钙溶液按照1:6的体积比混合，搅拌固化30min，3000rpm离心15min，收集沉淀；
(5)步骤(4)所得沉淀用2.5L PBS缓冲液重悬得重悬液，重悬液与浓度0.02g/mL的壳聚糖液(壳聚糖与水混合而成)等体积混合进行乳化，搅拌均匀后4℃保存。
4、疫苗的使用
(1)按照400G中华鳖每日平均摄食量5G计算，在中华鳖饲料粉料中加入适量的灭活疫苗，以保证每天中华鳖摄入疫苗的菌含量达到107个以上；
(2)方案一：连续投喂2周(标记为“口服免疫组1”)；方案二：连续投喂带疫苗饲料5天，再投喂无疫苗饲料3天；重复3次后正常投喂(标记为“口服免疫组2”)；PBS为对照组；
(3)间隔3个月后再次进行疫苗投喂免疫。
5、中华鳖口服免疫效果评估
(1)随机挑选免疫后28天的中华鳖和PBS对照组各30只，利用半致死剂量进行人工感染，进行相对免疫保护率(Relative percent survival，RPS)比较，其中RPS＝(对照组死亡率—免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％；
(2)攻毒后继续饲养观察10天，统计中华鳖存活数和相对保护率。利用本发明发现的一种中华鳖细菌性腮腺炎病原——蜡样芽孢杆菌(B.Cereus)，经过病原菌回感试验(以生理盐水按10-1梯度逐级稀释蜡样芽孢杆菌(108～104cpu/ml)，PBS为对照)已表明该菌具有高致病性与致死率，其LD50浓度为1.1×105cfu/ml(表1)，采用口服灭活疫苗免疫的方式进行阶段性免疫后，分不同的时间段采集中华鳖血清，利用TAS-ELISA试验分析了免疫后中华鳖血清相应抗体的变化，结果表明中华鳖血清中目的抗体显著提高(图3)；相对免疫保护率试验表明，口服疫苗后中华鳖在病原菌感染后存活率明显提高(表2)。
表1分离病原菌感染中华鳖致死率试验结果
Figure BDA0001500522350000081
表2口服疫苗相对免疫保护率试验结果
Figure BDA0001500522350000082
根据以上实验结果表明，本发明所确定的中华鳖细菌性腮腺炎病原菌—蜡样芽孢杆菌及在其基础上制备的口服灭活疫苗能够有效地提高中华鳖养殖过程中抗该种病原菌的感染能力，能够显著降低中华鳖腮腺炎的爆发。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗
<130> 2017.12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2301
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)
<400> 1
atgtatatga aaaaaagaaa agcgttaata ccattaatgg cattgtctac gatattagtt 60
tcaaacacaa gtaatttagg tgtaattcag gcagaagtta cacaggagaa ccagttatta 120
aatgaatcag aatcaagttc tcaagggtta ttaggatact attttagtga tttgaatttt 180
caagaaccca tgttgattac tccttctact acaggagatt tatctatttc tagttctgag 240
ctagaaaata ttccatcgga aaaccaatat tttcaatctg caatttggtc aggatttatc 300
aaagtagaga agagtgaaga atatacattt gctacttcca ctgatgatca tgtaacaatg 360
tgggtagata atcaagaagt gattaataaa tcttctaatt ctaacaaaat cagattagaa 420
aaagggcaat tataccaaat aaaaattcaa tatcaacgag aaaatcctac tgaaaaagga 480
ttggatttca agttgtactg gaccgattct caaaataaaa aagaagttat ttctagtgat 540
aacttacaat tgccagaatt aaaacaaaaa tcttctaact caagaaaaaa gcgaagtaca 600
aatgctggac ctgaggttcc agaccgcgac aatgatggaa ttccggattc attagaggta 660
gaaggatata cggttgatgt caaaaataga agaacctttc tttcaccatg gatttctaat 720
attcatgaaa agaaagggtt aaccaaatat aaatcatctc ctgaaaagtg gagtacagct 780
tctgacccat acagtgattt tgaaaaggtt acagggcgta tcgataaaaa cgtatcacga 840
gaggcaagac acccccttgt ggcagcttat ccaagtgtac atgtagatat ggagaatatt 900
attctttcaa aaaatgaaga tcgatccaca cagaatgctg ctagtcaaac gagaaccata 960
agtaaaaata cttctacaag taggacacat actagtgaag tacatggaaa tgcagaagtg 1020
catgcgtcgt tatttgatat tggagggagt gtatctgcag gatttagtaa ttcgaattca 1080
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atgggtttaa ataccgcaga tacagccaag ttaaatgcaa atattagata tgtaaatact 1200
gggacggctc ccatctataa cgtgttacca acgacttcgt tagtgttagg aaagaatcaa 1260
acactcgcga caattaaagc taaggaaaat caattaagtc aaatacttgc acctaataat 1320
tattatcctt ctaaaaactt ggcgccaatc gcattaaatg cacaagacga tttcagttct 1380
actccaatta caatgaatta taatcaattc cttgagttag aaaaaacgaa acaattaaga 1440
ttagatacgg atcaggtata tgggaatata gcaacataca attttgaaaa tggaagagtg 1500
agggtggata caggctcgaa ctggagtgat gtgttacctc aaatccaaga aacaaccgca 1560
cgtatcattt ttaatgggga agatttgaat cctgtagaga gacgtatagc tgcggtagat 1620
cctaatgatc cgctagaaat gactaaacca gatgtaacat taaaagaagc acttaaaatt 1680
gcatttggtt ttaaggataa gaatggtaat tttgaataca aagggaaaga tgtttccaag 1740
tttgaatttg tattcgatca agaaacggct caaaacattc aaattcaatt ggaatcatta 1800
gaaattaaca atatatataa tgcgctagac agaatcaaat taaatgcaaa aatgaatatt 1860
ttaataagag ataaacgttt tcattatgat agaaataaca tagcagttgg ggcggatgag 1920
tcagtaatta aggaggctca tagagaagta attaattcct caacagcggg actcttgtta 1980
aatattgata aggatataag aaaaatatta tcaggttata ttgtagaaat cgaagatact 2040
gaagggcgta aagaagttat aaatgacagg tatgatatgt tgaatatttc tagtttatgg 2100
caagatggaa aaacatttat agactttgaa aagtttaatg ataaattacc gttatatata 2160
agtaacccca attataaggt aaatgtatat gctgttacta aagaaaatac tattattaat 2220
cctggtgaga atggggatac cagtaccgac gggatcaaga aaattttaat cttttctaaa 2280
aaaggctatg agataggata a 2301

Claims (4)

1.一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，其特征在于，通过以下步骤制备而得：
（1）将蜡样芽孢杆菌接种至灭菌后的TSA液体培养基中，30℃震荡培养8～12h得菌液；
（2）菌液离心，弃上清，收集沉淀，沉淀用无菌PBS缓冲液漂洗2～3次；
（3）步骤（2）漂洗后的沉淀用PBS缓冲液重悬得重悬菌液，加入占重悬菌液体积0.4%的甲醛，混匀后37℃震荡灭活24～48h得灭活菌液；
（4）将灭活菌液与浓度0.02g/mL的海藻酸钠溶液等体积混合得混合液A，将混合液A与植物油按1:5的体积比混匀得混合液B，混合液B与浓度0.03g/mL的氯化钙溶液按照1:6的体积比混合，搅拌固化，离心，收集沉淀；
（5）步骤（4）所得沉淀用PBS缓冲液重悬得重悬液，重悬液与浓度0.02g/mL的壳聚糖液等体积混合进行乳化，搅拌均匀后4℃保存；
所述蜡样芽孢杆菌从患有中华鳖腮腺炎的病鳖上分离获得；蜡样芽孢杆菌毒力基因序列见SEQ ID No.1；
步骤（3）中PBS缓冲液用量与步骤（1）中TSA液体培养基的体积相同。
2.根据权利要求1所述的一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，其特征在于，步骤（2）离心速度8000rpm，时间15min。
3.根据权利要求1所述的一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，其特征在于，步骤（2）离心速度3000rpm，时间15min。
4.根据权利要求1所述的一种中华鳖细菌性腮腺炎口服疫苗，其特征在于，步骤（5）中PBS缓冲液用量与步骤（1）中TSA液体培养基的体积相同。
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