CN111518717A - 一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用 - Google Patents

一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用。蜡样芽孢杆菌SR52保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788 SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)。所述的蜡样芽孢杆菌在制备抗蜡样芽孢杆菌的免疫灭活疫苗中的应用。所得灭活疫苗对蜡样芽孢杆菌感染的免疫保护效率可达75％以上。本发明所得的疫苗制备过程简单、无需提取和纯化并且无安全隐患，一次免疫即可达到高效和长期的免疫保护效果。

Description

一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用
技术领域
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用。
背景技术
深海中蕴含着数量庞大、种类繁多、性质独特的生物资源，具有重要的科研价值和经济价值。随着人类海洋活动的增多，深海致病性微生物将不可避免地被携带到人类的生存环境中，从而威胁近海生物健康和生态安全。初步研究表明，深海微生物中存在着不同种类的致病微生物，而深海微生物所独有的基因及生理生化特征使其异于陆地和近海微生物，从而使得深海微生物病原很可能超出现有的防控措施。
目前，对致病性蜡样芽孢杆菌的防治，尤其是在水产养殖中仍以抗生素和化学药物为主，尚无有效的疫苗。常见报道的鱼类疫苗有灭活疫苗、亚单位疫苗、减毒疫苗等传统疫苗和DNA疫苗等。灭活疫苗安全性好、生产成本低廉，是水产行业最理想的疫苗。
发明内容
本发明目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为
一种蜡样芽孢杆菌，蜡样芽孢杆菌SR52保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788 SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)。
蜡样芽孢杆菌在制备抗蜡样芽孢杆菌的免疫灭活疫苗中的应用。
一种抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗，灭活疫苗抗原为权利要求1所述蜡样芽孢杆菌SR52。
一种制备抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗的方法，包括以下步骤：
(1)培养权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌SR52，得到菌液；
(2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活；
(3)灭活后的菌液与佐剂混合均匀，即得。
步骤(1)中所述培养包括：将所述的蜡样芽孢杆菌SR52接种到2216E平板，在28℃培养至OD600为1.5-2.0得到菌液。
所述步骤(2)中所述灭活剂是甲醛。
所述蜡样芽孢杆菌经0.05％的甲醛28℃灭活24小时，灭活后经PBS洗涤、离心收集菌液。
步骤(3)中，所述的佐剂为弗氏完全佐剂。
所述收集的菌液经PBS重悬，获得终浓度为5.0×109cfu/ml的重悬液，所述重悬液与佐剂按体积比为1:1混合。
所述方法制备得到的制备抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗。
本发明具有如下优点：
1.本发明采用分离自深海的蜡样芽孢杆菌CCTCC M 2019788 SR52制备的灭活疫苗免疫鱼，诱导养殖鱼类产生特异性免疫应答，可增强养殖鱼抵抗蜡样芽孢杆菌感染的能力，提供保护效应。
2.本发明的灭活疫苗，可以使免疫鱼获得抵抗蜡样芽孢杆菌感染的能力，提供交叉保护效应。
3.本发明的蜡样芽孢杆菌灭活疫苗，采用灭活方法制备抗原，有效保留细菌表面抗原，并且具有很好的安全性，不存在环境安全问题。
4.本发明的蜡样芽孢杆菌灭活疫苗，采用常规疫苗制备工艺，通过发酵培养、而后与佐剂混合制备疫苗，所采用的工艺简单、成本较低，可应用于大规模工业化生产。
5.本发明的疫苗接种方式是注射免疫，注射免疫是目前被认为最为有效的鱼用疫苗接种方式，结合成熟的疫苗接种平台，可以方便并有效地使宿主获得免疫保护。
6.本发明蜡样芽孢杆菌灭活疫苗；所提供的疫苗可以是鱼类宿主抵抗蜡样芽孢杆菌引起的疾病，可用于海水、淡水养殖阶段的鱼类，具有高效、安全性好、保护率高的优点，从而弥补目前的产品空白。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“疫苗”意指将病原微生物(如细菌、立克次氏体、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。
术语“佐剂”意指非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
术语“免疫”意指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。
术语“免疫原性”意指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力，即指抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性，也指抗原刺激机体后，机体免疫系统能形成抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫反应。
附图说明
图1为本发明实施例获得SR-52的形态观察图；其中A为扫描电镜观察，B为芽孢染色的普通光学显微镜观察。
图2为本发明实施例获得菌株SR52的系统发育分析图；其中A为16SrDNA基因序列进化树分析，B为rpoB基因序列进化树分析。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
本发明疫苗方法:将培养后的蜡样芽孢杆菌菌株SR52经甲醛灭活24小时，重悬浮于PBS至终浓度为5.0×109cfu/ml，与佐剂混合乳化后为蜡样芽孢杆菌灭活疫苗。所得灭活疫苗对蜡样芽孢杆菌感染的免疫保护效率可达75％以上。本发明所得的疫苗制备过程简单、无需提取和纯化并且无安全隐患，一次免疫即可达到高效和长期的免疫保护效果。
实施例1
蜡样芽孢杆菌的分离获得过程：
蜡样芽孢杆菌SR52分离自2014年4月“科学号”科考船执行“马努斯热液航次”采集的阿尔文虾。分离过程如下：无菌解刨阿尔文虾，将采集到的鳃组织置入无菌的PBS中，使用研磨器研磨后，取100μl组织悬液均匀涂抹在2216E固体培养基平板中，将平板放置在28℃培养箱中培养24小时，根据菌落特征来区分和纯化细菌，将其中一株分离株命名为SR-52。
该菌株的鉴定：
1)形态学鉴定：透射电镜结果显示SR52是杆状细菌，有运动性的周生鞭毛，芽孢染色结果表明SR52能形成椭圆形的内生芽孢，位于细胞的中央(图1)。
2)同源性分析：通过16S rDNA基因序列进化树分析表明，SR52属于蜡样芽孢杆菌群细菌，进一步利用SR52与其他9株蜡样芽孢杆菌群细菌的标准菌株的rpoB基因的632bp序列进行建树分析结果表明，与SR52同源性最近的蜡样芽孢杆菌群细菌是Bacilluswiedmannii FSL W8-0169(图2)。
>SR52 16S rDNA 1513 bP
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTGAGAGCTTGCTCTCAAGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
>SR52 rpoB 632 bP
GCATTACGCAACCTTGACGAGCGCGGTATCATTCGCGTTGGTGCGGAAGTAAAAGATGGAGATTTACTTGTTGGTAAAGTAACACCTAAAGGTGTAACAGAATTAACAGCTGAAGAACGTCTATTACATGCTATCTTTGGAGAAAAAGCACGTGAAGTACGTGATACATCACTACGTGTACCACACGGTGGTGGCGGTATTATCTTAGACGTAAAAGTATTCAACCGTGAAGATGGCGATGAATTGCCACCAGGCGTGAATCAACTTGTACGTGCATATATCGTTCAAAAACGTAAAATCTCTGAAGGTGATAAGATGGCCGGACGTCACGGTAACAAAGGTGTTATCTCTCGTATTTTACCAGAAGAAGATATGCCTTACTTACCAGACGGTACGCCAATCGATATCATGTTAAACCCATTAGGGGTACCATCTCGTATGAATATCGGTCAGGTATTAGAGCTTCATCTTGGTATGGCAGCAAGATACCTTGGTATTCACATTGCAACACCAGTATTCGATGGTGCTCGTGAGGAAGATGTTTGGGGCACGATTGAAGAAGCTGGTATGGCAAATGACGCGAAAACAATCCTGTATGACGGACGTACTGGTGAACCATTCGATAACCGCGT
3)生理生化特征鉴定：SR52生长温度范围为5-40℃，pH耐受范围为5-9.5，生长盐度范围为0-9％的，细菌胞外产物具有溶血活性。
保藏说明
菌种名称：蜡样芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)
菌株编号：SR52
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：武汉大学
保藏日期：2019年10月9日
保藏中心登记入册编号：CCTCC M 2019788
实施例2
蜡样芽孢杆菌灭活疫苗的制备。
步骤1)蜡样芽孢杆菌的灭活。将上述分离获得蜡样芽孢杆菌复苏后接种2216E平板，培养至蜡样芽孢杆菌生长到OD600为1.5左右后，向其中加入终浓度为0.05％的甲醛溶液，28℃灭活36小时，取灭活菌涂布于2216E平板，28℃培养24小时，无细菌生长视为合格。
所述2216E组成成分按重量百分比计：0.5％蛋白胨,0.1％酵母粉,33.4％蒸馏水,66％过滤海水。
步骤2)蜡样芽孢杆菌疫苗混合液及对照液的制备。将甲醛灭活后的蜡样芽孢杆菌经PBS清洗3次，用PBS重悬调整细菌悬液终浓度为5.0×109cfu/ml。取菌液与弗氏完全佐剂按照体积比1:1比例混合乳化后即为疫苗混合液；同时以PBS与佐剂按照1:1比例混合乳化，即为对照液。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为水。
实施例3
蜡样芽孢杆菌灭活疫苗的免疫应用。
步骤1)疫苗的注射免疫。将80条大菱鲆(每条重约16±2.5g)随机分为2组，每组40条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼腹腔注射100ul上述实施例2步骤3)的蜡样芽孢杆菌疫苗混合液，将B组的每条鱼腹腔注射100ul上述实施例2步骤3)的对照液。
步骤2)攻毒用蜡样芽孢杆菌悬液的制备。挑取上述分离获得蜡样芽孢杆菌单菌落接种于2216E液体培养基中，培养至OD600为0.8，然后离心(5000g，40C)5min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为5x106cfu/ml。
步骤3)疫苗免疫保护效应检测。在步骤1)免疫注射后的第30天，用上述步骤2)的蜡样芽孢杆菌悬液肌肉注射步骤1)的2组鱼，每条鱼的注射量为100ul。在以后的15天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。15天后，统计各组鱼的死亡率：A组，20％；B组，85％。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)：
RPS＝100×(1－免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)
根据此公式算出蜡样芽孢杆菌灭活疫苗的相对免疫保护效率为76.5％。因此，蜡样芽孢杆菌灭活疫苗能够有效保护大菱鲆抵御蜡样芽孢杆菌的侵染。
序列表
<110> 中国科学院海洋研究所
<120> 一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1513
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60
gaatggattg agagcttgct ctcaagaagt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120
aacctgccca taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg ataacatttt 180
gaactgcatg gttcgaaatt gaaaggcggc ttcggctgtc acttatggat ggacccgcgt 240
cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag 300
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggct 420
ttcgggtcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtgc tagttgaata agctggcacc 480
ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggtgg tttcttaagt 600
ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactggga gacttgagtg 660
cagaagagga aagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagagata tggaggaaca 720
ccagtggcga aggcgacttt ctggtctgta actgacactg aggcgcgaaa gcgtggggag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttagag 840
ggtttccgcc ctttagtgct gaagttaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggcc 900
gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgaaaa ccctagagat 1020
agggcttctc cttcgggagc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccatcattaa 1140
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacggta caaagagctg 1260
caagaccgcg aggtggagct aatctcataa aaccgttctc agttcggatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtggggtaac ctttatggag ccagccgcct aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacaaggta gcc 1513
<210> 2
<211> 632
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcattacgca accttgacga gcgcggtatc attcgcgttg gtgcggaagt aaaagatgga 60
gatttacttg ttggtaaagt aacacctaaa ggtgtaacag aattaacagc tgaagaacgt 120
ctattacatg ctatctttgg agaaaaagca cgtgaagtac gtgatacatc actacgtgta 180
ccacacggtg gtggcggtat tatcttagac gtaaaagtat tcaaccgtga agatggcgat 240
gaattgccac caggcgtgaa tcaacttgta cgtgcatata tcgttcaaaa acgtaaaatc 300
tctgaaggtg ataagatggc cggacgtcac ggtaacaaag gtgttatctc tcgtatttta 360
ccagaagaag atatgcctta cttaccagac ggtacgccaa tcgatatcat gttaaaccca 420
ttaggggtac catctcgtat gaatatcggt caggtattag agcttcatct tggtatggca 480
gcaagatacc ttggtattca cattgcaaca ccagtattcg atggtgctcg tgaggaagat 540
gtttggggca cgattgaaga agctggtatg gcaaatgacg cgaaaacaat cctgtatgac 600
ggacgtactg gtgaaccatt cgataaccgc gt 632

Claims (10)

1.一种蜡样芽孢杆菌，其特征在于：蜡样芽孢杆菌SR52保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)。
2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在制备抗蜡样芽孢杆菌的免疫灭活疫苗中的应用。
3.一种抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗，其特征在于：灭活疫苗抗原为权利要求1所述蜡样芽孢杆菌SR52。
4.一种制备抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌SR52，得到菌液；
(2)向菌液中加入灭活剂，将菌液灭活；
(3)灭活后的菌液与佐剂混合均匀，即得。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述培养包括：将权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌SR52接种到2216E平板，在28℃培养至OD600为1.5-2.0得到菌液。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述灭活剂是甲醛。
7.按照权利要求4或6所述的方法，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌经0.05％的甲醛28℃灭活24小时，灭活后经PBS洗涤、离心收集菌液。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述的佐剂为弗氏完全佐剂。
9.按照权利要求7所述的方法，其特征在于：所述收集的菌液经PBS重悬，获得终浓度为5.0×109cfu/ml的重悬液，所述重悬液与佐剂按体积比为1:1混合。
10.由权利要求4～9任一项方法制备得到的制备抗蜡样芽孢杆菌的灭活疫苗。
CN202010324495.9A 2020-04-23 2020-04-23 一种蜡样芽孢杆菌及其灭活疫苗和应用 Pending CN111518717A (zh)

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