CN113215017A - 一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物学领域，具体的说是一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法。将培养后的蜡样芽孢杆菌菌株Bacillus wiedmannii SR52的芽孢重悬而后灭菌后于保护液混合，混合后分装进行冻干处理；其中，保护液含麦芽糖和脱脂乳。所得芽孢杆菌冻干粉复苏率可达80％以上。本发明所得的芽孢杆菌冻干粉制备过程简单、成本低，无需特殊试剂，制备后可在4℃长期保存。

Description

一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法
技术领域
本发明涉及微生物学领域，具体的说是一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法。
背景技术
芽孢杆菌(Bacillus)在广泛分布于上至平流层下到深部地下的几乎每一个环境中，这种普遍分布性重要归因于其能够形成复原性的芽孢，芽孢具有耐热、耐寒等能力，能帮助它们在各种极端环境下生存下来。芽孢杆菌属成员种类繁多，已报道的就有200多个不同的种。大多数芽孢杆菌被用于生物技术开发和工业应用，少数物种被确定为致病菌，能在动物和人类中引起疾病。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是芽孢杆菌属的重要成员，菌体呈杆状，广泛分布于土壤、水、空气、饲料和食品等环境。蜡状芽胞杆菌可产生抗菌物质，可被作为益生菌添加到食品和饲料中，可以用来抑制有害微生物的繁殖，改善生态环境和抑制植物病害等；部分蜡样芽胞杆菌具有较强的致病性，误食后能引起人畜肠道疾病，导致腹泻型或呕吐型食物中毒，还能导致中华鳖和罗非鱼等水生动物的死亡。因此，蜡样芽孢杆菌逐渐成为研究的热门课题。然而，由于长期保存较困难，且变异几率较大，故蜡样芽孢杆菌的保藏成为该菌研究过程中的重要环节。
真空冷冻干燥技术是较为理想的一种菌种保藏方法，然而真空冷冻干燥过程中由于温度和压力的急剧变化，会导致菌体细胞损伤甚至死亡。研究表明，冻干保护剂是影响细菌冻干存活率最为重要的因素。不同菌株所需要的最佳保护剂与冻干条件也不尽相同，优化保护剂配方与冻干条件是提高冻干菌体存活率的关键途径，只有选择合适有效的保护剂，优化冻干过程中时间、温度、压力等各种条件才能有效的保护菌株的生物活性特征，从而减轻冷冻干燥过程中对菌体的损伤。因此，为最大程度的保存蜡样芽胞杆菌的生物活性，为以后在生产实际与科研活动中提供有效的菌株进而需要提供一种合适的保藏方法。
发明内容
本发明目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法，将培养后的蜡样芽孢杆菌菌株Bacilluswiedmannii SR52的芽孢重悬而后灭菌后于保护液混合，混合后分装进行冻干处理；其中，保护液含麦芽糖和脱脂乳。
所述保护液按重量百分比计20％麦芽糖、10％脱脂乳，余量为水。
所述冻干处理为首先在4℃冷冻1h，在-20℃冷冻1h，再-80℃冷冻2h，而后于冻干机冻中冻干处理24h，最后于4℃储存。
所述冻干机冻中冻干条件为：真空度0.1mbar，隔板温度-25℃，冷阱温度-55℃，冻干时间24h。
所述蜡样芽孢杆菌菌株为蜡样芽孢杆菌SR52；其保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus wiedmannii)。
所述蜡样芽孢杆菌菌株于28℃经2216E培养基培养至OD600约为1.5，加入终浓度5mg/L的硫酸锰继续培养48小时，80℃水浴处理20min杀死非芽孢细菌，待用。
所述芽孢状态的蜡样芽胞杆菌培养并水浴处理后经PBS洗涤，再悬浮于PBS至终浓度为2.0×109cfu/ml，与冻干保护液按体积比1:1混合。
所述冻干后于4℃储存；菌株复苏时，加入1ml 2216E培养基，取适量涂布2216E固体平板，28℃培养。
本发明具有如下优点：
本发明以从深海热液中分离到的一株蜡样芽孢杆菌为对象，通过条件优化和选择进而实现对菌株的长期保藏，采用本发明方法减少了菌体在冷冻干燥过程中的死亡率，最大限度的发挥了保护剂的保护功能，为蜡样芽孢杆菌高效冻干粉的研究提供了依据。进一步说：通过对芽孢诱导条件(时间、菌液浓度、硫酸锰浓度等)的优化，获得了芽孢含量占总菌量90％以上的菌体；通过对冻干保护剂的选择与浓度配比，获得了最佳配比的冻干剂；通过对冻干前菌液的处理(不同温度及其存放时间的选择)，提高了冻干菌复苏率；通过对冻干机冻干参数的优化，提高了冻干菌的复苏率。
1.本发明通过对冻干条件的优化，显著降低了冻干过程对菌体的损伤，4℃储存1年后菌株复苏存活率可达80％以上；
2.本发明所得的芽孢杆菌冻干粉制备过程简单、成本低，无需特殊试剂，制备后可在4℃长期保存。
3.本发明采用芽孢形式进行冻存，即使在储存或者运输过程中遇到高温等恶劣环境，仍能保持部分菌株的活力，避免了保存不当导致的菌株丢失。
附图说明
图1为本发明实施例提供的芽孢杆菌芽孢染色结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
实施例1
蜡样芽孢杆菌冻干粉保护剂的选择：
所述蜡样芽孢杆菌SR52保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)
步骤1)蜡样芽孢杆菌的增殖培养。将蜡样芽孢杆菌复苏后接种2216E平板，挑取单菌落继续传代2次，挑取单菌落行革兰染色镜检观察其形态及染色性初步验证菌株，进一步通过PCR对该菌的16S rDNA进行测序鉴定。经鉴定正确的菌种接种于5ml液体2216E培养基，28℃培养，待细菌增殖到OD600为0.8-1后，按照1:100(v/v)转接于500ml 2216E培养基，28℃继续培养。
所述2216E组成成分按重量百分比计：0.5％蛋白胨,0.1％酵母粉,33.4％蒸馏水,66％过滤海水。
步骤2)蜡样芽孢杆菌芽孢的制备。当上述培养蜡样芽孢杆菌生长到OD600为1.5左右后，向其中加入终浓度为5mg/L的硫酸锰，28℃继续培养48小时，芽孢染色观察，芽孢含量占总菌量90％以上时视为合格(图1)。
由图1可见视野中芽孢状态细菌(蓝色)占总菌量的90％以上。
步骤3)蜡样芽孢杆菌冻干前处理。将制备的蜡样芽胞杆菌芽孢经80℃水浴处理20min杀死非芽孢细菌，处理后经PBS清洗3次，清洗后经PBS进行重悬，调整细菌悬液终浓度为2.0×109cfu/ml；配制不同的冻干保护液，经110℃灭菌20min；将上述细菌悬液与不同的冻干保护液按照1:1(v/v)进行混合，取混合液，用2216E稀释至2.0×106、2.0×107、2.0×108倍后分别取100μl涂布2216E平板，每种稀释度各涂布3个平板，28℃培养12小时，精确计算活菌数。
步骤4)蜡样芽孢杆菌冻干与复苏。将步骤3)中的混合液加入西林瓶中(2ml/瓶)，进行冻干操作(冻干操作与实施例3步骤4一致)，冻干后对不同保护剂的冻干粉进行复苏，涂布2216E平板，计算活菌数。按照下面公式计算复苏率：复苏率＝(复苏后菌落数×稀释倍数×10/冻干前活菌数)×100％。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为双蒸水。
不同的冻干保护液中冻干保护剂分别为脱脂乳、蔗糖、乳糖或麦芽糖；
每种冻干保护液按重量百分比计：20％保护剂，余量为双蒸水。
根据复苏率算出蜡样芽孢杆菌利用脱脂乳、蔗糖、乳糖和麦芽糖4种保护剂冻干后其复苏率分别为73.2％、12.3％、41.4％和81.8％。
实施例2
根据上述实施例1记载选择进一步对蜡样芽孢杆菌冻干保护剂的选择进行优化：
步骤1)蜡样芽孢杆菌的增殖培养。将蜡样芽孢杆菌复苏后接种2216E平板，挑取单菌落继续传代2次，挑取单菌落行革兰染色镜检观察其形态及染色性初步验证菌株，进一步通过PCR对该菌的16S rDNA进行测序鉴定。经鉴定正确的菌种接种于5ml液体2216E培养基，28℃培养，待细菌增殖到OD600为0.8-1后，按照1:100(v/v)转接于500ml 2216E培养基，28℃继续培养。
所述2216E组成成分按重量百分比计：0.5％蛋白胨,0.1％酵母粉,33.4％蒸馏水,66％过滤海水。
步骤2)蜡样芽孢杆菌芽孢的制备。当上述培养蜡样芽孢杆菌生长到OD600为1.5左右后，向其中加入终浓度为5mg/L的硫酸锰，28℃继续培养48小时，芽孢染色观察，芽孢含量占总菌量90％以上时视为合格(图1)。
由图1可见视野中芽孢状态细菌(蓝色)占总菌量的90％以上。
步骤3)蜡样芽孢杆菌冻干前处理。将制备的蜡样芽胞杆菌芽孢经80℃水浴处理20min杀死非芽孢细菌，处理后经PBS清洗3次，清洗后经PBS进行重悬，调整细菌悬液终浓度为2.0×109cfu/ml；配制不同的冻干保护液，经110℃灭菌20min；将上述细菌悬液与不同的冻干保护液按照1:1(v/v)进行混合，取混合液，用2216E稀释至2.0×106、2.0×107、2.0×108倍后分别取100μl涂布2216E平板，每种稀释度各涂布3个平板，28℃培养12小时，精确计算活菌数。
步骤4)蜡样芽孢杆菌冻干与复苏。将步骤3)中的混合液加入西林瓶中(2ml/瓶)，进行冻干操作(冻干操作与实施例3步骤4一致)，冻干后对不同保护剂的冻干粉进行复苏，涂布2216E平板，计算活菌数。按照下面公式计算复苏率：复苏率＝(复苏后菌落数×稀释倍数×10/冻干前活菌数)×100％。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％NaCl,0.02％KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％NaH2PO4，余量为双蒸水。
不同的冻干保护液中冻干保护剂分别a.20％麦芽糖+20％脱脂乳,b.20％麦芽糖+10％脱脂乳，c.10％麦芽糖+10％脱脂乳，d.10％麦芽糖+20％脱脂乳。
每种冻干保护液按重量百分比计：保护剂，余量为双蒸水。
根据复苏率算出蜡样芽孢杆菌利用a、b、c、d四种保护剂组合冻干后其复苏率分别为78.0％、90.4％、61.5％和83.5％。据此，选取20％麦芽糖+10％脱脂乳这一组合进行蜡样芽孢杆菌冻干粉的制备。
实施例3
蜡样芽孢杆菌冻干粉的制备。
所述蜡样芽孢杆菌SR52保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)
步骤1)蜡样芽孢杆菌的增殖培养。将蜡样芽孢杆菌复苏后接种2216E平板，挑取单菌落继续传代2次，挑取单菌落行革兰染色镜检观察其形态及染色性初步验证菌株，进一步通过PCR对该菌的16S rDNA进行测序鉴定。经鉴定正确的菌种接种于5ml液体2216E培养基，28℃培养，待细菌增殖到OD600为0.8-1后，按照1:100(v/v)转接于500ml 2216E培养基，28℃继续培养。
所述2216E组成成分按重量百分比计：0.5％蛋白胨,0.1％酵母粉,33.4％蒸馏水,66％过滤海水。
步骤2)蜡样芽孢杆菌芽孢的制备。当上述培养蜡样芽孢杆菌生长到OD600为1.5左右后，向其中加入终浓度为5mg/L的硫酸锰，28℃继续培养48小时，芽孢染色观察，芽孢含量占总菌量90％以上时视为合格(图1)。
由图1可见视野中芽孢状态细菌(蓝色)占总菌量的90％以上。
步骤3)蜡样芽孢杆菌冻干前处理。将制备的蜡样芽胞杆菌芽孢经80℃水浴处理20min杀死非芽孢细菌，处理后经PBS清洗3次，清洗后经PBS进行重悬，调整细菌悬液终浓度为2.0×109cfu/ml；配制冻干保护液，保护液为乳糖溶液，经110℃灭菌20min；将上述细菌悬液与冻干保护液按照1:1(v/v)进行混合，用2216E稀释至2.0×106、2.0×107、2.0×108倍后分别取100μl涂布2216E平板，按照常规方式计算冻干前活菌数为8.5×108。
所述PBS组成成分按重量百分比计：0.8％ NaCl,0.02％ KCl,0.358％Na2HPO4.12H2O,0.024％ NaH2PO4，余量为双蒸水。
所述冻干保护液中冻干保护剂为20％麦芽糖+10％脱脂乳。
所述冻干保护液配制按重量百分比计：保护剂，余量为双蒸水。
步骤4)蜡样芽孢杆菌冻干粉制备。西林瓶和塞入脱脂棉的橡胶塞121℃灭菌20min，将上述步骤3)制备的细菌与冻干保护液加入西林瓶中(2ml/瓶)，吹打均匀，半盖瓶塞，留出水分挥发空间，冻干流程为4℃1h，-20℃1h，-80℃2h，冻干机冻干24h，即为蜡样芽胞杆菌冻干粉。所述冻干机冻干条件为：真空度0.1mbar，隔板温度-25℃，冷阱温度-55℃，冻干时间24h。
实施例4
蜡样芽孢杆菌冻干粉的储存与复苏。
步骤1)蜡样芽孢杆菌冻干粉的储存。将上述实施例3步骤4中所制备的蜡样芽孢杆菌冻干粉的西林瓶盖紧瓶盖，封口膜封口后放置于4℃储存。
步骤2)蜡样芽孢杆菌的复苏。在储存后的1、2、4、8、12月取蜡样芽孢杆菌冻干粉，加入2ml 2216E培养基进行重悬，加入2ml 2216E培养基进行重悬，分别稀释至2.0×106、2.0×107、2.0×108倍后，分别取100μl涂布2216E固体平板，每种稀释度各涂布3个平板，于28℃培养24小时。按照下面公式计算复苏率：复苏率＝(复苏后菌落数×稀释倍数×10/冻干前活菌数)×100％。
上述稀释后不同月份活菌数依次为7.5×108，7.8×108，7.4×108，7.3×108，7.1×108
经计算得出蜡样芽孢杆菌冻干粉储存后不同时间的复苏率分别为88.6％、91.8％、86.7％、85.46％和83.1％。因此，蜡样芽孢杆菌冻干粉可在4℃长期保藏，复苏率可达80％以上。

Claims (7)

1.一种蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：将培养后的蜡样芽孢杆菌菌株Bacillus wiedmannii SR52的芽孢重悬而后灭菌后于保护液混合，混合后分装进行冻干处理；其中，保护液含麦芽糖和脱脂乳。
2.按权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述保护液按重量百分比计20％麦芽糖、10％脱脂乳，余量为水。
3.按权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述冻干处理为首先在4℃冷冻1h，在-20℃冷冻1h，再-80℃冷冻2h，而后于冻干机冻中冻干24h，最后于4℃储存。
4.按权利要求1-3中任意一项所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌菌株为蜡样芽孢杆菌SR52；其保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为：CCTCC M 2019788SR52，保藏日期2019.10.09，分类命名为蜡样芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)。
5.按权利要求4所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述蜡样芽孢杆菌菌株于28℃经2216E培养基培养至OD600约为1.5，加入终浓度5mg/L的硫酸锰继续培养48小时，80℃水浴处理20min杀死非芽孢细菌，待用。
6.按权利要求1或5所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述芽孢状态的蜡样芽胞杆菌培养并水浴处理后经PBS洗涤，再悬浮于PBS至终浓度为2.0×109cfu/ml，与冻干保护液按体积比1:1混合。
7.按权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌的保藏方法，其特征在于：所述冻干后于4℃储存；菌株复苏时，加入1ml 2216E培养基，取适量涂布2216E固体平板，28℃培养。
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