CN104498384B - 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用 - Google Patents

一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104498384B
CN104498384B CN201410587953.2A CN201410587953A CN104498384B CN 104498384 B CN104498384 B CN 104498384B CN 201410587953 A CN201410587953 A CN 201410587953A CN 104498384 B CN104498384 B CN 104498384B
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
haemophilus parasuis
serum
bacterial strain
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410587953.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104498384A (zh
Inventor
李晓成
邵卫星
吴发兴
张志�
刘爽
董雅琴
李鹏
王佳
于美芳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Original Assignee
CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER filed Critical CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority to CN201410587953.2A priority Critical patent/CN104498384B/zh
Publication of CN104498384A publication Critical patent/CN104498384A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104498384B publication Critical patent/CN104498384B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/21—Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明提供了一株副猪嗜血杆菌GX0905(血清13型)，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2014125。该菌株生物学性能稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。

Description

一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物免疫领域，具体地说，涉及一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用。
背景技术
副猪嗜血杆菌病又称格拉泽氏病(Glasser’sdisease)，由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，Hps)引起。该病于1910年由德国学者Glasser首先报道，现已在全世界范围内广泛分布。目前，副猪嗜血杆菌感染是引起猪场仔猪高死亡率的主要病因之一。在美国，该病已成为危害保育猪群健康的重要传染病，与蓝耳病(PRRS)、圆环病毒(PCV)并列为第一位，排在流感、链球菌和大肠杆菌病之前。该病目前也给中国猪群带来很大威胁，随着猪繁殖与呼吸综合征(PRRS，蓝耳病)的流行，副猪嗜血杆菌病给猪群造成的损失比以往更为严重，而爆发性的副猪嗜血杆菌病也比以往更为普遍。
Hps只感染猪，有很强的宿主特异性，可以影响2周龄～4月龄的猪，主要在断奶前后和保育舍阶段发病，常见于5～8周龄，感染高峰通常见于保育期的4～6周，有些可早在保育舍内最初2周时就开始出现，并一直持续到肥育期早期，发病率可达40％，严重时死亡率可达50％。与以往相比，本病的流行特点已经发生改变。以前本病是零星散发发生的，且与断奶猪的应激有关，但目前此病的发病率和死亡率均呈显著上升趋势,呈现地方流行性，而且常与猪的几种重要病原体并发感染，如与猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒引起混合感染。
Hps是一种细小杆菌，在显微镜下呈多形态，非溶血性，不运动，无芽孢，无鞭毛，革兰氏阴性。新分离的菌株多呈球杆状或双球状， 有时可呈短链状，在陈旧培养物中多呈多形态，有长杆状和丝状。Hps属于需氧或兼性厌氧菌，最适生长温度为35～37℃，pH7.6～7.8，CO23％～5％。在适宜培养基上生长的菌落呈圆形，隆起，表面光滑，边缘整齐，灰白色半透明，针尖大小。Hps培养条件严格，生长依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD或V因子)，不需要X因子。在巧克力培养基上生长较差，在加NAD、马血清的M96支原体培养基或加酵母浸出物的PPLO培养基上生长良好。目前副猪嗜血杆菌至少有15种血清型，其中血清1、5、10、12、13、14型毒力最强，2、4、8、15型具有中等毒力，3、6、7、9、11型不能引起临床感染。从世界范围内看，血清4、5、13型最为流行，日本、德国、美国、西班牙、加拿大和中国以血清4型和5型最常见，澳大利亚和丹麦分离的菌株主要为血清5型和13型，但临床分离菌中约20％无法定型。但最新的研究结果表明，危害北美各猪场的Hps流行血清型发生了改变，在美国的猪场中血清5型不再广泛流行，而以血清4型(39％)和不能分型的分离株(27％)最为流行。我国当前Hps流行的优势血清型主要为4、5、12、13型。Hps毒力和致病性可能与细菌毒素有关，但至今这方面的报道很少。副猪嗜血杆菌是否只产生巴氏杆菌科的一些非常重要的毒力因子如荚膜、菌毛、脂多糖、外膜蛋白以及它们与本菌的毒力是否有关，目前还知之甚少。
我国是猪肉消费大国，猪肉的消费占总体肉食消费的80％以上，生猪价格的波动会严重影响居民消费指数。目前曾严重影响我国养猪业的猪瘟、高致病性蓝耳病、猪圆环病毒病等已经得到有效控制，但以副猪嗜血杆菌病为代表的细菌病对养猪业的危害正日益加重。从而导致大量使用抗生素进行治疗，结果是：一方面导致猪产品抗生素超标，危害人的身体健康，另一方面导致细菌耐药性不断增强，耐药菌株不断出现，尤其是副猪嗜血杆菌，非常容易耐药，导致治疗效果不好，从而养殖户加大抗生素用量，造成恶性循环。国外研究表明，用 同血清型的菌株制成的灭活疫苗能够有效抵抗野毒株的感染，是预防和控制副猪嗜血杆菌病最有效的措施。近年来，国内也开展了灭活疫苗的研究，显示了很好的防治效果。因此，在了解本我国主要流行菌的血清型的基础上，采用灭活疫苗进行接种，可以有效预防本病的发生。血清13型副猪嗜血杆菌致病力较强，在世界范围内流行最广，在我国也流行最广泛，引起的危害也最大。同为13型的不同副猪嗜血杆菌菌株毒力不同，免疫原性也不同，所以，通过动物试验筛选出一株毒力强、免疫原性好的菌株是制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗的关键技术。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一株毒力强、免疫原性好的血清13型副猪嗜血杆菌及其应用。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供一株血清13型副猪嗜血杆菌GX0905，分类命名为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)GX0905(血清13型)，已于2014年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO:M2014125。
该菌株是发明人于2010年9月在河南省郑州市一猪场发病猪分离获得的一株副猪嗜血杆菌，经琼脂凝胶扩散试验证明，该菌株为血清13型。培养该菌株，经甲醛灭活，与适宜的佐剂混合，制成单价灭活疫苗，经动物试验表明，该菌株具有较强毒力和很好免疫原性。
所述血清13型副猪嗜血杆菌株GX0905与其他13型副猪嗜血杆菌比较具有如下生物学特性：
1.致病力强用该菌腹腔注射攻击16g～20g健康Balb/c小鼠，剂量为5.0×109CFU/只，可导致70％以上小鼠死亡。用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易感仔猪，剂量为5.0×109CFU/只，可导致100％以上仔猪发病或死亡。
2.免疫原性好灭活该菌，与白油佐剂1：2乳化制成灭活疫苗，使每毫升疫苗中含灭活前活菌数为2.0×109CFU，接种2～3周龄健康易感仔猪，首免2周后，以相同剂量再接种一次，二免3周后，用该菌腹腔注射攻击50日龄左右的健康易感仔猪，剂量为5.0×109CFU/只，免疫组猪100％保护，而对照组100％仔猪发病或死亡。
3.繁殖滴度高该菌的培养液OD值与活菌数大致呈现一种线性关系，经过拟合，得到菌液OD值与活菌数关系曲线Y＝(15.244X-0.1959)×108CFU/mL(R＝0.9862)。通过菌液OD值与活菌数的关系曲线，在确定菌液中活菌数时，可以很方便的通过测定菌液的OD值而得到。
本发明还提供了所述血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905在制备防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
本发明进一步提供一种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，包含前述菌株或由前述菌株制备。所述疫苗可为单价或多价疫苗。
当其为单价疫苗时，可针对性较强的防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病；当其为多价疫苗时，也可有效的防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病。
作为优选，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活前述菌株。
作为优选，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为1.0-5.0×109CFU/mL。
更为优选，所述单价疫苗的含菌量为2.5×109CFU/mL。
所述单价疫苗的制备方法为：培养前述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价灭活疫苗。
所述佐剂可为本领域制备疫苗时常规选用的任何佐剂，为了更好的提高疫苗的免疫效果，所述佐剂选自白油、铝胶、206和GEL中的一种。
本发明还进一步提供用于扩增所述菌株OmpA5基因的引物对， 所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物：OmpA5F：CCACAAGCTAACAC；
下游引物：OmpA5R：AACTTCTTTTGAACCT。
OmpA5蛋白是副猪嗜血杆菌一个外膜蛋白，具有种属特异性，而不具有型特异性，是副猪嗜血杆菌一个主要免疫蛋白。通过该引物可以检测所有型的副猪嗜血杆菌，不具有血清型特异性。
以及用于扩增所述菌株16S rRNA基因的引物对，所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物F：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′
下游引物R：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′。
该引物对可用于检测本发明所述菌株。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的血清13型副猪嗜血杆菌GX0905生物学性能稳定，对仔猪具有很强的致病性，灭活后接种仔猪，具有很好的免疫原性。将其作为疫苗候选株制成的单价疫苗安全性好，能够对仔猪产生较高的抗体，持续期长，能够抵抗同型野毒株的攻击，具有很好的免疫效力。在临床上使用该灭活疫苗，能够有效降低该病的发生，减少猪场的经济损失，其免疫效果达到或优于市场上现有商品化疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例2中副猪嗜血杆菌活菌数与OD600值的相关性曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1血清13型副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
1.病原菌的分离
用无菌接种环从疑似病猪新鲜的肺脏、心包积液、关节液等病料中取样，在TSA培养基(含终浓度5％血清和0.001％的NAD)上划线 接种，37℃培养24h～48h后观察生长情况，对疑似菌落进行革兰氏染色镜检。挑取单个菌落，在TSA固体培养基上采取分区划线法，进行3～5次单菌落纯化培养，直至无任何杂菌为止。
2.病原菌的鉴定
2.1 NAD依赖性试验
在II级生物安全柜中，用接种环挑取上述可疑菌的单菌落，水平划线于无NAD的TSA平皿上，在挑去金黄色葡萄球菌垂直于水平划线，37℃培养24h～48h，结果出现了“卫星生长现象”，即在葡萄球菌苔附近的的菌落较大，远侧的菌落较小甚至没有菌落存在。
2.2镜检
挑取上述纯化培养的单菌落在事先滴有生理盐水的载玻片上涂菌，按照常规革兰氏染色法进行染色，在光学显微镜观察。在显微镜下可见，细菌为革兰氏阴性细小杆菌，具有多种不同的形态，从单个的球杆菌到长的、细长的、甚至有细丝状的菌体。
2.3生化鉴定试验
在II级生物安全柜中，用接种环分别挑取分离纯化的疑似副猪嗜血杆菌的单菌落，水平划线于新的TSA培养基上，于37℃培养14h～16h。刮取多个菌落(成团状最佳)，分别接种尿素酶、氧化酶、硝酸盐还原、蛋白胨水(吲哚)、葡萄糖、阿拉伯糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖和ONPG(β-半乳糖苷)等微量生化鉴定管中，并在每个微量生化鉴定管中加入3μl～5μl0.1％NAD，并设置对照管。于37℃培养24h～48h，观察并参照厂家说明书判定试验结果。结果为半乳糖、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖、尿素、ONPG、硝酸盐还原、尿素酶、麦芽糖为阳性，而阿拉伯糖、棉籽糖、木糖、乳糖、山梨醇、硫化氢、吲哚为阴性。生化结果表明该菌符合副猪嗜血杆菌的生化特征。
2.4 PCR鉴定
将待检菌株菌液12,000r/min离心3min，弃去上清液后，用无 菌DEPC水悬浮，在振荡器上涡旋1min，于沸水中水浴20min，取出后置于-20℃冰箱中冻结。冻融后12,000r/min离心1min，上清液即为模板DNA。
参照Olveira S等发表的副猪嗜血杆菌16S rRNA基因序列设计引物，对分离的疑似HPS菌株进行PCR鉴定。
上游引物F：5′-GGC TTC GTC ACC CTC TGT-3′
下游引物R：5′-GTG ATG AGG AAG GGT GGT GT-3′
PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
以菌液DNA为模板，反应体系(25μl)如下：
反应条件：94℃预变性4min；94℃变性50S，59℃退火50S，72℃延伸1min，运行30个循环；72℃再延伸10min，PCR产物4℃保存。以DEPC水为模板作阴性对照。
用1×TAE电泳缓冲液配制的终浓度1.3％琼脂糖，融化后加入适量DuRed核酸染料一起倒入制胶板封固，取上述PCR产物5μl加入样品孔中，在1×TAE电泳缓冲液中加以适当电场使DNA样品向正极移动30min～60min。电泳结束后在Bio-Rad GelDoc凝胶电泳成像分析系统成像观察，结果出现预期PCR扩增产物的片段为822bp。
2.516S rRNA PCR扩增产物测序
将1.3％的琼脂糖凝胶中电泳检测为阳性后扩增的PCR产物(DNA片段)，利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，然后与pMD18-T克隆载体连接，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.6血清学分型
根据KeilSteia和Rapp-GabrielSon(1992)所建立的方法，即利用琼脂扩散试验(Gel diffusion，GD)血清学分型的方法鉴定副猪嗜血杆菌血清型。利用标准菌株用健康新西兰大白兔制备高免分型血清；用分离菌株按照上述文献制备沉淀抗原。琼脂扩散试验过程大致如下：凝胶的配制：琼脂糖1g，氯化钠8.5g，溶于100ml PH7.2～7.4PBS中，置于微波炉10min融解，加入含量0.1g/100ml硫柳汞防腐，倒平板3mm～4mm厚，用打孔器在平板上按需要打孔(孔径3mm，孔间距4mm)，热熔封底；然后在中央孔加分离菌株制备的沉淀抗原，周围孔加标准的阳性血清，放入湿盒中，于37℃24h后观察结果，连续观察2d～3d。主要观察抗原与抗体孔之间的是否出现清晰的白色沉淀线，若有则判定为阳性，反之则判定为阴性。结果抗原与13型阳性血清发生反应，出现白色沉淀，证明分离的菌株为血清13型副猪嗜血杆菌，并命名为GX0905。
实施例2白油佐剂灭活疫苗制备
1、抗原制备
将副猪嗜血杆菌GX0905株接种在TSA固体培养基上复苏，连续传3代复壮，将复壮的副猪嗜血杆菌接种于TSB液体培养基中，在摇床内37℃培养12h～14h左右，作为种子液，再将种子液按培养基总体积的1％接种于预热到37℃的TSB液体培养基，37℃，180r/min振荡扩大培养14h～16h，用分光光度计测定菌液OD600值，根据活菌数与OD600值相关性标准曲线公式，计算细菌总菌含量。然后向菌液中加入终浓度0.2％的甲醛灭活细菌，置于37℃恒温箱灭活14h～16h，灭活期间，没4h～5h摇动一次。到时间后，取灭活的菌液，在TSA固体培养基划线培养，置于37℃培养48h，观察是否灭活彻底。将完全灭活的菌液4000r/min离心20min，弃去上清，生理盐水悬浮沉淀，洗涤3次，最后一次加入适当体积的生理盐水，使菌液浓度为1.0×1010 CFU/mL，向其中加入终浓度为0.01％的硫柳汞溶液，置4℃保存备用。
2、疫苗制备
将灭活检验合格的菌液按体积加入终浓度为4％的灭菌吐温-80，边加边搅拌，至完全溶解，制成灭活疫苗水相。水相与白油佐剂的比例为1:3。将白油佐剂在实验室高速分散机搅拌器中缓慢搅拌，再取适量水相缓慢加入，开动电机乳化5min～10min，直至乳化完全，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为2.5×109CFU/mL，置于4℃保存。
实施例3铝胶佐剂灭活疫苗制备
抗原制备步骤如实施例2。
疫苗制备：
将灭活检验合格的菌液与等量含量为20％的灭菌氢氧化铝盐水稀释液均匀混合，在室温下静置沉淀24h，按全量总体积的1/2吸出上清液，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为2.5×109CFU/mL CFU/mL，置于4℃保存。
实施例4 206佐剂灭活疫苗制备
抗原制备步骤如实施例2。
疫苗制备：
将灭活检验合格的抗原与等体积灭菌206佐剂均匀混合。将206佐剂在实验室高速分散机搅拌器中缓慢搅拌，再取等量混合溶液缓慢加入，启动开关乳化20min～30min，直至乳化完全，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为2.5×109CFU/mL CFU/mL，置于4℃保存。
实施例5 GEL佐剂灭活疫苗制备
抗原制备步骤如实施例2。
疫苗制备：
将灭活检验合格的抗原与GEL佐剂按照9比1的比例均匀混合。将细菌抗原在实验室高速分散机搅拌器中缓慢搅拌，再取适量GEL佐剂缓慢加入，启动开关搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终含量万分之一的硫柳汞溶液。疫苗成品中细菌的含量为2.5×109CFU/mL CFU/mL，置于4℃保存。
实施例6 GEL佐剂灭活疫苗制备
同实施例5，区别在于仅在于疫苗成品中细菌的含量为5.0×109CFU/mL，置于4℃保存。
实施例7白油佐剂灭活疫苗制备
同实施例2，区别在于仅在于疫苗成品中细菌的含量为1.0×109CFU/mL，置于4℃保存。
实施例8血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株的生物学特性
1.血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株外膜蛋白OmpA5基因序列
根据已发表的副猪嗜血杆菌OmpA5基因序列，设计引物，扩增血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株OmpA5基因。经测序，GX0905株外膜蛋白OmpA5基因的核苷酸序列如SEQID No.2所示。
2.副猪嗜血杆菌生长曲线的测定
将副猪嗜血杆菌GX0905株接种在TSA固体培养基上复苏，然后连续传3代复壮，将复壮的副猪嗜血杆菌接种于TSB液体培养基(含终浓度5％血清和0.001％的NAD)中，在摇床内37℃培养12h～14h左右，作为种子液，再将种子液按培养基总体积的1％接种于预热到37℃的TSB液体培养基，37℃，180r/min振荡培养。培养期间每隔2h取样，倍比稀释后接种于TSA培养基上，培养后进行平板菌落计数。用台式酸度计测定每次取样的pH值，用分光光度计测定培养基的OD600值，将试验结果绘制成曲线。结果表明，在TSB液体培养基中培养，细菌接种6h开始进入对数生长期，培养18h～20h 活菌数达到最高峰，在20h后活菌数大幅度下降，到26h～34h有个小幅增长的趋势，但此后活菌数呈缓慢下降趋势。
3.副猪嗜血杆菌在不同条件下保存时间的测定
将复壮后副猪嗜血杆菌GX0905株接种于TSA固体培养基，37℃恒温箱培养24h后，再分别保存于TSA、TSB、甘油+PBS溶液、甘油+血清溶液、卵黄液、卵黄液冻干，收获后以不同条件进行保存。一定时间后将保存细菌复苏，观察是否存活，以寻找合适的副猪嗜血杆菌的保存方法。结果见表1。
表1副猪嗜血杆菌在不同环境条件下保存的存活时间
表1显示：副猪嗜血杆菌在不同环境条件的生存时间差异很大，在TSA或TSB培养基上4℃保存时间不超过10d；甘油PBS或甘油血清中-20℃生存时间一般在35d～60d；在卵黄液中保存于-70℃冻存，可以存活2年以上；若将卵黄液真空冻干后在-70℃可保存至少2年以上。通过了解不同保存条件下细菌存活的时间长短，可根据需要选择不同的细菌保存方式。
4.副猪嗜血杆菌活菌数与OD600值关系的测定
将待检菌株复壮后，均匀涂布于TSA固体培养基上，37℃培养16h～18h，用PBS溶液洗下菌苔，稀释均匀后分为若干份，再将每一份稀释成不同的浓度梯度，同时测定其活菌数和OD600值，绘制其相关性曲线，见图1。
图1显示：将OD600值与对应的活菌数的交点连线，最后按照各点的连线利用Excel软件进行趋势预测/曲线回归分析，发现活菌数和OD600值呈现线性相关，其相关性用公式表示为：
y＝15.244x-0.1959，R2＝0.9727。
但是随着OD600值的增加，偏离的趋势越明显。
5.致病性试验
5.1对Balb/c小鼠半数致死量(LD50)测定
为测定副猪嗜血杆菌分离菌株GX0905株的毒力，参照寇氏(KorBor)法测定对Balb/c小鼠LD50。选用16g～20g健康Balb/c小鼠60只，随机分为6组，每组10只，根据预试验中Balb/c小鼠全死亡或90％以上死亡的剂量和动物不死亡或10％以下死亡的剂量，分别作为Balb/c小鼠试验的最高剂量和最低剂量结果。按最高剂量和最低剂量将副猪嗜血杆菌按不同剂量稀释为5个梯度，经腹腔内注射0.5ml活菌，同时设置对照组，注射后连续观察10d，统计各组小鼠的死亡率，计算该菌对Balb/c小鼠的半数致死量(LD50)。结果副猪嗜血杆菌GX0905株对Balb/c小鼠的LD50为5.06×108CFU。
5.2对健康易感仔猪致病性试验
TSB液体培养基加5％血清和0.001％的NDA，用该培养基培养13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株12～14h，使活菌数达到1.0×108CFU/mL，经腹腔注射50日龄健康易感猪，3mL/头，另设1组3头猪作对照，腹腔注射TSB培养液。攻菌后，连续观察7日，每日测体温，并观察临床症状，包括采食和饮水量的变化。7日后剖杀所有猪，根据临床症状和剖检病变计算发病数量。同时取肺组织和肿大的关节液做细菌分离和鉴定。
攻毒结果显示：在连续观察7天期间，攻击血清13型副猪嗜血杆菌GX0905株的5头猪仔猪全部死亡，而对照猪表现正常。攻毒猪表现为开始1～2日开始体温升高，最高达42.5℃，然后体温逐渐下降，在猪死亡前，体温低于正常。在死前采食量降低，被毛粗乱，喜卧，到后期死亡前呼吸困难。剖检所有5头猪，基本表现出同样的症状，只是解剖病理变化有轻有重，主要表现为胸腔积液，有大量纤维 性渗出，导致胸膜粘连，有的猪关节液增多、肺部淋巴结肿大，肺有间质水肿，心包积液增多，有大量纤维素性渗出。
从发病猪的关节和肺部采样，进行细菌分离。从攻毒5头猪中均分离到副猪嗜血杆菌，而对照3头猪全部没有分离到副猪嗜血杆菌。
6.对豚鼠免疫原性试验
取25只7周龄豚鼠，平均分5组，每组5只，1～4组分别接种实施例2-5制备的疫苗，每只颈部皮下注射0.5mL，第5组作对照。第一次接种后14天，重复接种一次，剂量同第一次。第二次接种21天后，心脏采集血液，分离血清。用微量板凝集试验检测各组每头豚鼠的抗体效价，结果见表2。
表2第一次接种后35天各组抗体效价*
*:抗体效价为微量板凝集试验抗体效价(xlog2)
从表2中可见，副猪嗜血杆菌GX0905株与不同类型佐剂混合，均可引起很高的抗体效价，其中GEL组引起的效价最高，其次是白油佐剂组，最低的是铝胶佐剂组。
评价疫苗有2个最重要的指标，即安全性和有效性，在保证有效的前体下，尽可能保证疫苗的安全性，同时作为兽用疫苗，还要可虑疫苗的成本，不可能象人用疫苗那样，基本不需要考虑疫苗的成本。因此，尽管在4种佐剂中，铝胶的疫苗效果最差，但仍然有效，只是效果差些，但安全性最好，而且成本最低，综合考虑，选择铝胶作为 疫苗佐剂。
实施例9用血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株为疫苗候选株制备的铝胶单价灭活疫苗的安全性和免疫效力
1.用血清13型副猪嗜血杆菌分离株GX0905株为疫苗候选株制备的铝胶单价灭活疫苗的制备，见实施例3。
2.灭活疫苗的安全性试验
用3～4周龄健康易感仔猪8头，其中5头颈部肌肉注射灭活疫苗4.0mL，另3头注射相同剂量的PBS，连续观察14日，每天在固定时间内测量每头猪的体温，观察注射部位和全身反应，包括采食和饮水量，重点检查注射部位的变化。结果在观察期内，没有出现任何由疫苗引起的局部和全身不良反应。
3.灭活疫苗的效力试验
用2周龄健康仔猪10头，其中5头猪颈部肌肉接种疫苗，2.0mL/头，14日后，以相同剂量再接种一次；另5头作对照组，接种相同剂量的PBS。二免后21日，用新鲜培养的副猪嗜血杆菌GX0905株腹腔注射，3.0×109CFU/头，攻菌后连续观察14日。在观察期间，主要观察临床症状。动物的发病标准：发病猪出现发热(体温40.5℃以上，持续1～5天)精神萎靡、咳嗽、呼吸困难、消瘦、跋行和被毛粗乱等临床症状。死亡的猪进行解剖，可见胸膜炎、心包炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎等多发性浆膜和关节炎的病变，各浆膜面出现浆液性或纤维素性渗出物。结果为对照组全部发病死亡，而免疫组全部保护，没有出现任何临床症状，保护率为5/5，说明疫苗对仔猪具有很好的免疫效力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一株血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905，其特征在于，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014125。
2.权利要求1所述的血清13型副猪嗜血杆菌菌株GX0905在制备防治由血清13型副猪嗜血杆菌导致的副猪嗜血杆菌病的药物中的应用。
3.一种防治副猪嗜血杆菌病的疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述菌株或由权利要求1所述菌株制备。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗，包含灭活的权利要求1所述菌株。
5.根据权利要求3或4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为单价疫苗，含菌量为1.0～5.0×109CFU/mL。
6.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的含菌量为2.5×109CFU/mL。
7.根据权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的制备方法为：培养权利要求1所述菌株，经甲醛灭活，与佐剂混合，制成单价灭活疫苗。
8.根据权利要求7所述的疫苗，其特征在于，所述佐剂选自白油、铝胶、206和GEL中的一种。
9.下述核苷酸序列的引物对在扩增权利要求1所述菌株OmpA5基因方面的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物：OmpA5F：CCACAAGCTAACAC；
下游引物：OmpA5R：AACTTCTTTTGAACCT。
10.下述核苷酸序列的引物对在扩增权利要求1所述菌株16SrRNA基因方面的应用，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列为：
上游引物F：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′；
下游引物R：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3′。
CN201410587953.2A 2014-10-28 2014-10-28 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用 Active CN104498384B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410587953.2A CN104498384B (zh) 2014-10-28 2014-10-28 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410587953.2A CN104498384B (zh) 2014-10-28 2014-10-28 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104498384A CN104498384A (zh) 2015-04-08
CN104498384B true CN104498384B (zh) 2017-05-24

Family

ID=52939838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410587953.2A Active CN104498384B (zh) 2014-10-28 2014-10-28 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104498384B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105543120B (zh) * 2015-09-17 2020-06-19 龙岩学院 一种副猪嗜血杆菌五价灭活疫苗

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968490A (zh) * 2010-08-26 2011-02-09 广东省农业科学院兽医研究所 检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa方法以及试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101968490A (zh) * 2010-08-26 2011-02-09 广东省农业科学院兽医研究所 检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa方法以及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
副猪嗜血杆菌的分离培养和血清型鉴定;蔡旭旺 等;《华中农业大学学报》;20050228;第24卷(第1期);第56页左栏第1.2节 *
福建地区副猪嗜血杆菌的主要生物学特性;车勇良 等;《中国兽医科学》;20121231;第42卷(第12期);摘要，第1.1节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN104498384A (zh) 2015-04-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103031258B (zh) 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物
CN103083655B (zh) 预防和治疗猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌和猪肺炎支原体感染的疫苗组合物及其制备方法
CN102329746B (zh) 猪链球菌、副猪嗜血杆菌病二联灭活疫苗及制备方法
CN104450556A (zh) 一种血清 12 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN102399724B (zh) 一种副猪嗜血杆菌lc株及其应用
CN104450559B (zh) 新的猪肺炎支原体菌株及其疫苗组合物
CN107513510A (zh) 鸭疫里默氏杆菌病弱毒活疫苗及其制备方法
CN102847146A (zh) 一种预防罗非鱼链球菌病的疫苗
CN107513506A (zh) 猪肺炎支原体、疫苗组合物及其应用
CN104450555A (zh) 一种血清 13 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN108018230A (zh) 一种血清7型副猪嗜血杆菌天然弱毒菌株及其应用
CN107964526A (zh) 一株鸭疫里默氏杆菌的减毒突变株及其应用
CN104450557A (zh) 一种血清 5 型副猪嗜血杆菌疫苗株及其应用
CN103602637B (zh) 猪支原体肺炎疫苗株
CN112063561B (zh) 猪链球菌3型疫苗株及其应用
CN104498384B (zh) 一株血清13型副猪嗜血杆菌及其应用
CN106834168A (zh) 一种猪链球菌2型弱毒株及其应用
CN103194412A (zh) 一株血清5型副猪嗜血杆菌疫苗株
CN105754905A (zh) 一种水貂绿脓杆菌及其应用
CN107365720B (zh) 一种具有交叉保护力的血清5型副猪嗜血杆菌及其应用
CN104388340A (zh) 一株血清5型副猪嗜血杆菌及其应用
CN106520601A (zh) 一种猪链球菌2型xd株及应用
CN103623400B (zh) 抗猪支原体肺炎、传染性胸膜肺炎疫苗组合物及制备方法
CN103409374A (zh) 猪圆环病毒病、猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病三联灭活疫苗及制备方法和应用
CN103585622B (zh) 猪支原体肺炎疫苗株的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant